Для просмотра этого контента требуется подписка на Jove Войдите в систему или начните бесплатную пробную версию.
Method Article
Здесь мы представляем пошаговый протокол исследования терапевтических и сосудистых ингибирующих эффектов формулы Sanleng Jiashen на мышах BALB/c-nu с ортотопической гепатоцеллюлярной карциномой.
Летальность рака печени и устойчивость к химическим препаратам заставили искать эффективные рецепты традиционных трав при раке печени. Животные модели, которые являются повторяемыми, простыми в манипулировании и в высокой степени имитируют патофизиологические процессы рака печени, являются предпосылкой для успешного скрининга эффективных кандидатов в лекарства. Между тем, надежные показатели и средства оценки эффективности лекарств также являются гарантией исследований и разработок лекарств против рака печени.
Формула Sanleng Jiashen, репрезентативный рецепт традиционной китайской медицины, содержащий Sparganium stoloni erum, Buch. -Ветчина. (Sanleng), Panax ginseng C. A. Mey. (женьшень), Rheum officinale Baill. (ревень) и Ligusticum chuanxiong Hort. (Chuanxiong) назначают для питания печени и очистки тепла, выведения токсинов и улучшения кровообращения для лечения рака печени. В этом экспериментальном протоколе описывается приготовление лиофилизированной формулы Sanleng Jiashen и процесс развития рака печени in situ у мышей BALB/c-nu. Гистопатологическое окрашивание, иммуногистохимическое обнаружение онкомаркеров, визуализация in vivo мышей и хориоаллантоисный мембранный тест куриного эмбриона были использованы для изучения ингибирующего и антиангиогенезного эффекта формулы Sanleng Jiashen на злокачественную пролиферацию ткани рака печени. Данные показывают, что формула Sanleng Jiashen может эффективно противостоять злокачественной пролиферации раковой ткани печени, которая проявляется уменьшением объема опухолевой массы, улучшением патологического повреждения и снижением уровня маркера рака ki67.
Превосходное ингибирование ангиогенеза также предполагает, что формула Sanleng Jiashen может иметь потенциал для лечения и предотвращения прогрессирования и ухудшения состояния рака печени. Вся экспериментальная схема показывает комплексный процесс использования компонентов традиционной китайской медицины в лечении рака печени у мышей, что служит основой для создания и оптимизации модели рака печени, а также для исследования и разработки лекарств для профилактики и лечения рака печени.
Рак печени — это смертельно опасный рак, который возникает в печени и является второй по распространенности причиной смерти от рака во всем мире1. Показатели заболеваемости печени в Соединенных Штатах и некоторых развивающихся странах демонстрируют высокий уровень, и к 2030 году во всем мире может быть зарегистрировано более 1 миллиона случаев заболевания раком печени2. Из-за нездоровых привычек, таких как курение, ожирение и употребление алкоголя, а также разрушительного воздействия гепатита В, гепатита С и других вирусов, заболеваемость и смертность от рака печени значительно увеличиваются из года вгод. Будучи гетерогенной злокачественной опухолью с различными гистологическими особенностями и плохим прогнозом, рак печени имеет очень широкий диапазон заболеваемости, включая гепатоцеллюлярную карциному, внутрипеченочную холангиокарциному и фиброламеллярный рак печени4. Рак печени часто диагностируется на поздней стадии, и многие пациенты на поздних стадиях не являются кандидатами на лучевую терапию5. Ингибитор мультикиназы сорафениб является широко распространенным препаратом для пациентов с прогрессирующим раком печени, но у пациентов часто развивается значительная резистентность в течениекороткого периода времени. В настоящее время ингибиторы иммунных контрольных точек PD-1 и PD-L1 в сочетании с сорафенибом добились некоторого прогресса в контроле развития рака печени, но терапевтический эффект все еще остается спорным7.
Ортотопический рак печени является ранним типом рака печени: раковые клетки не распространяются по ткани печени и не происходит межорганного метастазирования, и функция печени не сильно страдает8. Поскольку ортотопический рак печени обычно не проявляется явными симптомами дискомфорта, у некоторых пациентов может наблюдаться легкая боль в печени, усталость и другие симптомы9. В клинической практике цветная допплерография печени и усиленное компьютерное томографическое исследование позволяют диагностировать существенные объемные поражения печени10. Несмотря на то, что локальный рак печени, который не распространился и не метастазировал, может быть удален хирургическим путем, существуют определенные хирургические риски и неизбежная психологическая нагрузкадля пациентов. Химиолучевая терапия может убить все или часть раковых клеток печени, а длительная иммуносупрессия у пациентов с лекарственными препаратами может повлиять на эффективность лечения и увеличить рискдругих заболеваний. Таким образом, поиск безопасной и эффективной лекарственной терапии для ранней профилактики и лечения рака печени является ключом к сдерживанию прогрессирования и ухудшения состояния рака печени.
Принцип лечения рака печени в китайской медицине основан на концепции баланса и гармонии внутри организма. Китайская медицина рассматривает рак печени как дисбаланс или дисгармонию в энергии организма, известную как Ци, которая влияетна печень. Лечение рака печени китайской медициной включает в себя различные подходы, включая фитотерапию, иглоукалывание, диетотерапию и рекомендации по образу жизни. Принцип заключается в том, чтобы восстановить баланс Ци, укрепить защитные механизмы организма и способствовать способности организма к самоисцелению14,15. Рак печени в традиционной китайской медицине относится к категории «тимпаниты» и «скопления печени». Уже в «Внутреннем каноне Хуан-ди» есть подробное описание его симптомов, рак печени вызывается застоем крови и дефицитом Чжэнци и лечится путем удаления застоя крови, устранения тимпанитов и повышения сопротивляемости организма для укрепленияконституции. Пилюля Саньленг произошла из книги «Вэйшэн Баоцзянь», написанной Ло Тяньи, известным врачом династии Юань. В его состав входят три вида препаратов: Sparganium stoloni erum, Buch. -Ветчина. (Sanleng), Ligusticum chuanxiong Hort. (Chuanxiong) и Rheum officinale Baill. (ревень). Эти три вида препаратов могут проникать в меридиан печени и иметь терапевтическую ценность для лечения рака печени14. Формула Sanleng Jiashen состоит из 16 г Sanleng, 16 г женьшеня Panax C.A.Mey. (женьшень), 8 г ревеня и 2 г Чуаньсюн (Рисунок 1), который назначается для тонизирования печени, очистки тепла, выведения токсинов и улучшения кровообращения. Считается, что эти травы обладают противораковыми свойствами и помогают уменьшить рост опухоли, облегчить симптомы и улучшить общее самочувствие. В предыдущих экспериментах in vitro формула Sanleng Jiashen может подавлять пролиферацию клеток рака печени15. Однако как эффективно и обоснованно оценить ингибиторное действие китайских растительных соединений на рак печени? При создании модели рака печени у мышей in situ BALB/c-nu ингибирующее действие формулы Sanleng Jiashen на рак печени и ангиогенез было исследовано в основном с помощью визуализации мелких животных и хориоаллантоисного мембранного теста куриного эмбриона.
Голых мышей-самцов BALB/c-nu, не содержащих специфических патогенов, в возрасте 5 недель и весом 18-22 г, кормили в Центре экспериментальных исследований животных Медицинского колледжа трансформации Цзилиньского университета; условия кормления составляли 22-24 °C при относительной влажности 40%-60%. Номер лицензии на экспериментальное животное - SYXK(Ji) 2018-0006, а экспериментальный процесс соответствует правилам и положениям Комитета по этике Цзилиньского университета, а номер утверждения этики животных - 20221228-01.
1. Приготовление сублимированного Sanleng Jiashen formula15
2. Построение клеточной линии HCCLM3, стабильно экспрессирующей люциферазу16
3. Создание модели рака печени in situ на обнаженных мышах BALB/c-nu in situ и лечение15
4. Оценка визуализации in vivo
ПРИМЕЧАНИЕ: На 14-й день визуализация в реальном времени проводилась через 1 ч после окончания введения.
5. Окрашивание гематоксилин-эозином17
6. Иммуногистохимическое окрашивание18
7. Тест хориоаллантоисной мембраны куриного эмбриона19
Как показано на рисунке 2A, мы создали модель рака печени in-situ у мышей BALB/c-nu и оценили противоопухолевый эффект формулы Sanleng Jiashen. На рисунке 2B показано, что формула Sanleng Jiashen может значительно подавлять рост опухолей печени. Результат...
Большое количество доказательств подтвердило, что Sanleng, женьшень, ревень и чуаньсюн в формуле Sanleng Jiashen оказывают фармакологическое воздействие на лечение рака печени. Исследования показали, что Sanleng может значительно ингибировать пролиферацию и рост опухолевых клет?...
Авторам нечего раскрывать.
Эта работа была поддержана Фондом философии и социальных наук Китая (20VYJ070), проектом Департамента образования провинции Цзилинь (JJKH20230963KJ) и вторым пакетом инженерного проекта ученых Синлинь в Чанчуньском университете китайской медицины (QNKXJ2-2021+ZR25).
Name | Company | Catalog Number | Comments |
0.25% trypsin solution | HyClone, America | SH30042.01B | |
1 mL disposable syringe | Mingankang Medical Equipment Co., Ltd., China | RWSB | |
1% Penicillin & streptomycin solution | Hyclone, America | SV30010 | |
1.5 mL centrifuge tube | Corning, America | MCT-150-C-S | |
12 cm needle forceps | Hesdick, China | HKQS-211 | |
6-0 surgical sutures | Shanghai Jinhuan Medical Equipment Co., Ltd., Shanghai, China | CR631 | |
75% alcohol | Sichuan Youbang Enterprise Co., Ltd., Sichuan, China | 1.00009E+11 | |
96-well plates | NEST, China | 701001 | |
Acetone | Tianjin Dingfu Chemical General Plant, Tianjin, China | GB686-89 | |
BALB/c-nu male nude mice | Beijing Weitonglihua Experimental Animal Technology Co., Ltd., Beijing, China | SYXK(Ji) 2018-0006 | |
Biological tissue baking machine | Leica, Germany | Leica HI1220 | |
Cell culture dish | NEST, China | NEST.706001 | |
Citric acid solution | Wuhan Canos Technology Co., Ltd., Wuhan, China | sj1074 | |
D-luciferin | Gold Biotechnology®, Inc., China | LUCK-100 | |
DMEM | Hyclone, America | SH30243.01 | |
Egg illuminator | Shandong Weizhen Incubation Equipment Company, Shandong, China | WZSDT | |
Eosin staining solution | Hunan BKMAM Biotechnology Co., Ltd., Hunan, China | 110703061 | |
Erythromycin eye ointment | Cisen Pharmaceutical Co., Ltd., Shanghai, China | H37022025 | |
Fetal bovine serum | Clark, America | FB25015 | |
Fully automatic intelligent chick incubator | Shandong Weizhen Incubation Equipment Company, Shandong, China | 29538 | |
GFP lentivirus solution | Suzhou GenePharma Co.,Ltd., Suzhou, China | F22AZ | |
Goat serum | Shenyang Wanlei Biotechnology Co., Ltd., Shengyang, China | WLA067 | |
Hand-held mouse skull drill | STRONGWT, China | 190 | |
HCCLM3 cell line | WheLab, Shanghai, China | C1010 | |
Heating pad | Zhongke Life Technology Co., Ltd., Hangzhou, China | GEJRD-10W | |
Hematoxylin | Hunan BKMAM Biotechnology Co., Ltd., Hunan, China | B-YH250-1 | |
Intelligent decoction pot | Hangzhou Jiuyang living Appliance Co., Ltd., Hangzhou, China | 3003BQ | |
Inverted fluorescence microscope | Olympus, Japan | IX73 | |
ki67 primary antibody | Wuhan Servicebio Technology Co., Ltd., Wuhan, China | GB121141-100 | |
Lodophor disinfectant | Cofoe Medical Technology Co.,Ltd., Hunan, China | 202110073 | |
Luciferase | Suzhou GenePharma Co.,Ltd., Suzhou, China | E26JZ | |
Matrix glue | Corning, America | 356234 | |
Medical gauze | Yunnan Chenye Biotechnology Co., Ltd., Yunnan, China | 71712049971 | |
Methanol | Guangdong Guanghua Sci-Tech Co., Ltd., Guangdong, China | 1.17001.023 | |
Ophthalmic scissor | Hesdick, China | HKQS-209 | |
Ophthalmic tweezer | Hesdick, China | HKCL-20 | |
Paraffin embedding machine | Leica, Germany | EG1150H | |
Paraffin slicing machine | Leica, Germany | Leica CM1950 | |
Paraformaldehyde | Biosharp, China | BL539A | |
PBS buffer | Wuhan Servicebio Technology Co., Ltd., Wuhan, China | G2156-1L | |
Puromycin | Beijing Solarbio Science & Technology Co., Ltd., Beijing, China | P8230 | |
Refrigerator | Thermo Scientific, America | TDE40086FV-ULTS | |
Scalpel | Hesdick, China | HKCL-93 | |
Secondary antibody | Wuhan Servicebio Technology Co., Ltd., Wuhan, China | GB23301 | |
Small animal live imaging system | Caliper Life Sciences, America | IVIS Lumina XR | |
Sorafenib | Shanghai Aladdin Biochemical Technology Co., Ltd., Shanghai, China | 284461-73-0 | |
Transparent dressing | 3M, America | 9534HP | |
Triton X-100 | Beijing Solarbio Science & Technology Co., Ltd., Beijing, China | T8200 | |
Vacuum freeze dryer | Ningbo Xinzhi Biotechnology Co., Ltd., Ningbo, China | sz-10N | |
White feather chicken eggs | Shandong Haotai Experimental Animal Breeding Co., Ltd., Shandong, China | SCXK(Lu) 20180004 | |
Xylene | Sigma-Aldrich, , America | 534056 |
Запросить разрешение на использование текста или рисунков этого JoVE статьи
Запросить разрешениеThis article has been published
Video Coming Soon
Авторские права © 2025 MyJoVE Corporation. Все права защищены