Etablissement d’un hépatocarcinome chez des souris BALB/c-nu et étude de l’effet thérapeutique de la formule de Sanleng Jiashen

Résumé

Ici, nous présentons le protocole étape par étape pour étudier les effets inhibiteurs thérapeutiques et vasculaires de la formule de Sanleng Jiashen sur des souris BALB/c-nu atteintes d’un carcinome hépatocellulaire orthotopique.

Résumé

La létalité du cancer du foie et la résistance aux médicaments chimiques ont forcé la recherche de prescriptions efficaces de plantes traditionnelles pour le cancer du foie. Des modèles animaux reproductibles, faciles à manipuler et imitant fortement les processus physiopathologiques du cancer du foie sont la condition préalable à la réussite du criblage de candidats médicaments efficaces. Parallèlement, des indicateurs et des moyens fiables d’évaluation de l’efficacité des médicaments sont également la garantie de la recherche et du développement de médicaments anti-cancer du foie.

Formule Sanleng Jiashen, une prescription représentative de la médecine traditionnelle chinoise contenant Sparganium stoloni erum, Buch. -Jambon. (Sanleng), Panax ginseng C. A. Mey. (ginseng), Rheum officinale Baill. (rhubarbe), et Ligusticum chuanxiong Hort. (Chuanxiong), est prescrit pour nourrir le foie et évacuer la chaleur, éliminer les toxines et favoriser la circulation sanguine pour traiter le cancer du foie. Ce protocole expérimental décrit la préparation de la formule lyophilisée de Sanleng Jiashen et le processus d’établissement du cancer du foie in situ chez les souris BALB/c-nu. La coloration histopathologique, la détection immunohistochimique de marqueurs cancéreux, l’imagerie in vivo de souris et le test de membrane chorioallantoïde de l’embryon de poulet ont été utilisés pour explorer l’inhibition et l’effet anti-angiogenèse de la formule de Sanleng Jiashen sur la prolifération maligne des tissus cancéreux du foie. Les données montrent que la formule de Sanleng Jiashen peut résister efficacement à la prolifération maligne du tissu cancéreux du foie, qui se manifeste par une réduction du volume de la masse tumorale, une amélioration des dommages pathologiques et des niveaux plus faibles du marqueur de cancer ki67.

L’inhibition supérieure de l’angiogenèse suggère également que la formule de Sanleng Jiashen pourrait avoir le potentiel de traiter et de prévenir la progression et la détérioration du cancer du foie. L’ensemble du schéma expérimental montre un processus complet de composants de la médecine traditionnelle chinoise dans le traitement du cancer du foie de la souris, qui fournit une référence pour l’établissement et l’optimisation d’un modèle de cancer du foie, ainsi que pour la recherche et le développement de médicaments pour prévenir et traiter le cancer du foie.

Introduction

Le cancer du foie est un cancer mortel qui prend naissance dans le foie et qui est la deuxième cause la plus fréquente de décès liés au cancer dans le monde¹. Les taux de maladies du foie aux États-Unis et dans certains pays en développement affichent des niveaux élevés, et il pourrait y avoir plus d’un million de cas de cancer du foie dans le monde d’ici 2030². En raison d’habitudes de vie malsaines telles que le tabagisme, l’obésité et la consommation d’alcool, et des ravages de l’hépatite B, de l’hépatite C et d’autres virus, l’incidence et la mortalité du cancer du foie ont considérablement augmenté d’année en année³. En tant que tumeur maligne hétérogène avec différentes caractéristiques histologiques et un mauvais pronostic, le cancer du foie a une très large gamme d’incidence, y compris le carcinome hépatocellulaire, le cholangiocarcinome intrahépatique et le cancer du foie fibrolamellaire⁴. Le cancer du foie est souvent diagnostiqué à un stade avancé, et de nombreux patients avancés ne sont pas candidats à la radiothérapie⁵. L’inhibiteur de la multikinase sorafénib est un médicament très accepté pour les patients atteints d’un cancer du foie avancé, mais les patients développent souvent une résistance significative dans un court laps de temps⁶. À l’heure actuelle, les inhibiteurs de point de contrôle immunitaire-1 et-L1 combinés au sorafénib ont fait des progrès dans le contrôle du développement du cancer du foie, mais l’effet thérapeutique est encore controversé⁷.

Le cancer orthotopique du foie est un type précoce de cancer du foie : les cellules cancéreuses ne se sont pas propagées dans le tissu hépatique ou ne se sont pas produites de métastases interorganes, et la fonction du foie n’est pas grandement affectée⁸. Étant donné que le cancer du foie orthotopique n’apparaît généralement pas comme des symptômes d’inconfort évidents, certains patients peuvent présenter de légères douleurs hépatiques, de la fatigue et d’autres symptômes⁹. Dans la pratique clinique, l’échographie Doppler couleur du foie et l’examen par tomodensitométrie amélioré peuvent diagnostiquer des lésions importantes occupant de l’espace dans le foie¹⁰. Bien que le cancer du foie local qui ne s’est pas propagé et qui n’a pas métastasé puisse être enlevé par chirurgie, il existe certains risques chirurgicaux et un fardeau psychologique inévitable pour les patients¹¹. La chimioradiothérapie peut tuer tout ou partie des cellules cancéreuses du foie, et l’immunosuppression à long terme chez les patients prenant des médicaments peut affecter l’efficacité du traitement et augmenter le risque d’autres maladies¹². Par conséquent, la recherche d’un traitement médicamenteux sûr et efficace pour la prévention et le traitement précoces du cancer du foie est la clé pour freiner la progression et la détérioration du cancer du foie.

Le principe de la médecine chinoise dans le traitement du cancer du foie est basé sur le concept d’équilibre et d’harmonie au sein du corps. La médecine chinoise considère le cancer du foie comme un déséquilibre ou une dysharmonie de l’énergie du corps, connu sous le nom de Qi, qui affecte le foie^. Le traitement du cancer du foie en médecine chinoise implique diverses approches, notamment la phytothérapie, l’acupuncture, la thérapie diététique et les recommandations de mode de vie. Le principe est de rétablir l’équilibre du Qi, de renforcer les mécanismes de défense de l’organisme et de favoriser la capacité du corps à se guérir lui-même^14,15. Le cancer du foie dans la médecine traditionnelle chinoise appartient à la catégorie des « tympanites » et de « l’accumulation hépatique ». Dès que le « Canon intérieur de Huangdi » a un enregistrement détaillé de ses symptômes, le cancer du foie est causé par la stase sanguine et le déficit de Zhengqi et est traité en supprimant la stase sanguine, en éliminant les tympanites et en renforçant la résistance du corps pour consolider la constitution¹³. La pilule Sanleng est tirée du livre « Weisheng Baojian » écrit par Luo Tianyi, un célèbre médecin de la dynastie Yuan. Il est composé de trois types de médicaments : Sparganium stoloni erum, Buch. -Jambon. (Sanleng), Ligusticum chuanxiong Hort. (Chuanxiong), et Rheum officinale Baill. (rhubarbe). Ces trois types de médicaments peuvent pénétrer dans le méridien du foie et avoir une valeur thérapeutique pour le traitement du cancer du foie¹⁴. La formule de Sanleng Jiashen est composée de 16 g de Sanleng, 16 g de Panax ginseng C.A.Mey. (ginseng), 8 g de rhubarbe et 2 g de Chuanxiong (Figure 1), qui sont prescrits pour tonifier le foie, dissiper la chaleur, éliminer les toxines et favoriser la circulation sanguine. On pense que ces herbes ont des propriétés anticancéreuses et aident à réduire la croissance tumorale, à soulager les symptômes et à améliorer le bien-être général. Dans les expériences in vitro précédentes, la formule de Sanleng Jiashen peut inhiber la prolifération des cellules cancéreuses du foie¹⁵. Cependant, comment évaluer l’effet inhibiteur des composés à base de plantes chinoises sur le cancer du foie de manière efficace et raisonnable ? En établissant un modèle de cancer du foie in situ chez la souris BALB/c-nu, l’effet inhibiteur de la formule de Sanleng Jiashen sur le cancer du foie et l’angiogenèse a été étudié principalement par imagerie vivante de petits animaux et test de membrane chorioallantoïde d’embryon de poulet.

Protocole

Des souris nues mâles BALB/c-nu exemptes d’agents pathogènes spécifiques, âgées de 5 semaines et pesant de 18 à 22 g ont été nourries au Centre expérimental animal de transformation de la faculté de médecine de l’Université de Jilin ; les conditions d’alimentation étaient de 22 °C à 24 °C avec une humidité relative de 40 % à 60 %. Le numéro d’autorisation d’animal d’expérimentation est SYXK(Ji) 2018-0006, et le processus expérimental est conforme aux règles et règlements du Comité d’éthique de l’Université de Jilin, et le numéro d’approbation d’éthique animale est 20221228-01.

1. Préparation de la formule 15 de Sanleng Jiashen lyophilisée

1. Placez 16 g de Sanleng, 16 g de ginseng, 8 g de rhubarbe et 2 g de Chuanxiong dans une casserole de décoction intelligente (voir le tableau des matières) et trempez-les dans 294 ml d’eau déminéralisée à température ambiante pendant 30 min. Après avoir chauffé et bouilli, poursuivez la cuisson pendant 30 min à 100 °C et filtrez le liquide à travers une double gaze médicale (voir tableau des matériaux). Ajouter 252 mL d’eau déminéralisée au résidu, cuire 30 min à 100 °C et filtrer le liquide avec une double gaze.
2. Prélever le filtrat de l’étape 1.1 dans un plat en acier inoxydable propre et le congeler pendant 12 h à -80 °C (voir tableau des matériaux).
3. Placez la formule de Sanleng Jiashen de l’étape 1.2 dans un lyophilisateur sous vide (voir tableau des matériaux) (température du piège à froid : -55 °C) et faites sécher pendant 48 h pour obtenir la poudre lyophilisée de la formule de Sanleng Jiashen.

2. Construction de la lignée cellulaire HCCLM3 exprimant la luciférase de manière stable¹⁶

1. Ajouter 1,0 mL de suspension cellulaire HCCLM3 dans la plaque à 24 puits (voir le tableau des matériaux) avec 5 × 10⁵ cellules/puits et cultiver dans un milieu complet (10 % de sérum fœtal de bovin + 1 % de solution de pénicilline-streptomycine + DMEM) (voir le tableau des matériaux) contenant 3 μg/mL de puromycine pendant 72 h dans un incubateur cellulaire (37 °C, 5 % de CO₂, voir la table des matériaux).
2. Jeter le surnageant cellulaire à l’étape 2.1 et ajouter 100 μL de solution de trypsine à 0,25 % pour digérer les cellules dans un incubateur cellulaire pendant 1 min (voir le tableau des matériaux). Ajouter 300 μL de milieu complet et utiliser une pipette pour libérer les cellules adhérentes et terminer la digestion. Prélever toutes les suspensions cellulaires et les placer dans un tube à centrifuger de 15 mL à température ambiante à 1 000 × g pendant 5 min. Après avoir jeté le surnageant, ajouter 1 mL de milieu complet et mélanger par pipetage.
3. Ajouter 100 μL de suspension cellulaire de 4 ×^{10 3} cellules HCCLM3/puits de l’étape 2.2 dans une plaque à 96 puits et cultiver dans un incubateur cellulaire pendant 24 h (37 °C, 5 % de CO₂, voir le tableau des matériaux).
4. Ajouter 0,27 μL de lentivirus GFP dans les plaques à 96 puits à l’étape 2.3 et cultiver dans un incubateur cellulaire pendant 15 h (37 °C, 5 % de CO₂, voir le tableau des matières). Jetez le surnageant cellulaire, ajoutez 100 μL de milieu de culture complet et obtenez des images à l’aide d’un microscope à fluorescence à la longueur d’onde d’excitation de 488 nm et à la longueur d’onde d’émission de 507 nm (voir le tableau des matériaux).
5. Remplacer 2 mL de lentivirus GFP et poursuivre la culture pendant 24 h. Remplacer 2 mL de milieu de culture complet sans lentivirus GFP pendant 24 heures supplémentaires.
   REMARQUE : L’efficacité de transfection du lentivirus GFP dans les cellules HCCLM3 était de 80 %, comme on l’a vu au microscope à fluorescence inversée.
6. Ajouter 5 ml de suspension de² × 10 5 cellules de l’étape 2.1 dans une boîte de Pétri de 60 mm et cultiver dans un incubateur cellulaire pendant 24 h. Ajouter 64,5 μL de luciférase et poursuivre la culture dans un incubateur cellulaire pendant 15 h (37 °C, 5 % de CO₂, voir le tableau des matériaux).
7. Jeter le surnageant et ajouter 5 mL de milieu complet pour poursuivre la culture jusqu’à ce que les cellules soient devenues confluentes à 90 % dans la boîte de Pétri. Jeter le surnageant cellulaire, laver avec 2 x 1 mL de PBS et ajouter 1 mL de solution de trypsine à 0,25 % pour digérer les cellules dans un incubateur cellulaire pendant 1 min (37 °C, 5 % CO₂, voir le tableau des matériaux). Ajouter 3 ml de milieu complet et pipeter de haut en bas jusqu’à libérer les cellules adhérentes et terminer la digestion. Prélever toutes les suspensions cellulaires pour l’injection ultérieure chez la souris.
   REMARQUE : Pour obtenir un nombre suffisant de cellules, les cellules ont été continuellement passées et cultivées.

3. Mise en place d’un modèle de souris nues BALB/c-nu du cancer du foie in situ et de son traitement¹⁵

1. Ajouter 100 μL de 1 × 10^cellules 7 HCCLM3 transfectées avec de la luciférase à l’étape 2.7 et 100 μL de colle matricielle (voir le tableau des matériaux) dans un tube à centrifuger de 1,5 mL (voir le tableau des matériaux), et mélanger légèrement avec une pipette de 1 mL (voir le tableau des matériaux).
   REMARQUE : L’ensemble du processus de préparation de la solution doit être effectué sur de la glace pour éviter que la colle matricielle ne durcisse.
2. Désinfectez les aisselles gauche et droite des souris nues BALB/c-nu avec de l’iodopine (voir le tableau des matériaux) et déiodez avec de l’alcool (voir le tableau des matériaux).
3. Injectez lentement 100 μL du mélange de cellules HCCLM3 et de colle matricielle de l’étape 3.1 dans les aisselles gauche et droite des souris nues BALB/c-nu à l’aide d’une seringue jetable de 1 ml.
   REMARQUE : Après environ 10 jours, les souris nude BALB/c-nu ont développé une masse tumorale d’environ 0,5 cm³ au site d’injection bilatérale sous l’aisselle.
4. Anesthésier les souris nues BALB/c-nu à l’étape 3.3 par injection intrapéritonéale de 1 %, 50 mg/kg de pentobarbital sodique. Coupez la peau des deux aisselles avec des ciseaux ophtalmiques et une pince à épiler (voir Tableau des matériaux), et pelez doucement la masse tumorale sous-cutanée pour la placer dans une boîte de culture cellulaire (voir Tableau des matériaux) contenant un tampon PBS pré-refroidi (voir Tableau des matériaux), et coupez-la en³ morceaux de 1 mm avec un scalpel (voir Tableau des matériaux).
   REMARQUE : La masse tumorale sous les aisselles des souris nues BALB/c-nu doit être récoltée sur de la glace dans les 0,5 h pour maintenir l’activité des cellules tumorales et augmenter le taux de réussite du modèle. À la fin de l’échantillonnage, les souris ont été tuées par l’ablation des vertèbres cervicales. S’il y a une partie nécrotique de la tumeur, elle doit être retirée, ne laissant que la tumeur blanche de poisson pour prévenir l’infection lors de la greffe de cancer orthotopique.
5. Anesthésier les souris nues BALB/c-nu avec 1 %, 50 mg/kg de pentobarbital sodique par voie intrapéritonéale (voir le tableau des matériaux), désinfecter l’abdomen avec de l’iode (voir le tableau des matériaux) et déioder avec de l’alcool (voir le tableau des matériaux).
6. À l’aide d’un ciseau ophtalmique et d’une pince à épiler (voir le tableau des matériaux), coupez une incision chirurgicale à 45° d’environ 1 cm à 0,5 cm sous l’apophyse xiphoïde pour exposer le foie, appuyez doucement sur le foie pour extraire le tissu hépatique et fixez le foie avec du papier pesé.
   REMARQUE : Des cotons-tiges ou des bâtonnets peuvent être placés sous les côtes des souris pour exposer efficacement le foie.
7. Prenez un petit morceau de tissu tumoral à l’étape 3.4 avec une aiguille d’injection jetable de 10 ml, et implantez la masse tumorale dans le foie à environ 0,5 cm parallèle au foie pour la fixer sous la capsule hépatique et retirez lentement l’aiguille.
   REMARQUE : Utilisez une seringue jetable de 1 ml pour déposer 2 gouttes de colle matricielle fondue, observez la masse tumorale sans aucune glissade accidentelle et sans saignement, puis suturez l’incision chirurgicale.
8. Fermez l’incision chirurgicale à l’aide d’une pince de maintien d’une aiguille de 12 cm et de sutures chirurgicales 6-0 (voir le tableau des matériaux). Appliquez la pommade oculaire à l’érythromycine (voir la liste des matériaux) sur le site chirurgical pour prévenir l’infection. Placez les souris sur un coussin chauffant (voir Tableau des matériaux) et conservez-les dans des cages séparées après le réveil.
9. Dès le premier jour après la modélisation, administrer 7,5 mg/kg de sorafénib et de préparation Sanleng Jiashen (7,8 g/kg, 15,6 g/kg et 31,2 g/kg) par gavage aux souris à partir de l’étape 3.8 pendant 14 jours, une fois par jour. Administrez un volume égal de solution saline normale aux souris du groupe modèle.

4. Évaluation de l’imagerie in vivo

REMARQUE : Le jour 14, l’imagerie en direct a été réalisée 1 h après la fin de l’administration.

1. Mettez l’ordinateur et l’instrument d’imagerie in vivo sous tension (voir le tableau des matériaux). Double-cliquez sur l’icône de l’image animée sur le bureau pour lancer le programme. Cliquez sur initialiser le système IVIS dans le panneau de configuration pour démarrer l’ensemble du système IVIS.
   REMARQUE : Une fois que la machine a terminé l’auto-test, le voyant d’état de la température sur le panneau de commande est rouge. Attendez environ 5 à 10 minutes après que la température baisse et que le voyant passe au vert, l’acquisition d’images peut être effectuée.
2. Désinfectez l’abdomen des souris avec de l’alcool et injectez par voie intrapéritonéale 10 μL de D-luciférine par g de poids corporel (voir le tableau des matériaux) à l’aide d’une seringue jetable. Anesthésier les souris par injection intrapéritonéale de 1 %, 50 mg/kg de pentobarbital sodique.
   REMARQUE : La D-luciférine a été diluée avec du PBS stérile à 15 mg/mL.
3. Placez les souris anesthésiées à l’étape 4.3 dans la boîte d’observation et fermez la porte, réglez le temps d’exposition sur 30 s dans le panneau de commande : Sélection du mode : sélectionnez la luminenscence en fonction du type d’échantillon, sélectionnez le programme automatique par défaut et appuyez sur Acquérir pour acquérir des images.
4. Cliquez sur Enregistrer les données de l’image animée, sélectionnez Tous les fichiers de données de l’image animée et enregistrez-les sur le bureau de l’ordinateur.
5. Cliquez sur Quitter dans l’image vivante sur l’écran principal. Éteignez tour à tour l’alimentation de l’appareil photo, de l’instrument d’imagerie et de l’ordinateur.
6. Après l’imagerie, euthanasier les souris anesthésiées (injection intrapéritonéale de 1 %, 50 mg/kg de pentobarbital sodique) par luxation des vertèbres cervicales.

5. Coloration à l’hématoxyline-éosine¹⁷

1. Fixez le tissu hépatique frais de souris à partir de l’étape 4.7 dans du paraformaldéhyde à 4 % pendant 48 h, puis rincez à l’eau courante 3 fois pendant 5 minutes à chaque fois pour éliminer le paraformaldéhyde (voir le tableau des matériaux).
2. Déshydratez les tissus hépatiques à l’étape 5.1 dans de l’éthanol à 30 %, de l’éthanol à 50 %, de l’éthanol à 70 %, de l’éthanol à 95 %, de l’éthanol à 95 % et de l’éthanol anhydre pendant 1 h à tour de rôle (voir le tableau des matériaux).
3. Mettez les tissus hépatiques déshydratés à l’étape 5.2 à 50 % d’éthanol, 50 % de xylène, de xylène, de xylène et de xylène séquentiellement pour les rendre transparents pendant 1 h (voir Tableau des matériaux).
   REMARQUE : Le xylène est volatil et toxique, cette étape est effectuée dans la hotte.
4. Faites fondre la cire de paraffine et maintenez-la à environ 55 °C. Placez les blocs de tissu hépatique à l’étape 5.3 dans une machine d’enrobage de paraffine (voir le tableau des matériaux) remplie d’une solution de cire pour l’enrobage.
5. Fixez le bloc de cire incrusté dans le tissu hépatique de souris à l’étape 5.4 sur la machine à trancher la paraffine (voir tableau des matériaux), coupez-le en tranches de 5 μm d’épaisseur, posez les tranches complètement à plat dans de l’eau à 50 °C et ramassez-les avec une lame. Enfin, mettez-les dans une machine à cuire pour tissus biologiques pour un séchage de 20 min à 70 °C (voir tableau des matériaux).
6. Faites tremper les sections de 5 μm de l’étape 5.5 dans du xylène , du xylène , de l’éthanol anhydre et de l’éthanol anhydre pendant 10 minutes successivement, puis trempez dans de l’éthanol à 95 %, de l’éthanol à 90 %, de l’éthanol à 80 % et de l’éthanol à 70 % pendant 5 minutes respectivement, et enfin lavez à l’eau distillée pour le traitement de déparaffinage (voir le tableau des matériaux).
7. Teindre les sections de tissu hépatique déshydraté de 5 m d’épaisseur avec de l’hématoxyline pendant 8 min, puis rincer à l’eau courante.
8. Différencier dans une solution d’acide chlorhydrique à 1 % pendant 10 s et rincer à l’eau courante pendant 30 minutes (voir le tableau des matériaux).
9. Colorant avec une solution d’éosine à 0,5 % pendant 1 min (voir tableau des matériaux).
10. Mettez les tranches dans de l’alcool à 95 %, de l’alcool à 95 %, de l’éthanol anhydre, de l’éthanol anhydre, du xylène et du xylène pendant 5 minutes chacune pour les déshydrater (voir le tableau des matériaux).
11. Scellez avec de la gomme neutre et prenez des photos au microscope à lumière inversée (voir le tableau des matériaux).

6. Coloration immunohistochimique¹⁸

1. Déposer 1,5 % de H₂O₂ sur les sections de 5 μm du foie de souris à l’étape 5.6 et incuber à température ambiante pendant 10 min, puis laver avec du PBS pendant 2 x 5 min (voir le tableau des matériaux).
2. Réparez les tissus avec une solution d’acide citrique (voir le tableau des matériaux) pendant 5 minutes et lavez-les avec du PBS pendant 3 x 5 minutes.
3. Incuber avec 0,2 % de triton X-100 (voir tableau des matériaux) à température ambiante pendant 4 min, puis incuber avec 0,5 % de triton X-100 à température ambiante pendant 4 min, et laver avec du PBS.
4. Ajouter du sérum de chèvre (voir le tableau des matériaux) pour sceller pendant 15 min, puis ajouter l’anticorps primaire ki67 (voir le tableau des matériaux) dilué avec du PBS (1:300) pour incuber à 4 °C pendant la nuit. Laver avec du PBS pendant 3 x 5 min.
5. Incuber avec un anticorps secondaire dilué avec du PBS (1:200) à température ambiante pendant 1 h, et laver avec du PBS pendant 3 x 5 min (voir le tableau des matériaux).
6. Colorer avec la solution de développement pendant 5 min et rincer à l’eau distillée deux fois (voir tableau des matériaux).
7. Colorer à nouveau avec de l’hématoxyline pendant 2 min, différencier dans une solution d’acide chlorhydrique à 1 % pendant 10 s et rincer à l’eau courante pendant 30 min (voir le tableau des matériaux).
8. Mettez les tranches dans de l’alcool à 95 %, de l’alcool à 95 %, de l’éthanol anhydre, de l’éthanol anhydre, du xylène et du xylène pendant 5 minutes chacune pour les déshydrater (voir le tableau des matériaux).
9. Scellez avec de la gomme neutre et prenez des photos au microscope à lumière inversée (voir tableau des matériaux).

7. Test de la membrane chorioallantoïde d’un embryon de poulet¹⁹

1. Laissez les œufs de poule en plumes blanches (voir tableau des matériaux) à température ambiante pendant 2 h et vaporisez de l’alcool pour désinfecter. Percez un trou dans la chambre à air avec une perceuse à crâne (voir tableau des matériaux) et incubez les œufs avec la chambre à air pendant 7 jours (température d’incubation 37,8-38,2 °C et humidité relative 65 %).
   REMARQUE : Pendant les 3 premiers jours d’incubation, le bouton de retournement automatique des œufs est activé pour empêcher la membrane chorioallantoïdienne de l’embryon de poussin d’adhérer à la coquille et de créer une fausse chambre à air.
2. Jetez les œufs faibles/non fécondés dans l’illuminateur d’œufs (voir le tableau des matériaux). Décollez soigneusement une fenêtre de 1 x 1 cm à l’aide d’une pince à œil (voir tableau des matériaux) après avoir percé un trou dans la fausse chambre à air avec une perceuse à crâne (voir tableau des matériaux).
   REMARQUE : Veuillez noter que la coquille de l’œuf ne doit pas tomber dans la membrane chorioallantoïde de l’embryon de poussin.
3. Le 8e jour de l’incubation, ajoutez 100 μL de suspension de cellules tumorales (1 × 10^{6 cellules} ) à chaque œuf de la fausse chambre à air, à l’exception du groupe témoin. Dans les groupes médicamenteux, ajouter 100 μL de solution de sorafénib et de formule Sanleng Jiachen. Dans les groupes de contrôle et de modèle, ajoutez 100 μL de PBS.
   REMARQUE : La suspension de cellules tumorales est composée de cellules HCCLM3 et de colle matricielle de volume égal. La concentration du médicament est fixée comme suit : 7,5 mg/kg de sorafenib et la formule de Sanleng Jiashen (7,8 g/kg, 15,6 g/kg et 31,2 g/kg).
4. Couvrez la fenêtre avec un pansement transparent (voir tableau des matériaux) et désinfectez avec un spray imbibé d’alcool (voir tableau des matériaux). Après 7 jours d’incubation, retirez le pansement transparent et ajoutez 1 ml de fixateur (méthanol :acétone = 1:1) (voir le tableau des matériaux) de la fausse chambre à air pour une fixation de 30 minutes.
5. Jetez le fixateur à l’aide d’une seringue de 1 ml. Coupez une membrane chorioallantoïdienne de ~5 x 5 cm dans la fausse chambre à air avec des ciseaux ophtalmiques et placez-la dans une boîte de Pétri de 60 mm.
   REMARQUE : Pour une membrane chorioallantoïde d’embryon de poulet avec du sang, rincer avec du PBS. Pour la membrane chorioallantoïdienne de l’embryon de poulet attachée au tissu, séparez-la avec des ciseaux ophtalmiques.
6. Placez la membrane chorioallantoïdienne de l’étape 7.5 sous un microscope optique et photographiez les vaisseaux (voir tableau des matériaux).

Résultats

Comme le montre la figure 2A, nous avons établi un modèle de cancer du foie in situ de souris BALB/c-nu et évalué l’effet antitumoral de la formule de Sanleng Jiashen. La figure 2B montre que la formule de Sanleng Jiashen peut supprimer de manière significative la croissance des tumeurs du foie. Les résultats pathologiques ont indiqué que, par rapport au groupe témoin, les foyers tumoraux du groupe modèle pr?...

Discussion

Une grande quantité de preuves a confirmé que Sanleng, le ginseng, la rhubarbe et le Chuanxiong dans la formule de Sanleng Jiashen ont des effets pharmacologiques sur le traitement du cancer du foie. Des études ont montré que Sanleng peut inhiber de manière significative la prolifération et la croissance des cellules tumorales pour prévenir l’invasion des cellules tumorales et les métastases, induire l’apoptose cellulaire et réguler le cycle cellulaire et le microenvironneme...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.25% trypsin solution	HyClone, America	SH30042.01B
1 mL disposable syringe	Mingankang Medical Equipment Co., Ltd., China	RWSB
1% Penicillin & streptomycin solution	Hyclone, America	SV30010
1.5 mL centrifuge tube	Corning, America	MCT-150-C-S
12 cm needle forceps	Hesdick, China	HKQS-211
6-0 surgical sutures	Shanghai Jinhuan Medical Equipment Co., Ltd., Shanghai, China	CR631
75% alcohol	Sichuan Youbang Enterprise Co., Ltd., Sichuan, China	1.00009E+11
96-well plates	NEST, China	701001
Acetone	Tianjin Dingfu Chemical General Plant, Tianjin, China	GB686-89
BALB/c-nu male nude mice	Beijing Weitonglihua Experimental Animal Technology Co., Ltd., Beijing, China	SYXK(Ji) 2018-0006
Biological tissue baking machine	Leica, Germany	Leica HI1220
Cell culture dish	NEST, China	NEST.706001
Citric acid solution	Wuhan Canos Technology Co., Ltd., Wuhan, China	sj1074
D-luciferin	Gold Biotechnology®, Inc., China	LUCK-100
DMEM	Hyclone, America	SH30243.01
Egg illuminator	Shandong Weizhen Incubation Equipment Company, Shandong, China	WZSDT
Eosin staining solution	Hunan BKMAM Biotechnology Co., Ltd., Hunan, China	110703061
Erythromycin eye ointment	Cisen Pharmaceutical Co., Ltd., Shanghai, China	H37022025
Fetal bovine serum	Clark, America	FB25015
Fully automatic intelligent chick incubator	Shandong Weizhen Incubation Equipment Company, Shandong, China	29538
GFP lentivirus solution	Suzhou GenePharma Co.,Ltd., Suzhou, China	F22AZ
Goat serum	Shenyang Wanlei Biotechnology Co., Ltd., Shengyang, China	WLA067
Hand-held mouse skull drill	STRONGWT, China	190
HCCLM3 cell line	WheLab, Shanghai, China	C1010
Heating pad	Zhongke Life Technology Co., Ltd., Hangzhou, China	GEJRD-10W
Hematoxylin	Hunan BKMAM Biotechnology Co., Ltd., Hunan, China	B-YH250-1
Intelligent decoction pot	Hangzhou Jiuyang living Appliance Co., Ltd., Hangzhou, China	3003BQ
Inverted fluorescence microscope	Olympus, Japan	IX73
ki67 primary antibody	Wuhan Servicebio Technology Co., Ltd., Wuhan, China	GB121141-100
Lodophor disinfectant	Cofoe Medical Technology Co.,Ltd., Hunan, China	202110073
Luciferase	Suzhou GenePharma Co.,Ltd., Suzhou, China	E26JZ
Matrix glue	Corning, America	356234
Medical gauze	Yunnan Chenye Biotechnology Co., Ltd., Yunnan, China	71712049971
Methanol	Guangdong Guanghua Sci-Tech Co., Ltd., Guangdong, China	1.17001.023
Ophthalmic scissor	Hesdick, China	HKQS-209
Ophthalmic tweezer	Hesdick, China	HKCL-20
Paraffin embedding machine	Leica, Germany	EG1150H
Paraffin slicing machine	Leica, Germany	Leica CM1950
Paraformaldehyde	Biosharp, China	BL539A
PBS buffer	Wuhan Servicebio Technology Co., Ltd., Wuhan, China	G2156-1L
Puromycin	Beijing Solarbio Science & Technology Co., Ltd., Beijing, China	P8230
Refrigerator	Thermo Scientific, America	TDE40086FV-ULTS
Scalpel	Hesdick, China	HKCL-93
Secondary antibody	Wuhan Servicebio Technology Co., Ltd., Wuhan, China	GB23301
Small animal live imaging system	Caliper Life Sciences, America	IVIS Lumina XR
Sorafenib	Shanghai Aladdin Biochemical Technology Co., Ltd., Shanghai, China	284461-73-0
Transparent dressing	3M, America	9534HP
Triton X-100	Beijing Solarbio Science & Technology Co., Ltd., Beijing, China	T8200
Vacuum freeze dryer	Ningbo Xinzhi Biotechnology Co., Ltd., Ningbo, China	sz-10N
White feather chicken eggs	Shandong Haotai Experimental Animal Breeding Co., Ltd., Shandong, China	SCXK(Lu) 20180004
Xylene	Sigma-Aldrich, , America	534056