JoVE Logo
АВТОРЫ
СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

Войдите в систему

Для просмотра этого контента требуется подписка на Jove Войдите в систему или начните бесплатную пробную версию.

В этой статье

  • Резюме
  • Аннотация
  • Введение
  • протокол
  • Результаты
  • Обсуждение
  • Раскрытие информации
  • Благодарности
  • Материалы
  • Ссылки
  • Перепечатки и разрешения

Резюме

Здесь мы представляем пошаговый протокол исследования терапевтических и сосудистых ингибирующих эффектов формулы Sanleng Jiashen на мышах BALB/c-nu с ортотопической гепатоцеллюлярной карциномой.

Аннотация

Летальность рака печени и устойчивость к химическим препаратам заставили искать эффективные рецепты традиционных трав при раке печени. Животные модели, которые являются повторяемыми, простыми в манипулировании и в высокой степени имитируют патофизиологические процессы рака печени, являются предпосылкой для успешного скрининга эффективных кандидатов в лекарства. Между тем, надежные показатели и средства оценки эффективности лекарств также являются гарантией исследований и разработок лекарств против рака печени.

Формула Sanleng Jiashen, репрезентативный рецепт традиционной китайской медицины, содержащий Sparganium stoloni erum, Buch. -Ветчина. (Sanleng), Panax ginseng C. A. Mey. (женьшень), Rheum officinale Baill. (ревень) и Ligusticum chuanxiong Hort. (Chuanxiong) назначают для питания печени и очистки тепла, выведения токсинов и улучшения кровообращения для лечения рака печени. В этом экспериментальном протоколе описывается приготовление лиофилизированной формулы Sanleng Jiashen и процесс развития рака печени in situ у мышей BALB/c-nu. Гистопатологическое окрашивание, иммуногистохимическое обнаружение онкомаркеров, визуализация in vivo мышей и хориоаллантоисный мембранный тест куриного эмбриона были использованы для изучения ингибирующего и антиангиогенезного эффекта формулы Sanleng Jiashen на злокачественную пролиферацию ткани рака печени. Данные показывают, что формула Sanleng Jiashen может эффективно противостоять злокачественной пролиферации раковой ткани печени, которая проявляется уменьшением объема опухолевой массы, улучшением патологического повреждения и снижением уровня маркера рака ki67.

Превосходное ингибирование ангиогенеза также предполагает, что формула Sanleng Jiashen может иметь потенциал для лечения и предотвращения прогрессирования и ухудшения состояния рака печени. Вся экспериментальная схема показывает комплексный процесс использования компонентов традиционной китайской медицины в лечении рака печени у мышей, что служит основой для создания и оптимизации модели рака печени, а также для исследования и разработки лекарств для профилактики и лечения рака печени.

Введение

Рак печени — это смертельно опасный рак, который возникает в печени и является второй по распространенности причиной смерти от рака во всем мире1. Показатели заболеваемости печени в Соединенных Штатах и некоторых развивающихся странах демонстрируют высокий уровень, и к 2030 году во всем мире может быть зарегистрировано более 1 миллиона случаев заболевания раком печени2. Из-за нездоровых привычек, таких как курение, ожирение и употребление алкоголя, а также разрушительного воздействия гепатита В, гепатита С и других вирусов, заболеваемость и смертность от рака печени значительно увеличиваются из года вгод. Будучи гетерогенной злокачественной опухолью с различными гистологическими особенностями и плохим прогнозом, рак печени имеет очень широкий диапазон заболеваемости, включая гепатоцеллюлярную карциному, внутрипеченочную холангиокарциному и фиброламеллярный рак печени4. Рак печени часто диагностируется на поздней стадии, и многие пациенты на поздних стадиях не являются кандидатами на лучевую терапию5. Ингибитор мультикиназы сорафениб является широко распространенным препаратом для пациентов с прогрессирующим раком печени, но у пациентов часто развивается значительная резистентность в течениекороткого периода времени. В настоящее время ингибиторы иммунных контрольных точек PD-1 и PD-L1 в сочетании с сорафенибом добились некоторого прогресса в контроле развития рака печени, но терапевтический эффект все еще остается спорным7.

Ортотопический рак печени является ранним типом рака печени: раковые клетки не распространяются по ткани печени и не происходит межорганного метастазирования, и функция печени не сильно страдает8. Поскольку ортотопический рак печени обычно не проявляется явными симптомами дискомфорта, у некоторых пациентов может наблюдаться легкая боль в печени, усталость и другие симптомы9. В клинической практике цветная допплерография печени и усиленное компьютерное томографическое исследование позволяют диагностировать существенные объемные поражения печени10. Несмотря на то, что локальный рак печени, который не распространился и не метастазировал, может быть удален хирургическим путем, существуют определенные хирургические риски и неизбежная психологическая нагрузкадля пациентов. Химиолучевая терапия может убить все или часть раковых клеток печени, а длительная иммуносупрессия у пациентов с лекарственными препаратами может повлиять на эффективность лечения и увеличить рискдругих заболеваний. Таким образом, поиск безопасной и эффективной лекарственной терапии для ранней профилактики и лечения рака печени является ключом к сдерживанию прогрессирования и ухудшения состояния рака печени.

Принцип лечения рака печени в китайской медицине основан на концепции баланса и гармонии внутри организма. Китайская медицина рассматривает рак печени как дисбаланс или дисгармонию в энергии организма, известную как Ци, которая влияетна печень. Лечение рака печени китайской медициной включает в себя различные подходы, включая фитотерапию, иглоукалывание, диетотерапию и рекомендации по образу жизни. Принцип заключается в том, чтобы восстановить баланс Ци, укрепить защитные механизмы организма и способствовать способности организма к самоисцелению14,15. Рак печени в традиционной китайской медицине относится к категории «тимпаниты» и «скопления печени». Уже в «Внутреннем каноне Хуан-ди» есть подробное описание его симптомов, рак печени вызывается застоем крови и дефицитом Чжэнци и лечится путем удаления застоя крови, устранения тимпанитов и повышения сопротивляемости организма для укрепленияконституции. Пилюля Саньленг произошла из книги «Вэйшэн Баоцзянь», написанной Ло Тяньи, известным врачом династии Юань. В его состав входят три вида препаратов: Sparganium stoloni erum, Buch. -Ветчина. (Sanleng), Ligusticum chuanxiong Hort. (Chuanxiong) и Rheum officinale Baill. (ревень). Эти три вида препаратов могут проникать в меридиан печени и иметь терапевтическую ценность для лечения рака печени14. Формула Sanleng Jiashen состоит из 16 г Sanleng, 16 г женьшеня Panax C.A.Mey. (женьшень), 8 г ревеня и 2 г Чуаньсюн (Рисунок 1), который назначается для тонизирования печени, очистки тепла, выведения токсинов и улучшения кровообращения. Считается, что эти травы обладают противораковыми свойствами и помогают уменьшить рост опухоли, облегчить симптомы и улучшить общее самочувствие. В предыдущих экспериментах in vitro формула Sanleng Jiashen может подавлять пролиферацию клеток рака печени15. Однако как эффективно и обоснованно оценить ингибиторное действие китайских растительных соединений на рак печени? При создании модели рака печени у мышей in situ BALB/c-nu ингибирующее действие формулы Sanleng Jiashen на рак печени и ангиогенез было исследовано в основном с помощью визуализации мелких животных и хориоаллантоисного мембранного теста куриного эмбриона.

протокол

Голых мышей-самцов BALB/c-nu, не содержащих специфических патогенов, в возрасте 5 недель и весом 18-22 г, кормили в Центре экспериментальных исследований животных Медицинского колледжа трансформации Цзилиньского университета; условия кормления составляли 22-24 °C при относительной влажности 40%-60%. Номер лицензии на экспериментальное животное - SYXK(Ji) 2018-0006, а экспериментальный процесс соответствует правилам и положениям Комитета по этике Цзилиньского университета, а номер утверждения этики животных - 20221228-01.

1. Приготовление сублимированного Sanleng Jiashen formula15

  1. Поместите 16 г Sanleng, 16 г женьшеня, 8 г ревеня и 2 г Chuanxiong в интеллектуальную кастрюлю для отвара (см. Таблицу материалов) и замочите в 294 мл деионизированной воды комнатной температуры на 30 минут. После нагревания и закипания продолжайте варить в течение 30 минут при температуре 100 °C и процедите жидкость через двойную медицинскую марлю (см. Таблицу материалов). Добавьте к остатку 252 мл деионизированной воды, варите 30 минут при 100 °C и процедите жидкость с помощью двойной марли.
  2. Соберите фильтрат из шага 1.1 в чистую посуду из нержавеющей стали и заморозьте в течение 12 часов при температуре -80 °C (см. Таблицу материалов).
  3. Поместите формулу Sanleng Jiashen из шага 1.2 в вакуумную сублимационную сушилку (см. Таблицу материалов) (температура холодной ловушки: -55 °C) и высушите в течение 48 часов, чтобы получить лиофилизированный порошок формулы Sanleng Jiashen.

2. Построение клеточной линии HCCLM3, стабильно экспрессирующей люциферазу16

  1. Добавьте 1,0 мл клеточной суспензии HCCLM3 в 24-луночный планшет (см. Таблицу материалов) с 5 × 105 клеток/лунку и культуру в полной среде (10% фетальная бычья сыворотка + 1% раствор пенициллин-стрептомицина + DMEM) (см. Таблицу материалов), содержащую 3 мкг/мл пуромицина, в течение 72 ч в клеточном инкубаторе (37 °C, 5% CO2, см. Таблицу материалов).
  2. Выбросьте надосадочную жидкость на этапе 2.1 и добавьте 100 мкл 0,25% раствора трипсина, чтобы клетки в клеточном инкубаторе переваривались в течение 1 минуты (см. Таблицу материалов). Добавьте 300 μл готовой среды и с помощью пипетки освободите прилипшие клетки и прекратите пищеварение. Соберите все клеточные суспензии и поместите их в центрифужную пробирку объемом 15 мл при комнатной температуре 1000 × г на 5 минут. После удаления надосадочной жидкости добавьте 1 мл готовой среды и перемешайте с помощью пипетирования.
  3. Добавьте 100 мкл клеточной суспензии 4 × 103 HCCLM3 клеток/лунку с этапа 2.2 в 96-луночный планшет и закваливайте в клеточный инкубатор в течение 24 ч (37 °C, 5%CO2, см. таблицу материалов).
  4. Добавьте 0,27 мкл лентивируса GFP в 96-луночные планшеты на этапе 2.3 и культивируйте в клеточном инкубаторе в течение 15 ч (37 °C, 5%CO2, см. таблицу материалов). Выбросьте надосадочную жидкость клетки, добавьте 100 мкл полной питательной среды и получите изображения с помощью флуоресцентного микроскопа с длиной волны возбуждения 488 нм и длиной волны излучения 507 нм (см. таблицу материалов).
  5. Замените 2 мл лентивируса GFP и продолжайте культивировать в течение 24 ч. Заменить 2 мл полной питательной среды без лентивируса GFP еще на 24 ч.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Эффективность трансфекции лентивируса GFP в клетки HCCLM3 составила 80% по сравнению с инвертированным флуоресцентным микроскопом.
  6. Добавьте 5 мл 2 × 105 клеточной суспензии с этапа 2,1 в чашку Петри диаметром 60 мм и заквашивайте в клеточном инкубаторе в течение 24 ч. Добавьте 64,5 мкл люциферазы и продолжайте культивирование в клеточном инкубаторе в течение 15 ч (37 °C, 5%CO2, см. Таблицу материалов).
  7. Выбросьте надосадочную жидкость и добавьте 5 мл готовой среды, чтобы продолжить культивирование до тех пор, пока клетки не станут на 90% сливаться в чашке Петри. Выбросьте надосадочную жидкость клетки, промойте 2 x 1 мл PBS и добавьте 1 мл 0,25% раствора трипсина, чтобы клетки в клеточном инкубаторе переваривались в течение 1 минуты (37 °C, 5% CO2, см. Таблицу материалов). Добавьте 3 мл готовой среды и пипеткой вверх и вниз, чтобы освободить адгезивные клетки и завершить пищеварение. Соберите все клеточные суспензии для последующей инъекции мыши.
    Примечание: Для получения достаточного количества клеток клетки непрерывно пассировали и культивировали.

3. Создание модели рака печени in situ на обнаженных мышах BALB/c-nu in situ и лечение15

  1. Добавьте 100 мкл 1 × 107 клеток HCCLM3, трансфицированных люциферазой на этапе 2,7, и 100 мкл матричного клея (см. Таблицу материалов) в центрифужную пробирку объемом 1,5 мл (см. Таблицу материалов) и слегка перемешайте пипеткой объемом 1 мл (см. Таблицу материалов).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Весь процесс приготовления раствора должен проводиться на льду, чтобы предотвратить затвердевание матричного клея.
  2. Дезинфицируйте левую и правую подмышки голых мышей BALB/c-nu йодопином (см. Таблицу материалов) и дейодируйте спиртом (см. Таблицу материалов).
  3. Медленно введите 100 мкл смеси клеток HCCLM3 и матричного клея из шага 3.1 в левую и правую подмышки обнаженных мышей BALB/c-nu с помощью одноразового шприца объемом 1 мл.
    Примечание: Примерно через 10 дней у обнаженных мышей BALB/c-nu развилась опухолевая масса примерно 0,5см3 в месте двусторонней инъекции в подмышечную впадину.
  4. Обезболивайте BALB/c-nu обнаженных мышей на этапе 3.3 путем внутрибрюшинного введения 1%, 50 мг/кг пентобарбитала натрия. Разрежьте кожу обеих подмышек офтальмологическими ножницами и пинцетом (см. Таблицу материалов) и аккуратно очистите подкожную опухолевую массу, чтобы поместить ее в чашку для клеточных культур (см. Таблицу материалов), содержащую предварительно охлажденный буфер PBS (см. Таблицу материалов), и разрежьте ее на1 мм 3 части скальпелем (см. Таблицу материалов).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Опухолевая масса подмышек голых мышей BALB/c-nu должна быть собрана на льду в течение 0,5 ч для поддержания активности опухолевых клеток и повышения успешности модели. В конце отбора проб мыши были убиты путем удаления шейных позвонков. Если есть некротическая часть опухоли, ее нужно удалить, оставив только рыбью белую опухоль, чтобы предотвратить инфицирование во время трансплантации ортотопического рака.
  5. Обезболивайте BALB/c-nu обнаженных мышей 1%, 50 мг/кг натрия пентобарбитала внутрибрюшинно (см. Таблицу материалов), дезинфицируйте брюшную полость йодом (см. Таблицу материалов) и дейодируйте спиртом (см. Таблицу материалов).
  6. С помощью офтальмологических ножниц и пинцета (см. Таблицу материалов) разрежьте хирургический разрез под углом 45° примерно на 1 см в положении 0,5 см ниже мечевидного отростка, чтобы обнажить печень, осторожно надавите на печень, чтобы выдавить ткань печени, и зафиксируйте печень с помощью бумаги для взвешивания.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Ватные палочки или палочки можно поместить под ребра мышей, чтобы эффективно обнажить печень.
  7. Возьмите небольшой кусочек опухолевой ткани на шаге 3.4 с помощью одноразовой инъекционной иглы объемом 10 мл и имплантируйте опухолевую массу в печень на расстоянии около 0,5 см параллельно печени, чтобы зафиксировать ее под капсулой печени, и медленно извлеките иглу.
    ПРИМЕЧАНИЕ: С помощью одноразового шприца объемом 1 мл капните 2 капли расплавленного матричного клея, осмотрите опухолевую массу без случайных соскальзываний и кровотечения, а затем зашите хирургический разрез.
  8. Закройте хирургический разрез щипцами с иглой 12 см и хирургическими швами 6-0 (см. Таблицу материалов). Нанесите глазную мазь с эритромицином (см. Таблицу материалов) на место операции для предотвращения инфицирования. Поместите мышей на грелку (см. Таблицу материалов) и после пробуждения держите их в отдельных клетках.
  9. Начиная с первого дня после моделирования, вводите 7,5 мг/кг сорафениба и формулу Sanleng Jiashen (7,8 г/кг, 15,6 г/кг и 31,2 г/кг) через зонд мышам с шага 3.8 в течение 14 дней, один раз в день. Введите равное количество нормального физиологического раствора мышам в модельной группе.

4. Оценка визуализации in vivo

ПРИМЕЧАНИЕ: На 14-й день визуализация в реальном времени проводилась через 1 ч после окончания введения.

  1. Включите компьютер и прибор для визуализации in vivo (см. Таблицу материалов). Дважды щелкните по значку Living Image на рабочем столе, чтобы запустить программу. Нажмите на кнопку «Инициализировать систему IVIS » в панели управления, чтобы запустить всю систему IVIS.
    ПРИМЕЧАНИЕ: После того как машина завершит самодиагностику, индикатор состояния температуры на панели управления загорится красным цветом. Подождите около 5-10 минут после того, как температура упадет и загорится зеленый свет, можно будет выполнять получение изображения.
  2. Продезинфицируйте брюшную полость мышей спиртом и внутрибрюшинно введите 10 мкл D-люциферина на г массы тела (см. Таблицу материалов) с помощью одноразового шприца. Обезболивают мышей внутрибрюшинным введением 1%, 50 мг/кг натрия пентобарбитала.
    Примечание: D-люциферин разбавляли стерильным PBS до 15 мг/мл.
  3. Поместите мышей под наркозом на шаге 4.3 в смотровую коробку и закройте дверцу, установите время экспозиции 30 с на панели управления: Выбор режима: выберите люминесценцию в соответствии с типом образца, выберите автоматическую программу по умолчанию и нажмите «Получить » для получения изображений.
  4. Нажмите « Сохранить данные живых изображений», выберите «Все файлы данных живых изображений» и сохраните их на рабочем столе компьютера.
  5. Нажмите на кнопку «Выйти в живом изображении » на главном экране. Выключайте питание фотокамеры, питание прибора обработки изображений и питание компьютера по очереди.
  6. После визуализации усыпить мышей, находящихся под наркозом, (внутрибрюшинное введение 1%, 50 мг/кг пентобарбитала натрия) по поводу вывиха шейных позвонков.

5. Окрашивание гематоксилин-эозином17

  1. Зафиксируйте свежую ткань печени мышей с шага 4.7 в 4% параформальдегиде в течение 48 ч, а затем промойте проточной водой 3 раза в течение 5 мин каждый раз, чтобы смыть параформальдегид (см. Таблицу материалов).
  2. Обезвоживайте ткани печени на этапе 5.1 с помощью 30% этанола, 50% этанола, 70% этанола, 95% этанола figure-protocol-11564, 95% этанола figure-protocol-11666и безводного этанола в течение 1 ч по очереди (см. Таблицу материалов).
  3. Поместите обезвоженные ткани печени на шаг 5.2–50% этанола, 50% ксилола, ксилола figure-protocol-11934, ксилола figure-protocol-12032и ксилола figure-protocol-12130 последовательно, чтобы сделать их прозрачными в течение 1 ч (см. Таблицу материалов).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Ксилол летуч и токсичен, этот этап проводится в вытяжном шкафу.
  4. Растопите парафин и поддерживайте температуру на уровне около 55 °C. Поместите блоки ткани печени на шаге 5.3 в машину для заделки парафина (см. Таблицу материалов), заполненную раствором воска для закладки.
  5. Закрепите встроенный восковой блок ткани печени мыши на шаге 5.4 на машине для нарезки парафина (см. Таблицу материалов), разрежьте его на ломтики толщиной 5 мкм, уложите ломтики полностью ровно в воду при температуре 50 °C и зачерпните их предметным стеклом. Наконец, поместите их в машину для выпечки биологических тканей для сушки в течение 20 минут при температуре 70 °C (см. Таблицу материалов).
  6. Замочите секции размером 5 мкм на этапе 5.5 в ксилоле figure-protocol-13146, ксилоле figure-protocol-13244, безводном этаноле figure-protocol-13352и безводном этаноле figure-protocol-13460 в течение 10 минут последовательно, затем замочите в 95% этаноле, 90% этаноле, 80% этаноле и 70% этаноле на 5 минут соответственно и, наконец, промойте дистиллированной водой для обработки депарафинизацией (см. Таблицу материалов).
  7. Обезвоженные, толщиной 5 мкм, парафиновые срезы ткани печени окрашивают гематоксилином в течение 8 мин, а затем промывают проточной водой.
  8. Дифференцировать в 1% растворе соляной кислоты в течение 10 с, и промыть проточной водой в течение 30 мин (см. Таблицу материалов).
  9. Краситель с 0,5% раствором эозина в течение 1 мин (см. Таблицу материалов).
  10. Положите ломтики в 95% спирт figure-protocol-14248, 95% спирт figure-protocol-14348, безводный этанол figure-protocol-14455, безводный этанол figure-protocol-14562, ксилол figure-protocol-14659и ксилол figure-protocol-14756 на 5 минут каждый для обезвоживания (см. Таблицу материалов).
  11. Запечатайте нейтральной резинкой и сделайте фотографии под микроскопом с инвертированным светом (см. Таблицу материалов).

6. Иммуногистохимическое окрашивание18

  1. Капните 1,5% H2O2 на срезы печени мыши размером 5 мкм на шаге 5.6 и инкубируйте при комнатной температуре в течение 10 минут, затем промойте PBS в течение 2 x 5 минут (см. Таблицу материалов).
  2. Восстановите ткань раствором лимонной кислоты (см. Таблицу материалов) в течение 5 минут и промойте PBS в течение 3 х 5 минут.
  3. Инкубировать с 0,2% тритоном X-100 (см. Таблицу материалов) при комнатной температуре в течение 4 мин, затем инкубировать с 0,5% triton X-100 при комнатной температуре в течение 4 мин и промыть PBS.
  4. Добавьте козью сыворотку (см. Таблицу материалов) в герметичное хранение на 15 минут, затем добавьте первичное антитело ki67 (см. Таблицу материалов), разведенное PBS (1:300), для инкубации при 4 °C в течение ночи. Стирать с PBS в течение 3 х 5 минут.
  5. Инкубировать со вторичными антителами, разведенными PBS (1:200), при комнатной температуре в течение 1 ч и промыть PBS в течение 3 x 5 мин (см. Таблицу материалов).
  6. Заморочьте проявляющим раствором в течение 5 минут и промойте двойной дистиллированной водой (см. Таблицу материалов).
  7. Повторно окрашивать гематоксилином в течение 2 мин, дифференцировать в 1% растворе соляной кислоты в течение 10 с, и полоскать проточной водой в течение 30 мин (см. Таблицу материалов).
  8. Положите ломтики в 95% спирт figure-protocol-16698, 95% спирт figure-protocol-16798, безводный этанол figure-protocol-16905, безводный этанол figure-protocol-17012, ксилол figure-protocol-17109и ксилол figure-protocol-17206 на 5 минут каждый для обезвоживания (см. Таблицу материалов).
  9. Запечатайте нейтральной резинкой и сделайте фотографии под микроскопом с инвертированным светом (см. Таблицу материалов).

7. Тест хориоаллантоисной мембраны куриного эмбриона19

  1. Куриные яйца с белым пером (см. Таблицу материалов) оставить при комнатной температуре на 2 ч и опрыскать спиртом для дезинфекции. Сверлом для черепа просверлите отверстие в воздушной камере (см. Таблицу материалов) и высиживайте яйца в воздушной камере вверх в течение 7 суток (температура инкубации 37,8-38,2 °С и относительная влажность воздуха 65%).
    ПРИМЕЧАНИЕ: В течение первых 3 дней инкубации включается кнопка автоматического переворачивания яиц, чтобы предотвратить прилипание хориоаллантоисной мембраны куриного эмбриона к скорлупе и создание камеры ложного воздуха.
  2. Выбросьте слабые/неоплодотворенные яйца в осветителе яиц (см. Таблицу материалов). Осторожно отклейте окно размером 1 х 1 см пинцетом для глаз (см. Таблицу материалов) после сверления отверстия в поддельной воздушной камере с помощью сверла для черепа (см. Таблицу материалов).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Обратите внимание, что скорлупа яйца не должна попадать в хориоаллантоисную оболочку эмбриона цыпленка.
  3. На 8-й день инкубации добавьте по 100 мкл суспензии опухолевых клеток (1 × 106 клеток) в каждое яйцо из камеры искусственного воздуха, кроме контрольной группы. В группы препаратов добавляют по 100 мкл раствора сорафениба и формулу Sanleng Jiashen. В контрольную и модельную группы добавьте 100 мкл PBS.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Суспензия опухолевых клеток состоит из клеток HCCLM3 и матричного клея в равном объеме. Концентрация препарата устанавливается в следующем размере: 7,5 мг/кг сорафениба и формула Sanleng Jiashen (7,8 г/кг, 15,6 г/кг и 31,2 г/кг).
  4. Накройте окно прозрачной повязкой (см. Таблицу материалов) и продезинфицируйте спиртовым спреем (см. Таблицу материалов). После 7 дней инкубации снимите прозрачную повязку и добавьте 1 мл фиксатора (метанол:ацетон = 1:1) (см. Таблицу материалов) из камеры искусственного воздуха для фиксации в течение 30 минут.
  5. Выбросьте фиксатор с помощью шприца объемом 1 мл. Отрежьте хориоаллантоисную мембрану ~5 х 5 см в искусственной воздушной камере офтальмологическими ножницами и поместите в чашку Петри диаметром 60 мм.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Для получения хориоаллантоисной мембраны куриного эмбриона с кровью, промойте PBS. Для эмбриона цыпленка хориоаллантоисную оболочку прикрепляют к ткани, отделяют офтальмологическими ножницами.
  6. Поместите хориоаллантоисную мембрану из шага 7.5 под оптический микроскоп и сфотографируйте сосуды (см. Таблицу материалов).

Результаты

Как показано на рисунке 2A, мы создали модель рака печени in-situ у мышей BALB/c-nu и оценили противоопухолевый эффект формулы Sanleng Jiashen. На рисунке 2B показано, что формула Sanleng Jiashen может значительно подавлять рост опухолей печени. Результат...

Обсуждение

Большое количество доказательств подтвердило, что Sanleng, женьшень, ревень и чуаньсюн в формуле Sanleng Jiashen оказывают фармакологическое воздействие на лечение рака печени. Исследования показали, что Sanleng может значительно ингибировать пролиферацию и рост опухолевых клет?...

Раскрытие информации

Авторам нечего раскрывать.

Благодарности

Эта работа была поддержана Фондом философии и социальных наук Китая (20VYJ070), проектом Департамента образования провинции Цзилинь (JJKH20230963KJ) и вторым пакетом инженерного проекта ученых Синлинь в Чанчуньском университете китайской медицины (QNKXJ2-2021+ZR25).

Материалы

NameCompanyCatalog NumberComments
0.25% trypsin solutionHyClone, AmericaSH30042.01B
1 mL disposable syringeMingankang Medical Equipment Co., Ltd., ChinaRWSB
1% Penicillin & streptomycin solutionHyclone, AmericaSV30010
1.5 mL centrifuge tubeCorning, AmericaMCT-150-C-S
12 cm needle forcepsHesdick, ChinaHKQS-211
6-0 surgical suturesShanghai Jinhuan Medical Equipment Co., Ltd., Shanghai, ChinaCR631
75% alcoholSichuan Youbang Enterprise Co., Ltd., Sichuan, China1.00009E+11
96-well platesNEST, China701001
AcetoneTianjin Dingfu Chemical General Plant, Tianjin, ChinaGB686-89
BALB/c-nu male nude miceBeijing Weitonglihua Experimental Animal Technology Co., Ltd., Beijing, ChinaSYXK(Ji) 2018-0006
Biological tissue baking machineLeica, GermanyLeica HI1220
Cell culture dishNEST, ChinaNEST.706001
Citric acid solutionWuhan Canos Technology Co., Ltd., Wuhan, Chinasj1074
D-luciferinGold Biotechnology®, Inc., ChinaLUCK-100
DMEMHyclone, AmericaSH30243.01
Egg illuminatorShandong Weizhen Incubation Equipment Company, Shandong, ChinaWZSDT
Eosin staining solutionHunan BKMAM Biotechnology Co., Ltd., Hunan, China110703061
Erythromycin eye ointment Cisen Pharmaceutical Co., Ltd., Shanghai, ChinaH37022025
Fetal bovine serumClark, AmericaFB25015 
Fully automatic intelligent chick incubatorShandong Weizhen Incubation Equipment Company, Shandong, China29538
GFP lentivirus solutionSuzhou GenePharma Co.,Ltd., Suzhou, ChinaF22AZ
Goat serumShenyang Wanlei Biotechnology Co., Ltd., Shengyang, ChinaWLA067
Hand-held mouse skull drillSTRONGWT, China190
HCCLM3 cell lineWheLab, Shanghai, ChinaC1010
Heating padZhongke Life Technology Co., Ltd., Hangzhou, ChinaGEJRD-10W
HematoxylinHunan BKMAM Biotechnology Co., Ltd., Hunan, ChinaB-YH250-1
Intelligent decoction potHangzhou Jiuyang living Appliance Co., Ltd., Hangzhou, China3003BQ
 Inverted fluorescence microscopeOlympus, JapanIX73
ki67 primary antibodyWuhan Servicebio Technology Co., Ltd., Wuhan, ChinaGB121141-100
Lodophor disinfectantCofoe Medical Technology Co.,Ltd., Hunan, China202110073
LuciferaseSuzhou GenePharma Co.,Ltd., Suzhou, ChinaE26JZ
Matrix glueCorning, America356234
Medical gauzeYunnan Chenye Biotechnology Co., Ltd., Yunnan, China71712049971
MethanolGuangdong Guanghua Sci-Tech Co., Ltd., Guangdong, China1.17001.023
Ophthalmic scissorHesdick, ChinaHKQS-209
Ophthalmic tweezerHesdick, ChinaHKCL-20
Paraffin embedding machineLeica, Germany EG1150H
Paraffin slicing machineLeica, GermanyLeica CM1950
ParaformaldehydeBiosharp, ChinaBL539A
PBS bufferWuhan Servicebio Technology Co., Ltd., Wuhan, ChinaG2156-1L
PuromycinBeijing Solarbio Science & Technology Co., Ltd., Beijing, ChinaP8230
RefrigeratorThermo Scientific, AmericaTDE40086FV-ULTS
ScalpelHesdick, ChinaHKCL-93
Secondary antibodyWuhan Servicebio Technology Co., Ltd., Wuhan, ChinaGB23301
Small animal live imaging systemCaliper Life Sciences, AmericaIVIS Lumina XR
SorafenibShanghai Aladdin Biochemical Technology Co., Ltd., Shanghai, China284461-73-0 
Transparent dressing3M, America9534HP
Triton X-100Beijing Solarbio Science & Technology Co., Ltd., Beijing, ChinaT8200
Vacuum freeze dryer Ningbo Xinzhi Biotechnology Co., Ltd., Ningbo, Chinasz-10N
White feather chicken eggsShandong Haotai Experimental Animal Breeding Co., Ltd., Shandong, ChinaSCXK(Lu) 20180004
XyleneSigma-Aldrich, , America534056

Ссылки

  1. Sia, D., Villanueva, A., Friedman, S. L., Llovet, J. M. Liver cancer cell of origin, molecular class, and effects on patient prognosis. Gastroenterology. 152 (4), 745-761 (2017).
  2. Starley, B. Q., Calcagno, C. J., Harrison, S. A. Nonalcoholic fatty liver disease and hepatocellular carcinoma: a weighty connection. Hepatology. 51 (5), 1820-1832 (2010).
  3. Siegel, R. L., Miller, K. D., Wagle, N. S., Jemal, A. Cancer statistics. CA-A Cancer J. Clin. 73 (1), 17-48 (2023).
  4. Lozano, R., et al. Global and regional mortality from 235 causes of death for 20 age groups in 1990 and 2010: a systematic analysis for the Global Burden of Disease Study 2010. Lancet. 380 (9859), 2095-2128 (2012).
  5. Verslype, C., et al. The management of hepatocellular carcinoma. Current expert opinion and recommendations derived from the 10th World Congress on Gastrointestinal Cancer, Barcelona, 2008. Ann. Oncol. , (2009).
  6. Greten, T. F., et al. Biomarkers for immunotherapy of hepatocellular carcinoma. Nat. Rev. Clin. Oncol. 20 (11), 780-798 (2023).
  7. Rimassa, L., Finn, R. S., Sangro, B. Combination immunotherapy for hepatocellular carcinoma. J. Hepatol. 79 (2), 506-515 (2023).
  8. Wu, Z. H., et al. A terrylene-anthraquinone dyad as a chromophore for photothermal therapy in the NIR-II window. J. Am. Chem. Soc. 145 (48), 26487-26493 (2023).
  9. Pawlik, T. M. Hepatocellular carcinoma. Sure. Oncol. Clin. N. Am. 33 (1), (2024).
  10. Schwarze, V., et al. Diagnostic value of contrast-enhanced ultrasound versus computed tomography for hepatocellular carcinoma: a retrospective, single-center evaluation of 234 patients. J. Int. Med. Res. 48 (6), 1-10 (2020).
  11. Maki, H., Hasegawa, K. Advances in the surgical treatment of liver cancer. Biosci. Trends. 16 (3), 178-188 (2022).
  12. Pepe, A., et al. Medical radiology: current progress. Diagnostics. 13 (14), 2439 (2023).
  13. Li, Y., Zhang, C. Significance of 'harmonious' thinking in Inner Canon of Huangdi on the prevention and treatment of primary liver cancer. China Journal of Traditional Chinese Medicine and Pharmacy. 28 (02), 305-308 (2013).
  14. Luo, T. . Wishing Baojian (M). , (2019).
  15. Li, Y. . Effect and mechanism of Sanlengjiashen Decoction on hepatocellular carcinoma by JAK2/STAT3 signaling pathway [D]. , (2022).
  16. Wang, P., et al. BTF3 promotes proliferation and glycolysis in hepatocellular carcinoma by regulating GLUT1. Cancer Biol. Ther. 24 (1), 2225884 (2023).
  17. Xie, N., et al. Rhodiola crenulate alleviates hypobaric hypoxia-induced brain injury via adjusting NF-κB/NLRP3-mediated inflammation. Phytomedicine. 103, 154240 (2022).
  18. Wang, X., et al. Rhodiola crenulata attenuates apoptosis and mitochondrial energy metabolism disorder in rats with hypobaric hypoxia-induced brain injury by regulating the HIF-1α/microRNA210/ISCU1/2 (COX10) signaling pathway. J. Ethnopharmacol. 241, 111801 (2019).
  19. Guerrieri, A. N., et al. A novel patient-derived immortalised cell line of myxofibrosarcoma: a tool for preclinical drugs testing and the generation of near-patient models. BMC Cancer. 23 (1), 1194 (2023).
  20. Li, Y., Zhao, J., Zhao, H., Yu, C. Research progress of Sparganium Stoloniferum. Journal of Liaoning University of Traditional Chinese Medicine. 20 (09), 92-94 (2018).
  21. Kim, T. W., Lee, S. Y., Kim, M., Cheon, C., Ko, S. G. Kaempferol induces autophagic cell death via IRE1-JNK-CHOP pathway and inhibition of G9a in gastric cancer cells. Cell Death Dis. 9 (9), 875 (2018).
  22. Lee, M. J., et al. Kaempferol alleviates mitochondrial damage by reducing mitochondrial reactive oxygen species production in lipopolysaccharide-induced prostate organoids. Foods. 12 (20), 3836 (2023).
  23. Zhang, Q., et al. Molecular docking and in vitro experiments verified that kaempferol induced apoptosis and inhibited human HepG2 cell proliferation by targeting BAX, CDK1, and JUN. Mol. Cell. Biochem. 478 (4), 767-780 (2023).
  24. Kumar, S., et al. Myricetin: a potential plant-derived anticancer bioactive compound-an updated overview. N-S Arch. Pharmacol. 396 (10), 2179-2196 (2023).
  25. Wang, M., et al. Myricetin reverses epithelial-endothelial transition and inhibits vasculogenic mimicry and angiogenesis of hepatocellular carcinoma by directly targeting PAR1. Phytother. Res. 36 (4), 1807-1821 (2022).
  26. Li, J., Li, F., Jin, D. Ginsenosides are promising medicine for tumor and inflammation: A review. Am. J. Chinese Med. 51 (4), 883-908 (2023).
  27. Guo, X., Hu, N., Sun, G., Li, M., Zhang, P. Shenyi capsule plus chemotherapy versus chemotherapy for non-small cell lung cancer:A systematic review of overlapping meta-analyses. Chinese Journal of Integrative Medicine. 24 (3), 227-231 (2018).
  28. Zhang, R., et al. Network Meta-analysis of oral Chinese patent medicine for adjuvant treatment of primary liver cancer. China Journal of Chinese Materia Medica. 46 (09), 2333-2343 (2021).
  29. Oh, H. M., Cho, C. K., Son, C. G. Experimental evidence for the anti-metastatic action of ginsenoside Rg3: A systematic review. Int. J. Mol. Sci. 23 (16), 9077 (2022).
  30. Nowak-Perlak, M., Ziółkowski, P., Woźniak, M. A promising natural anthraquinones mediated by photodynamic therapy for anti-cancer therapy. Phytomedicine. 119, 155035 (2023).
  31. Bai, J., et al. Emodin, a natural anthraquinone, suppresses liver cancer in vitro and in vivo by regulating VEGFR and miR-34a. Invest. New Drug. 38 (2), 229-245 (2020).
  32. Cheng, G., et al. Cell metabolomics reveals the potential mechanism of aloe emodin and emodin inhibiting breast cancer metastasis. Int. J. Mol. Sci. 23 (22), 13738 (2022).
  33. Wang, X., et al. Inhibition of tetramethylpyrazine on P-gp, MRP2, MRP3 and MRP5 in multidrug resistant human hepatocellular carcinoma cells. Oncol. Rep. 23 (1), 211-215 (2010).
  34. Hu, J., et al. Ultrasonic extraction, antioxidant and anticancer activities of novel polysaccharides from Chuanxiong rhizome. Int. J. Biol. Macromol. 85, 277-284 (2016).
  35. Zhong, C., et al. Physicochemical properties of polysaccharides from Ligusticum chuanxiong and analysis of their anti-tumor potential through immunoregulation. Food Funct. 12 (4), 1719-1731 (2021).
  36. Hou, Y., et al. Salidroside intensifies mitochondrial function of CoCl2-damaged HT22 cells by stimulating PI3K-AKT-MAPK signaling pathway. Phytomedicine. 109, 154568 (2023).
  37. Wang, X., et al. Salidroside, a phenyl ethanol glycoside from Rhodiola crenulata, orchestrates hypoxic mitochondrial dynamics homeostasis by stimulating Sirt1/p53/Drp1 signaling. J. Ethnopharmacol. 293, 115278 (2022).

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на использование текста или рисунков этого JoVE статьи

Запросить разрешение

Смотреть дополнительные статьи

BALB c nuKi67

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Конфиденциальность

Условия эксплуатации

Политика

СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

РЕКОМЕНДОВАТЬ БИБЛИОТЕКЕ

НОВОСТИ JoVE

Исследования

Образование

АВТОРЫ

Библиотекарь

О JoVE

Авторские права © 2025 MyJoVE Corporation. Все права защищены