Etablierung des Hepatokarzinoms bei BALB/c-nu-Mäusen und Untersuchung der therapeutischen Wirkung der Sanleng-Jiashen-Formel

Zusammenfassung

Hier stellen wir das Schritt-für-Schritt-Protokoll vor, um die therapeutischen und vaskulär-inhibitorischen Wirkungen der Sanleng Jiashen-Formel auf BALB/c-nu-Mäuse mit orthotopem hepatozellulärem Karzinom zu untersuchen.

Zusammenfassung

Die Letalität von Leberkrebs und die Resistenz gegen chemische Medikamente haben die Suche nach wirksamen Verschreibungen traditioneller Kräuter gegen Leberkrebs erzwungen. Tiermodelle, die wiederholbar und leicht zu manipulieren sind und die pathophysiologischen Prozesse von Leberkrebs in hohem Maße nachahmen, sind die Voraussetzung für das erfolgreiche Screening wirksamer Wirkstoffkandidaten. In der Zwischenzeit sind zuverlässige Indikatoren und Mittel zur Bewertung der Wirksamkeit von Arzneimitteln auch die Garantie für die Forschung und Entwicklung von Medikamenten gegen Leberkrebs.

Sanleng Jiashen Formel, eine repräsentative Verschreibung der traditionellen chinesischen Medizin mit Sparganium stoloni erum, Buch. -Schinken. (Sanleng), Panax Ginseng C. A. Mey. (Ginseng), Rheum officinale Baill. (Rhabarber) und Ligusticum chuanxiong Hort. (Chuanxiong) wird verschrieben, um die Leber zu nähren und die Hitze zu reinigen, Giftstoffe zu entfernen und die Durchblutung zu fördern, um Leberkrebs zu behandeln. Dieses Versuchsprotokoll beschreibt die Herstellung der lyophilisierten Sanleng Jiashen-Formel und den Etablierungsprozess von in-situ Leberkrebs bei BALB/c-nu-Mäusen. Histopathologische Färbung, immunhistochemischer Nachweis von Krebsmarkern, In-vivo-Bildgebung von Mäusen und Chorioallantoismembrantest für Hühnerembryonen wurden verwendet, um die Hemmung und Anti-Angiogenese-Wirkung der Sanleng Jiashen-Formel auf die maligne Proliferation von Leberkrebsgewebe zu untersuchen. Die Daten zeigen, dass die Sanleng Jiashen-Formel der bösartigen Proliferation von Leberkrebsgewebe wirksam widerstehen kann, was sich in einem verringerten Tumormassenvolumen, einer verbesserten pathologischen Schädigung und niedrigeren Spiegeln des Krebsmarkers ki67 äußert.

Die überlegene Hemmung der Angiogenese deutet auch darauf hin, dass die Sanleng Jiashen-Formel das Potenzial haben könnte, das Fortschreiten und die Verschlechterung von Leberkrebs zu behandeln und zu verhindern. Das gesamte experimentelle Schema zeigt einen umfassenden Prozess der Komponenten der traditionellen chinesischen Medizin bei der Behandlung von Leberkrebs bei der Maus, der eine Referenz für die Etablierung und Optimierung eines Leberkrebsmodells sowie für die Forschung und Entwicklung von Medikamenten zur Vorbeugung und Behandlung von Leberkrebs darstellt.

Einleitung

Leberkrebs ist eine tödliche Krebserkrankung, die ihren Ursprung in der Leber hat und weltweit die zweithäufigste krebsbedingte Todesursache ist¹. Die Raten von Lebererkrankungen in den Vereinigten Staaten und einigen Entwicklungsländern weisen ein hohes Niveau auf, und bis 2030 könnte es weltweit mehr als 1 Million Leberkrebsfälle geben². Aufgrund ungesunder Lebensgewohnheiten wie Rauchen, Fettleibigkeit und Alkoholkonsum sowie der verheerenden Auswirkungen von Hepatitis B, Hepatitis C und anderen Viren sind die Inzidenz und Mortalität von Leberkrebs von Jahr^zu Jahr 3 signifikant gestiegen. Als heterogener bösartiger Tumor mit unterschiedlichen histologischen Merkmalen und schlechter Prognose weist der Leberkrebs ein sehr breites Inzidenzspektrum auf, darunter das hepatozelluläre Karzinom, das intrahepatische Cholangiokarzinom und der fibrolamelläre Leberkrebs⁴. Leberkrebs wird oft in einem fortgeschrittenen Stadium diagnostiziert, und viele fortgeschrittene Patienten kommen nicht für eine Strahlentherapie^{in Frage 5}. Der Multikinase-Inhibitor Sorafenib ist ein hoch akzeptiertes Medikament für Patienten mit fortgeschrittenem Leberkrebs, aber die Patienten entwickeln oft innerhalb kurzer Zeit eine signifikante Resistenz⁶. Gegenwärtig haben die Immun-Checkpoint-Inhibitoren PD-1 und PD-L1 in Kombination mit Sorafenib einige Fortschritte bei der Kontrolle der Entstehung von Leberkrebs gemacht, aber die therapeutische Wirkung ist noch umstritten⁷.

Der orthotope Leberkrebs ist eine frühe Form von Leberkrebs: Krebszellen haben sich nicht im Lebergewebe ausgebreitet oder es treten keine Metastasen zwischen den Organen auf, und die Funktion der Leber ist nicht stark beeinträchtigt⁸. Da orthotoper Leberkrebs im Allgemeinen keine offensichtlichen Symptome von Beschwerden aufweist, können einige Patienten leichte Leberschmerzen, Müdigkeit und andere Symptome haben⁹. In der klinischen Praxis können mit der Farbdoppler-Sonographie der Leber und der erweiterten Computertomographie erhebliche raumfordernde Läsionen in der Leber diagnostiziert^{werden 10}. Obwohl der lokale Leberkrebs, der sich nicht ausgebreitet und metastasiert hat, operativ entfernt werden kann, gibt es bestimmte chirurgische Risiken und die unvermeidliche psychische Belastung für die Patienten¹¹. Eine Radiochemotherapie kann Leberkrebszellen ganz oder teilweise abtöten, und eine langfristige Immunsuppression bei Patienten mit Medikamenten kann die Wirksamkeit der Behandlung beeinträchtigen und das Risiko für andere Krankheiten erhöhen¹². Daher ist die Suche nach einer sicheren und wirksamen medikamentösen Therapie zur frühzeitigen Prävention und Behandlung von Leberkrebs der Schlüssel zur Eindämmung des Fortschreitens und der Verschlechterung von Leberkrebs.

Das Prinzip der chinesischen Medizin zur Behandlung von Leberkrebs basiert auf dem Konzept des Gleichgewichts und der Harmonie im Körper. Die chinesische Medizin betrachtet Leberkrebs als ein Ungleichgewicht oder eine Disharmonie in der Körperenergie, bekannt als Qi, die die Leber beeinflusst¹³. Die Behandlung von Leberkrebs in der chinesischen Medizin umfasst verschiedene Ansätze, darunter Kräutermedizin, Akupunktur, Ernährungstherapie und Empfehlungen zum Lebensstil. Das Prinzip besteht darin, das Gleichgewicht des Qi wiederherzustellen, die Abwehrmechanismen des Körpers zu stärken und die Fähigkeit des Körpers zu fördern, sich selbst zu heilen^14,15. Leberkrebs gehört in der Traditionellen Chinesischen Medizin in die Kategorie "Tympaniten" und "Leberakkumulation". Sobald der "Innere Kanon von Huangdi" eine detaillierte Aufzeichnung seiner Symptome hat, wird Leberkrebs durch Blutstauung und Zhengqi-Mangel verursacht und wird durch die Beseitigung von Blutstauungen, die Beseitigung von Tympaniten und die Stärkung der Körperabwehr behandelt, um die Konstitution zu festigen¹³. Die Sanleng-Pille stammt aus dem Buch "Weisheng Baojian", das von Luo Tianyi, einem berühmten Arzt in der Yuan-Dynastie, geschrieben wurde. Es besteht aus drei Arten von Medikamenten: Sparganium stoloni erum, Buch. -Schinken. (Sanleng), Ligusticum chuanxiong Hort. (Chuanxiong) und Rheum officinale Baill. (Rhabarber). Diese drei Arten von Medikamenten können in den Lebermeridian eindringen und haben einen therapeutischen Wert für die Behandlung von Leberkrebs¹⁴. Die Sanleng Jiashen-Formel besteht aus 16 g Sanleng, 16 g Panax Ginseng C.A.Mey. (Ginseng), 8 g Rhabarber und 2 g Chuanxiong (Abbildung 1), das verschrieben wird, um die Leber zu tonisieren, die Hitze zu reinigen, Giftstoffe auszuscheiden und die Durchblutung zu fördern. Es wird angenommen, dass diese Kräuter krebshemmende Eigenschaften haben und dazu beitragen, das Tumorwachstum zu reduzieren, Symptome zu lindern und das allgemeine Wohlbefinden zu verbessern. In den vorangegangenen In-vitro-Experimenten kann die Sanleng Jiashen-Formel die Vermehrung von Leberkrebszellen hemmen¹⁵. Doch wie kann die hemmende Wirkung chinesischer pflanzlicher Wirkstoffe auf Leberkrebs effizient und vernünftig bewertet werden? Durch die Etablierung eines BALB/c-nu-Maus-in-situ-Leberkrebsmodells wurde die inhibitorische Wirkung der Sanleng Jiashen-Formel auf Leberkrebs und Angiogenese hauptsächlich durch Live-Bildgebung bei Kleintieren und einen Chorioallantoik-Membrantest von Hühnerembryonen untersucht.

Protokoll

Männliche BALB/c-nu-Nacktmäuse, die spezifisch frei von Krankheitserregern waren, 5 Wochen alt waren und 18-22 g wogen, wurden im Animal Experimental Center of Transformation Medical College der Universität Jilin gefüttert; die Fütterungsbedingungen betrugen 22 °C-24 °C mit 40 % bis 60 % relativer Luftfeuchtigkeit. Die Lizenznummer für Versuchstiere lautet SYXK(Ji) 2018-0006, und das Versuchsverfahren entspricht den Regeln und Vorschriften der Ethikkommission der Universität Jilin, und die Genehmigungsnummer für Tierethik lautet 20221228-01.

1. Zubereitung der gefriergetrockneten Sanleng Jiashen Formel¹⁵

1. Geben Sie 16 g Sanleng, 16 g Ginseng, 8 g Rhabarber und 2 g Chuanxiong in einen intelligenten Abkochtopf (siehe Materialtabelle) und weichen Sie 30 Minuten lang in 294 ml entionisiertem Wasser bei Raumtemperatur ein. Nach dem Erhitzen und Kochen 30 Minuten bei 100 °C weitergaren und die Flüssigkeit durch doppelte medizinische Gaze filtrieren (siehe Materialtabelle). Geben Sie 252 mL entionisiertes Wasser zu den Rückständen, kochen Sie es 30 Minuten bei 100 °C und filtern Sie die Flüssigkeit mit doppelter Gaze.
2. Das Filtrat aus Schritt 1.1 in einer sauberen Edelstahlschale auffangen und 12 h bei -80 °C einfrieren (siehe Materialtabelle).
3. Geben Sie die Sanleng Jiashen-Formel aus Schritt 1.2 in einen Vakuum-Gefriertrockner (siehe Materialtabelle) (Kühlfallentemperatur: -55 °C) und trocknen Sie sie 48 h lang, um das gefriergetrocknete Pulver der Sanleng Jiashen-Formel zu erhalten.

2. Aufbau einer HCCLM3-Zelllinie, die Luciferase stabil exprimiert¹⁶

1. 1,0 ml HCCLM3-Zellsuspension in die 24-Well-Platte (siehe Materialtabelle) mit 5 × 10⁵ Zellen/Well geben und in einem vollständigen Medium (10 % fötales Rinderserum + 1 % Penicillin-Streptomycin-Lösung + DMEM) (siehe Materialtabelle) mit 3 μg/ml Puromycin für 72 h in einem Zellinkubator (37 °C, 5 % CO₂, siehe Materialtabelle).
2. Verwerfen Sie den Zellüberstand in Schritt 2.1 und fügen Sie 100 μl 0,25%ige Trypsinlösung hinzu, um die Zellen in einem Zellinkubator 1 Minute lang zu verdauen (siehe Materialtabelle). Fügen Sie 300 μl vollständiges Medium hinzu und verwenden Sie eine Pipette, um die adhärenten Zellen zu befreien und die Verdauung zu beenden. Sammeln Sie alle Zellsuspensionen und geben Sie sie in ein 15-ml-Zentrifugenröhrchen bei Raumtemperatur bei 1.000 × g für 5 min. Nachdem Sie den Überstand verworfen haben, fügen Sie 1 ml des vollständigen Mediums hinzu und mischen Sie es durch Pipettieren.
3. 100 μl Zellsuspension von 4 × 10³ HCCLM3-Zellen/Vertiefung aus Schritt 2.2 in eine 96-Well-Platte geben und 24 h in einem Zellinkubator kultivieren (37 °C, 5 % CO₂, siehe Materialtabelle).
4. 0,27 μl GFP-Lentivirus in Schritt 2.3 auf die 96-Well-Platten geben und 15 h in einem Zellinkubator kultivieren (37 °C, 5 % CO₂, siehe Materialtabelle). Entsorgen Sie den Zellüberstand, fügen Sie 100 μl vollständiges Kulturmedium hinzu und nehmen Sie Bilder mit einem Fluoreszenzmikroskop bei der Anregungswellenlänge von 488 nm und der Emissionswellenlänge von 507 nm auf (siehe Materialtabelle).
5. Ersetzen Sie 2 ml GFP-Lentivirus und kultivieren Sie es 24 Stunden lang. Ersetzen Sie 2 ml des vollständigen Kulturmediums ohne GFP-Lentivirus für weitere 24 Stunden.
   HINWEIS: Die Transfektionseffizienz des GFP-Lentivirus in HCCLM3-Zellen betrug 80 %, wie unter einem inversen Fluoreszenzmikroskop betrachtet.
6. 5 ml 2 × 10 5-Zell-Suspension aus Schritt 2.1 in eine 60-mm-Petrischale geben und 24 Stunden lang in einem Zellinkubator kultivieren. 64,5 μl Luciferase zugeben und 15 Stunden lang in einem Zellinkubator kultivieren (37 °C, 5 % CO₂, siehe Materialtabelle).
7. Entsorgen Sie den Überstand und fügen Sie 5 ml vollständiges Medium hinzu, um die Kultivierung fortzusetzen, bis die Zellen in der Petrischale zu 90 % zusammenfließen. Entsorgen Sie den Zellüberstand, waschen Sie ihn mit 2 x 1 ml PBS und fügen Sie 1 ml 0,25%ige Trypsinlösung hinzu, um die Zellen in einem Zellinkubator 1 min lang zu verdauen (37 °C, 5 % CO₂, siehe Materialtabelle). Fügen Sie 3 ml vollständiges Medium hinzu und pipettieren Sie auf und ab, um adhärente Zellen zu befreien, und beenden Sie die Verdauung. Sammeln Sie alle Zellsuspensionen für die anschließende Mausinjektion.
   HINWEIS: Um eine ausreichende Anzahl von Zellen zu erhalten, wurden die Zellen kontinuierlich passageiert und kultiviert.

3. Etablierung eines BALB/c-nu-Nacktmäusemodells für Leberkrebs in situ und Behandlung¹⁵

1. 100 μl 1 × 10⁷ HCCLM3-Zellen, die in Schritt 2.7 mit Luciferase transfiziert wurden, und 100 μl Matrixkleber (siehe Materialtabelle) in ein 1,5-ml-Zentrifugenröhrchen geben (siehe Materialtabelle) und leicht mit einer 1-ml-Pipette mischen (siehe Materialtabelle).
   HINWEIS: Der gesamte Prozess der Lösungsvorbereitung muss auf Eis durchgeführt werden, um ein Aushärten des Matrizenklebers zu verhindern.
2. Desinfizieren Sie die linke und rechte Achselhöhle von BALB/c-nu-Nacktmäusen mit Jodopin (siehe Materialtabelle) und entjodieren Sie mit Alkohol (siehe Materialtabelle).
3. Injizieren Sie langsam 100 μl der Mischung aus HCCLM3-Zellen und Matrixkleber aus Schritt 3.1 in die linke und rechte Achselhöhle von BALB/c-nu-Nacktmäusen mit einer 1 mL Einwegspritze.
   HINWEIS: Nach ca. 10 Tagen entwickelten BALB/c-nu-Nacktmäuse an der bilateralen Achselinjektionsstelle eine Tumormasse von ca. 0,5^cm3 .
4. Betäuben Sie BALB/c-nu-Nacktmäuse in Schritt 3.3 durch intraperitoneale Injektion von 1%, 50 mg/kg Natrium-Pentobarbital. Schneiden Sie die Haut beider Achselhöhlen mit einer Augenschere und einer Pinzette ein (siehe Materialtabelle) und schälen Sie vorsichtig die subkutane Tumormasse, um sie in eine Zellkulturschale (siehe Materialtabelle) zu legen, die vorgekühlten PBS-Puffer enthält (siehe Materialtabelle), und schneiden Sie sie mit einem Skalpell in 1 mm³ Stücke (siehe Materialtabelle).
   HINWEIS: Die Achseltumormasse von BALB/c-nu-Nacktmäusen muss innerhalb von 0,5 h auf Eis entnommen werden, um die Aktivität der Tumorzellen aufrechtzuerhalten und die Erfolgsrate des Modells zu erhöhen. Am Ende der Probenahme wurden die Mäuse durch die Entfernung von Halswirbeln getötet. Wenn es einen nekrotischen Teil des Tumors gibt, muss er entfernt werden, so dass nur der fischweiße Tumor übrig bleibt, um eine Infektion während der orthotopen Krebstransplantation zu verhindern.
5. Betäuben Sie BALB/c-nu-Nacktmäuse intraperitoneal mit 1%, 50 mg/kg Natrium-Pentobarbital (siehe Materialtabelle), desinfizieren Sie den Bauch mit Jod (siehe Materialtabelle) und entjodieren Sie mit Alkohol (siehe Materialtabelle).
6. Schneiden Sie mit einer Augenschere und einer Pinzette (siehe Materialtabelle) einen chirurgischen Schnitt um 45° etwa 1 cm an der Stelle von 0,5 cm unter dem Xiphoid-Prozess, um die Leber freizulegen, drücken Sie vorsichtig auf die Leber, um Lebergewebe herauszudrücken, und fixieren Sie die Leber mit Wiegepapier.
   HINWEIS: Wattestäbchen oder Stäbchen können unter die Rippen von Mäusen gelegt werden, um die Leber effektiv freizulegen.
7. Entnehmen Sie in Schritt 3.4 ein kleines Stück Tumorgewebe mit einer 10 mL Einweg-Injektionsnadel, implantieren Sie die Tumormasse etwa 0,5 cm parallel zur Leber in die Leber, um sie unter der Leberkapsel zu fixieren und ziehen Sie die Nadel langsam zurück.
   HINWEIS: Verwenden Sie eine 1-ml-Einwegspritze, um 2 Tropfen des geschmolzenen Matrixklebers fallen zu lassen, beobachten Sie die Tumormasse ohne versehentliches Verrutschen und ohne Blutungen und nähen Sie dann den chirurgischen Schnitt.
8. Verschließen Sie den chirurgischen Schnitt mit einer 12 cm langen Nadelhaltezange und 6-0 chirurgischen Nähten (siehe Materialtabelle). Tragen Sie Erythromycin-Augensalbe (siehe Materialtabelle) auf die Operationsstelle auf, um eine Infektion zu verhindern. Lege die Mäuse auf ein beheiztes Pad (siehe Materialtabelle) und halte sie nach dem Aufwachen in separaten Käfigen.
9. Ab dem ersten Tag nach der Modellierung wird den Mäusen ab Schritt 3.8 14 Tage lang einmal täglich 7,5 mg/kg Sorafenib und Sanleng Jiashen-Säuglingsnahrung (7,8 g/kg, 15,6 g/kg und 31,2 g/kg) über eine Sonde verabreicht. Den Mäusen in der Modellgruppe wird das gleiche Volumen normaler Kochsalzlösung verabreicht.

4. In-vivo-Bildgebung

HINWEIS: An Tag 14 wurde die Live-Bildgebung 1 Stunde nach Ende der Verabreichung durchgeführt.

1. Schalten Sie den Computer und das In-vivo-Bildgebungsinstrument ein (siehe Materialtabelle). Doppelklicken Sie auf das Living Image-Symbol auf dem Desktop, um das Programm zu starten. Klicken Sie in der Systemsteuerung auf IVIS-System initialisieren , um das gesamte IVIS-System zu starten.
   HINWEIS: Nachdem das Gerät den Selbsttest abgeschlossen hat, leuchtet die Temperaturstatusleuchte auf dem Bedienfeld rot. Warten Sie ca. 5-10 Minuten, nachdem die Temperatur gesunken ist und das Licht grün wird, die Bildaufnahme kann durchgeführt werden.
2. Desinfizieren Sie den Bauch von Mäusen mit Alkohol und injizieren Sie intraperitoneal 10 μl D-Luciferin pro g Körpergewicht (siehe Materialtabelle) mit einer Einwegspritze. Anästhesieren Sie Mäuse durch intraperitoneale Injektion von 1%, 50 mg/kg Natriumpentobarbital.
   HINWEIS: D-Luciferin wurde mit sterilem PBS auf 15 mg/ml verdünnt.
3. Legen Sie die anästhesierten Mäuse in Schritt 4.3 in die Beobachtungsbox und schließen Sie die Tür, stellen Sie die Belichtungszeit im Bedienfeld auf 30 s ein: Modusauswahl: Wählen Sie die Lumineszenz entsprechend dem Probentyp, wählen Sie standardmäßig das Automatikprogramm und drücken Sie Acquire, um Bilder aufzunehmen.
4. Klicken Sie auf Lebendbilddaten speichern, wählen Sie Alle Lebendbild-Datendateien aus und speichern Sie sie auf dem Computer-Desktop.
5. Klicken Sie auf dem Hauptbildschirm auf Beenden im Live-Bild . Schalten Sie nacheinander die Kamera, das Bildinstrument und den Computer aus.
6. Nach der Bildgebung werden die anästhesierten Mäuse eingeschläfert (intraperitoneale Injektion von 1%, 50 mg/kg Natrium-Pentobarbital) durch Luxation der Halswirbel.

5. Hämatoxylin-Eosin-Färbung¹⁷

1. Fixieren Sie das frische Lebergewebe von Mäusen aus Schritt 4.7 48 h lang in 4% Paraformaldehyd und spülen Sie es dann 3 Mal für jeweils 5 Minuten mit fließendem Wasser ab, um das Paraformaldehyd wegzuspülen (siehe Materialtabelle).
2. Dehydrieren Sie das Lebergewebe in Schritt 5.1 nacheinander 1 h lang in 30 % Ethanol, 50 % Ethanol, 70 % Ethanol, 95 % Ethanol , 95 % Ethanol und wasserfreiem Ethanol (siehe Materialtabelle).
3. Legen Sie das dehydrierte Lebergewebe nacheinander in Schritt 5.2 auf 50 % Ethanol, 50 % Xylol, Xylol , Xylol und Xylol , um es 1 h lang transparent zu machen (siehe Materialtabelle).
   HINWEIS: Xylol ist flüchtig und giftig, dieser Schritt wird im Abzug durchgeführt.
4. Schmelzen Sie das Paraffinwachs und halten Sie die Temperatur bei ca. 55 °C. Legen Sie die Lebergewebeblöcke in Schritt 5.3 in eine Paraffineinbettmaschine (siehe Materialtabelle), die mit Wachslösung für die Einbettung gefüllt ist.
5. Den in Schritt 5.4 eingebetteten Wachsblock aus Mäuselebergewebe auf der Paraffinschneidemaschine fixieren (siehe Materialtabelle), in 5 μm dicke Scheiben schneiden, die Scheiben ganz flach in 50 °C heißes Wasser legen und mit einem Objektschieber aufheben. Zum Schluss in eine biologische Tissue-Backmaschine geben, um sie 20 min bei 70 °C zu trocknen (siehe Materialtabelle).
6. Die 5-μm-Abschnitte in Schritt 5.5 werden nacheinander 10 Minuten lang in Xylol , Xylol , wasserfreiem Ethanol und wasserfreiem Ethanol eingeweicht, dann jeweils 5 Minuten lang in 95 % Ethanol, 90 % Ethanol, 80 % Ethanol und 70 % Ethanol eingeweicht und schließlich zur Entparaffinierungsbehandlung mit destilliertem Wasser gewaschen (siehe Materialtabelle).
7. Färben Sie die dehydrierten, 5 μm dicken Lebergewebeschnitte aus Parrafinwachs 8 Minuten lang mit Hämatoxylin und spülen Sie sie anschließend unter fließendem Wasser ab.
8. 10 s in 1%iger Salzsäurelösung differenzieren und 30 min lang unter fließendem Wasser spülen (siehe Materialtabelle).
9. Mit 0,5%iger Eosinlösung 1 min färben (siehe Materialtabelle).
10. Legen Sie die Scheiben zum Dehydrieren jeweils 5 Minuten in 95% Alkohol , 95% Alkohol , wasserfreies Ethanol , wasserfreies Ethanol , Xylol und Xylol (siehe Materialtabelle).
11. Versiegeln Sie es mit neutralem Gummi und fotografieren Sie unter einem Inverslichtmikroskop (siehe Materialtabelle).

6. Immunhistochemische Färbung¹⁸

1. 1,5 % H₂O₂ auf die 5 μm großen Schnitte der Mausleber in Schritt 5.6 geben und 10 min bei Raumtemperatur inkubieren, dann 2 x 5 min mit PBS waschen (siehe Materialtabelle).
2. Das Gewebe 5 min lang mit einer Zitronensäurelösung (siehe Materialtabelle) reparieren und 3 x 5 min mit PBS waschen.
3. Inkubieren Sie mit 0,2 % Triton X-100 (siehe Materialtabelle) bei Raumtemperatur für 4 min, dann inkubieren Sie mit 0,5 % Triton X-100 bei Raumtemperatur für 4 min und waschen Sie es mit PBS.
4. Fügen Sie Ziegenserum (siehe Materialtabelle) hinzu, um es 15 Minuten lang zu versiegeln, und fügen Sie dann den mit PBS (1:300) verdünnten Ki67-Primärantikörper (siehe Materialtabelle) hinzu, um über Nacht bei 4 °C zu inkubieren. Mit PBS 3 x 5 Min. waschen.
5. Mit einem mit PBS (1:200) verdünnten Sekundärantikörper 1 h bei Raumtemperatur inkubieren und 3 x 5 min mit PBS waschen (siehe Materialtabelle).
6. Mit der Entwicklungslösung 5 min einfärben und mit doppelt destilliertem Wasser abspülen (siehe Materialtabelle).
7. 2 min lang erneut mit Hämatoxylin färben, 10 s in 1%iger Salzsäurelösung differenzieren und 30 min unter fließendem Wasser abspülen (siehe Materialtabelle).
8. Legen Sie die Scheiben zum Dehydrieren jeweils 5 Minuten in 95% Alkohol , 95% Alkohol , wasserfreies Ethanol , wasserfreies Ethanol , Xylol und Xylol (siehe Materialtabelle).
9. Mit neutralem Gummi versiegeln und unter einem Inverslichtmikroskop fotografieren (siehe Materialtabelle).

7. Test der chorioallantoischen Membran des Kükenembryos¹⁹

1. Lassen Sie die weißen Feder-Hühnereier (siehe Materialtabelle) 2 h bei Raumtemperatur und besprühen Sie sie zur Desinfektion mit Alkohol. Bohren Sie mit einem Schädelbohrer ein Loch in die Luftkammer (siehe Materialtabelle) und brüten Sie die Eier 7 Tage lang mit der Luftkammer nach oben (Bruttemperatur 37,8-38,2 °C und relative Luftfeuchtigkeit 65%).
   HINWEIS: Während der ersten 3 Tage der Inkubation wird der automatische Ei-Wendeknopf eingeschaltet, um zu verhindern, dass die chorioallantoische Membran des Hühnerembryos an der Schale haftet und eine falsche Luftkammer bildet.
2. Entsorgen Sie die schwachen/unbefruchteten Eier in den Eierleuchter (siehe Materialtabelle). Schälen Sie ein 1 x 1 cm großes Fenster vorsichtig mit einer Augenpinzette (siehe Materialtabelle) heraus, nachdem Sie mit einem Schädelbohrer ein Loch in die falsche Luftkammer gebohrt haben (siehe Materialtabelle).
   HINWEIS: Bitte beachten Sie, dass die Eierschale nicht in die chorioallantoische Membran des Hühnerembryos fallen sollte.
3. Am 8. Tag der Inkubation geben Sie 100 μl Tumorzellsuspension (1 × 10⁶ Zellen) zu jedem Ei aus der gefälschten Luftkammer mit Ausnahme der Kontrollgruppe. Fügen Sie in den Arzneimittelgruppen 100 μl Sorafenib-Lösung und Sanleng Jiashen-Formel hinzu. Fügen Sie in der Kontroll- und der Modellgruppe 100 μl PBS hinzu.
   HINWEIS: Die Tumorzellsuspension besteht aus HCCLM3-Zellen und Matrixkleber in gleichem Volumen. Die Arzneimittelkonzentration wird wie folgt festgelegt: 7,5 mg/kg Sorafenib und Sanleng Jiashen Säuglingsnahrung (7,8 g/kg, 15,6 g/kg und 31,2 g/kg).
4. Decken Sie das Fenster mit einem transparenten Verband ab (siehe Materialtabelle) und desinfizieren Sie es mit Alkoholspray (siehe Materialtabelle). Entfernen Sie nach 7 Tagen Inkubation den transparenten Verband und fügen Sie 1 ml Fixiermittel (Methanol:Aceton = 1:1) (siehe Materialtabelle) aus der gefälschten Luftkammer für eine 30-minütige Fixierung hinzu.
5. Entsorgen Sie das Fixiermittel mit einer 1-ml-Spritze. Schneiden Sie ~5 x 5 cm chorioallantoische Membran in der künstlichen Luftkammer mit einer Augenschere ab und legen Sie sie in eine 60 mm Petrischale.
   HINWEIS: Bei chorioallantoischer Membran des Hühnerembryos mit Blut mit PBS spülen. Bei chorioallantoischen Membranen des Hühnerembryos, die am Gewebe befestigt sind, mit einer Augenschere trennen.
6. Legen Sie die Chorioallantoismembran aus Schritt 7.5 unter ein Lichtmikroskop und fotografieren Sie die Gefäße (siehe Materialtabelle).

Ergebnisse

Wie in Abbildung 2A gezeigt, etablierten wir ein in-situ Leberkrebsmodell von BALB/c-nu-Mäusen und untersuchten die Antitumorwirkung der Sanleng Jiashen-Formel. Abbildung 2B zeigt, dass die Sanleng Jiashen-Formel das Wachstum von Lebertumoren signifikant unterdrücken kann. Die pathologischen Befunde deuteten darauf hin, dass die Tumorherde in der Modellgruppe im Vergleich zur Kontrollgruppe klare Grenzen zum umgebende...

Diskussion

Eine große Menge an Beweisen hat bestätigt, dass Sanleng, Ginseng, Rhabarber und Chuanxiong in der Sanleng Jiashen-Formel pharmakologische Wirkungen auf die Behandlung von Leberkrebs haben. Studien haben gezeigt, dass Sanleng die Proliferation und das Wachstum von Tumorzellen signifikant hemmen kann, um die Invasion und Metastasierung von Tumorzellen zu verhindern, die Zellapoptose zu induzieren und den Zellzyklus und die Tumormikroumgebung zu regulieren²⁰. Es i...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.25% trypsin solution	HyClone, America	SH30042.01B
1 mL disposable syringe	Mingankang Medical Equipment Co., Ltd., China	RWSB
1% Penicillin & streptomycin solution	Hyclone, America	SV30010
1.5 mL centrifuge tube	Corning, America	MCT-150-C-S
12 cm needle forceps	Hesdick, China	HKQS-211
6-0 surgical sutures	Shanghai Jinhuan Medical Equipment Co., Ltd., Shanghai, China	CR631
75% alcohol	Sichuan Youbang Enterprise Co., Ltd., Sichuan, China	1.00009E+11
96-well plates	NEST, China	701001
Acetone	Tianjin Dingfu Chemical General Plant, Tianjin, China	GB686-89
BALB/c-nu male nude mice	Beijing Weitonglihua Experimental Animal Technology Co., Ltd., Beijing, China	SYXK(Ji) 2018-0006
Biological tissue baking machine	Leica, Germany	Leica HI1220
Cell culture dish	NEST, China	NEST.706001
Citric acid solution	Wuhan Canos Technology Co., Ltd., Wuhan, China	sj1074
D-luciferin	Gold Biotechnology®, Inc., China	LUCK-100
DMEM	Hyclone, America	SH30243.01
Egg illuminator	Shandong Weizhen Incubation Equipment Company, Shandong, China	WZSDT
Eosin staining solution	Hunan BKMAM Biotechnology Co., Ltd., Hunan, China	110703061
Erythromycin eye ointment	Cisen Pharmaceutical Co., Ltd., Shanghai, China	H37022025
Fetal bovine serum	Clark, America	FB25015
Fully automatic intelligent chick incubator	Shandong Weizhen Incubation Equipment Company, Shandong, China	29538
GFP lentivirus solution	Suzhou GenePharma Co.,Ltd., Suzhou, China	F22AZ
Goat serum	Shenyang Wanlei Biotechnology Co., Ltd., Shengyang, China	WLA067
Hand-held mouse skull drill	STRONGWT, China	190
HCCLM3 cell line	WheLab, Shanghai, China	C1010
Heating pad	Zhongke Life Technology Co., Ltd., Hangzhou, China	GEJRD-10W
Hematoxylin	Hunan BKMAM Biotechnology Co., Ltd., Hunan, China	B-YH250-1
Intelligent decoction pot	Hangzhou Jiuyang living Appliance Co., Ltd., Hangzhou, China	3003BQ
Inverted fluorescence microscope	Olympus, Japan	IX73
ki67 primary antibody	Wuhan Servicebio Technology Co., Ltd., Wuhan, China	GB121141-100
Lodophor disinfectant	Cofoe Medical Technology Co.,Ltd., Hunan, China	202110073
Luciferase	Suzhou GenePharma Co.,Ltd., Suzhou, China	E26JZ
Matrix glue	Corning, America	356234
Medical gauze	Yunnan Chenye Biotechnology Co., Ltd., Yunnan, China	71712049971
Methanol	Guangdong Guanghua Sci-Tech Co., Ltd., Guangdong, China	1.17001.023
Ophthalmic scissor	Hesdick, China	HKQS-209
Ophthalmic tweezer	Hesdick, China	HKCL-20
Paraffin embedding machine	Leica, Germany	EG1150H
Paraffin slicing machine	Leica, Germany	Leica CM1950
Paraformaldehyde	Biosharp, China	BL539A
PBS buffer	Wuhan Servicebio Technology Co., Ltd., Wuhan, China	G2156-1L
Puromycin	Beijing Solarbio Science & Technology Co., Ltd., Beijing, China	P8230
Refrigerator	Thermo Scientific, America	TDE40086FV-ULTS
Scalpel	Hesdick, China	HKCL-93
Secondary antibody	Wuhan Servicebio Technology Co., Ltd., Wuhan, China	GB23301
Small animal live imaging system	Caliper Life Sciences, America	IVIS Lumina XR
Sorafenib	Shanghai Aladdin Biochemical Technology Co., Ltd., Shanghai, China	284461-73-0
Transparent dressing	3M, America	9534HP
Triton X-100	Beijing Solarbio Science & Technology Co., Ltd., Beijing, China	T8200
Vacuum freeze dryer	Ningbo Xinzhi Biotechnology Co., Ltd., Ningbo, China	sz-10N
White feather chicken eggs	Shandong Haotai Experimental Animal Breeding Co., Ltd., Shandong, China	SCXK(Lu) 20180004
Xylene	Sigma-Aldrich, , America	534056