A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.
Method Article
כאן, אנו מציגים את הפרוטוקול שלב אחר שלב לחקירת ההשפעות הטיפוליות ומעכבות כלי הדם של נוסחת Sanleng Jiashen על עכברי BALB/c-nu עם קרצינומה הפטו-תאית אורתוטופית.
הקטלניות של סרטן הכבד והעמידות לתרופות כימיות אילצו את החיפוש אחר מרשמים יעילים של צמחי מרפא מסורתיים לסרטן הכבד. מודלים של בעלי חיים הניתנים לחזרה, קלים למניפולציה ומחקים מאוד את התהליכים הפתופיזיולוגיים של סרטן הכבד הם תנאי מוקדם לסינון מוצלח של מועמדים יעילים לתרופות. בינתיים, אינדיקטורים ואמצעים אמינים להערכת יעילות תרופות הם גם הערובה למחקר ופיתוח תרופות נגד סרטן הכבד.
נוסחת Sanleng Jiashen, מרשם מייצג של רפואה סינית מסורתית המכילה Sparganium stoloni erum, Buch. -שינקן. (Sanleng), Panax ginseng C. A. Mey. (ג'ינסנג), Rheum officinale Baill. (ריבס), ו-Ligusticum chuanxiong Hort. (Chuanxiong), נקבעים כדי להזין את הכבד ולנקות חום, להסיר רעלים ולקדם את זרימת הדם לטיפול בסרטן הכבד. פרוטוקול ניסיוני זה מתאר את הכנת פורמולת Sanleng Jiashen שעברה ליופיליזציה ואת תהליך ההקמה של סרטן כבד במקום בעכברי BALB/c-nu. צביעה היסטופתולוגית, זיהוי אימונוהיסטוכימי של סמני סרטן, הדמיה in vivo של עכברים ובדיקת ממברנה כוריואלנטואית של עובר אפרוח שימשו כדי לחקור את ההשפעה העיכובית והאנטי-אנגיוגנזה של פורמולת Sanleng Jiashen על התפשטות ממאירה של רקמת סרטן הכבד. הנתונים מראים כי נוסחת Sanleng Jiashen יכולה להתנגד ביעילות להתפשטות הממאירה של רקמת סרטן הכבד, המתבטאת בהפחתת נפח מסת הגידול, שיפור הנזק הפתולוגי ורמות נמוכות יותר של סמן הסרטן ki67.
העיכוב המעולה של אנגיוגנזה מצביע גם על כך שלנוסחת Sanleng Jiashen עשוי להיות פוטנציאל לטפל ולמנוע התקדמות והידרדרות של סרטן הכבד. כל תוכנית הניסוי מציגה תהליך מקיף של מרכיבי הרפואה הסינית המסורתית בטיפול בסרטן הכבד של עכברים, המספק התייחסות להקמה ואופטימיזציה של מודל סרטן הכבד, כמו גם מחקר ופיתוח של תרופות למניעה וטיפול בסרטן הכבד.
סרטן הכבד הוא סרטן קטלני שמקורו בכבד והוא הגורם השני בשכיחותו למוות הקשור לסרטן ברחבי העולם1. שיעורי מחלות הכבד בארצות הברית ובכמה מדינות מתפתחות מראים רמות גבוהות, ויכולים להיות יותר ממיליון מקרי סרטן כבד ברחבי העולם עד 20302. בשל הרגלי חיים לא בריאים כמו עישון, השמנת יתר ושתייה, והנזקים של הפטיטיס B, הפטיטיס C ווירוסים אחרים, השכיחות והתמותה של סרטן הכבד עלו משמעותית משנה לשנההשלישית. כגידול ממאיר הטרוגני עם מאפיינים היסטולוגיים שונים ופרוגנוזה גרועה, לסרטן הכבד יש מגוון רחב מאוד של שכיחות, כולל קרצינומה של הכבד, כולנגיוקרצינומה תוך כבדית וסרטן כבד פיברולמלרי4. סרטן הכבד מאובחן לרוב בשלב מתקדם, וחולים מתקדמים רבים אינם מועמדים לטיפול בקרינה5. מעכב המולטי-קינאז סורפניב היא תרופה מקובלת מאוד לחולים עם סרטן כבד מתקדם, אך חולים מפתחים לעתים קרובות עמידות משמעותית תוך תקופה קצרה6. נכון לעכשיו, מעכבי מחסום חיסוני PD-1 ו-PD-L1 בשילוב עם סורפניב עשו התקדמות מסוימת בשליטה על התפתחות סרטן הכבד, אך ההשפעה הטיפולית עדיין שנויה במחלוקת7.
סרטן כבד אורתוטופי הוא סוג מוקדם של סרטן כבד: תאי סרטן לא התפשטו סביב רקמת הכבד או התרחשו גרורות בין איברים, ותפקוד הכבד אינו מושפע מאוד8. מכיוון שסרטן כבד אורתוטופי בדרך כלל אינו מופיע תסמיני אי נוחות ברורים, חלק מהחולים עשויים לסבול מכאבי כבד קלים, עייפות ותסמינים אחרים9. בפרקטיקה הקלינית, אולטרסאונד דופלר צבעוני של הכבד ובדיקת טומוגרפיה ממוחשבת משופרת יכולים לאבחן נגעים משמעותיים תופסי מקום בכבד10. למרות שסרטן הכבד המקומי שלא התפשט ושלח גרורות ניתן להסרה בניתוח, ישנם סיכונים כירורגיים מסוימים והנטל הפסיכולוגי הבלתי נמנע עבור החולים11. כימותרפיה יכולה להרוג את כל תאי סרטן הכבד או חלקם, ודיכוי חיסוני ארוך טווח בחולים עם תרופות עלול להשפיע על יעילות הטיפול ולהגביר את הסיכון למחלות אחרות12. לכן, חיפוש אחר טיפול תרופתי בטוח ויעיל למניעה וטיפול מוקדם בסרטן הכבד הוא המפתח לבלימת ההתקדמות וההידרדרות של סרטן הכבד.
עקרון הרפואה הסינית המטפלת בסרטן הכבד מבוסס על תפיסת האיזון וההרמוניה בתוך הגוף. הרפואה הסינית רואה בסרטן הכבד חוסר איזון או חוסר הרמוניה באנרגיית הגוף, המכונה צ'י, המשפיע על הכבד13. הטיפול ברפואה סינית בסרטן הכבד כולל גישות שונות, כולל רפואת צמחים, דיקור, טיפול תזונתי והמלצות לאורח חיים. העיקרון הוא להחזיר את האיזון של הצ'י, לחזק את מנגנוני ההגנה של הגוף ולקדם את יכולת הגוף לרפא את עצמו14,15. סרטן הכבד ברפואה הסינית המסורתית שייך לקטגוריית "טימפניטים" ו"צבירת כבד". כבר ב"קאנון הפנימי של הואנגדי" יש תיעוד מפורט של הסימפטומים שלו, סרטן הכבד נגרם על ידי קיפאון דם ומחסור בג'נגצ'י ומטופל על ידי הסרת קיפאון דם, סילוק טימפניטים וחיזוק התנגדות הגוף לגיבוש החוקה13. מקורה של גלולת סנלנג בספר "Weisheng Baojian" שנכתב על ידי לואו טיאן-יי, רופא מפורסם בשושלת יואן. הוא מורכב משלושה סוגים של תרופות: Sparganium stoloni erum, Buch. -שינקן. (Sanleng), Ligusticum chuanxiong Hort. (Chuanxiong) ו-Rheum officinale Baill. (ריבס). שלושת סוגי התרופות הללו יכולים להיכנס למרידיאן הכבד ויש להם ערך טיפולי לטיפול בסרטן הכבד14. נוסחת Sanleng Jiashen מורכבת מ-16 גרם של Sanleng, 16 גרם של Panax ginseng C.A.Mey. (ג'ינסנג), 8 גרם ריבס ו-2 גרם צ'ואן-שיונג (איור 1), שנקבע לחיזוק הכבד, לניקוי חום, לסילוק רעלים ולקידום זרימת הדם. מאמינים כי לצמחי מרפא אלה יש תכונות אנטי סרטניות ועוזרים להפחית את צמיחת הגידול, להקל על התסמינים ולשפר את הרווחה הכללית. בניסויים הקודמים במבחנה, נוסחת Sanleng Jiashen יכולה לעכב את התפשטות תאי סרטן הכבד15. עם זאת, כיצד להעריך את ההשפעה המעכבת של תרכובות צמחים סיניות על סרטן הכבד ביעילות ובסבירות? על ידי הקמת מודל סרטן כבד ממוקד של עכבר BALB/c-nu, ההשפעה המעכבת של נוסחת Sanleng Jiashen על סרטן הכבד ואנגיוגנזה נחקרה בעיקר באמצעות הדמיה חיה של בעלי חיים קטנים ובדיקת ממברנה כוריואלנטואית של עובר אפרוח.
עכברים עירומים זכרים BALB/c-nu שהיו נטולי פתוגנים ספציפיים, בני 5 שבועות ובמשקל 18-22 גרם הוזנו במרכז הניסויים לבעלי חיים של המכללה הרפואית לטרנספורמציה של אוניברסיטת ג'ילין; תנאי ההזנה היו 22-24 מעלות צלזיוס עם 40%-60% לחות יחסית. מספר הרישיון של חיית הניסוי הוא SYXK(Ji) 2018-0006, ותהליך הניסוי תואם את הכללים והתקנות של ועדת האתיקה של אוניברסיטת ג'ילין, ומספר אישור האתיקה של בעלי חיים הוא 20221228-01.
1. הכנת פורמולת Sanleng Jiashen מיובשת בהקפאה15
2. בניית קו תאים HCCLM3 המבטא לוציפראז ביציבות16
3. הקמת מודל עכברים עירומים BALB/c-nu של סרטן הכבד באתרו וטיפול 15
4. הערכת הדמיה in vivo
הערה: ביום ה-14 בוצעה הדמיה חיה שעה לאחר סיום המתן.
5. צביעת המטוקסילין-אאוזין17
6. צביעה אימונוהיסטוכימית18
7. בדיקת ממברנה כוריואלנטואית של עובר אפרוח19
כפי שמוצג באיור 2A, ביססנו מודל סרטן כבד ממוקד של עכברי BALB/c-nu והערכנו את ההשפעה האנטי-גידולית של נוסחת Sanleng Jiashen. איור 2B מציג כי נוסחת Sanleng Jiashen יכולה לדכא באופן משמעותי את הצמיחה של גידולי כבד. התוצאות הפתולוגיות הצביעו על כך שבהשוואה לק...
כמות גדולה של ראיות אישרה כי לסנלנג, ג'ינסנג, ריבס וצ'ואן-שיונג בנוסחת סנלנג ג'יאשן יש השפעות פרמקולוגיות על הטיפול בסרטן הכבד. מחקרים הראו כי Sanleng יכול לעכב באופן משמעותי את התפשטותם וצמיחתם של תאי גידול כדי למנוע פלישת תאי גידול וגרורות, לגרום לאפופטוזיס של תאים ולווסת א...
למחברים אין מה לחשוף.
עבודה זו נתמכה על ידי הקרן לפילוסופיה ומדעי החברה של סין (20VYJ070), הפרויקט של מחלקת החינוך המחוזית של ג'ילין (JJKH20230963KJ), והקבוצה השנייה של פרויקט ההנדסה של חוקרי שינגלין באוניברסיטת צ'אנגצ'ון לרפואה סינית (QNKXJ2-2021+ZR25).
Name | Company | Catalog Number | Comments |
0.25% trypsin solution | HyClone, America | SH30042.01B | |
1 mL disposable syringe | Mingankang Medical Equipment Co., Ltd., China | RWSB | |
1% Penicillin & streptomycin solution | Hyclone, America | SV30010 | |
1.5 mL centrifuge tube | Corning, America | MCT-150-C-S | |
12 cm needle forceps | Hesdick, China | HKQS-211 | |
6-0 surgical sutures | Shanghai Jinhuan Medical Equipment Co., Ltd., Shanghai, China | CR631 | |
75% alcohol | Sichuan Youbang Enterprise Co., Ltd., Sichuan, China | 1.00009E+11 | |
96-well plates | NEST, China | 701001 | |
Acetone | Tianjin Dingfu Chemical General Plant, Tianjin, China | GB686-89 | |
BALB/c-nu male nude mice | Beijing Weitonglihua Experimental Animal Technology Co., Ltd., Beijing, China | SYXK(Ji) 2018-0006 | |
Biological tissue baking machine | Leica, Germany | Leica HI1220 | |
Cell culture dish | NEST, China | NEST.706001 | |
Citric acid solution | Wuhan Canos Technology Co., Ltd., Wuhan, China | sj1074 | |
D-luciferin | Gold Biotechnology®, Inc., China | LUCK-100 | |
DMEM | Hyclone, America | SH30243.01 | |
Egg illuminator | Shandong Weizhen Incubation Equipment Company, Shandong, China | WZSDT | |
Eosin staining solution | Hunan BKMAM Biotechnology Co., Ltd., Hunan, China | 110703061 | |
Erythromycin eye ointment | Cisen Pharmaceutical Co., Ltd., Shanghai, China | H37022025 | |
Fetal bovine serum | Clark, America | FB25015 | |
Fully automatic intelligent chick incubator | Shandong Weizhen Incubation Equipment Company, Shandong, China | 29538 | |
GFP lentivirus solution | Suzhou GenePharma Co.,Ltd., Suzhou, China | F22AZ | |
Goat serum | Shenyang Wanlei Biotechnology Co., Ltd., Shengyang, China | WLA067 | |
Hand-held mouse skull drill | STRONGWT, China | 190 | |
HCCLM3 cell line | WheLab, Shanghai, China | C1010 | |
Heating pad | Zhongke Life Technology Co., Ltd., Hangzhou, China | GEJRD-10W | |
Hematoxylin | Hunan BKMAM Biotechnology Co., Ltd., Hunan, China | B-YH250-1 | |
Intelligent decoction pot | Hangzhou Jiuyang living Appliance Co., Ltd., Hangzhou, China | 3003BQ | |
Inverted fluorescence microscope | Olympus, Japan | IX73 | |
ki67 primary antibody | Wuhan Servicebio Technology Co., Ltd., Wuhan, China | GB121141-100 | |
Lodophor disinfectant | Cofoe Medical Technology Co.,Ltd., Hunan, China | 202110073 | |
Luciferase | Suzhou GenePharma Co.,Ltd., Suzhou, China | E26JZ | |
Matrix glue | Corning, America | 356234 | |
Medical gauze | Yunnan Chenye Biotechnology Co., Ltd., Yunnan, China | 71712049971 | |
Methanol | Guangdong Guanghua Sci-Tech Co., Ltd., Guangdong, China | 1.17001.023 | |
Ophthalmic scissor | Hesdick, China | HKQS-209 | |
Ophthalmic tweezer | Hesdick, China | HKCL-20 | |
Paraffin embedding machine | Leica, Germany | EG1150H | |
Paraffin slicing machine | Leica, Germany | Leica CM1950 | |
Paraformaldehyde | Biosharp, China | BL539A | |
PBS buffer | Wuhan Servicebio Technology Co., Ltd., Wuhan, China | G2156-1L | |
Puromycin | Beijing Solarbio Science & Technology Co., Ltd., Beijing, China | P8230 | |
Refrigerator | Thermo Scientific, America | TDE40086FV-ULTS | |
Scalpel | Hesdick, China | HKCL-93 | |
Secondary antibody | Wuhan Servicebio Technology Co., Ltd., Wuhan, China | GB23301 | |
Small animal live imaging system | Caliper Life Sciences, America | IVIS Lumina XR | |
Sorafenib | Shanghai Aladdin Biochemical Technology Co., Ltd., Shanghai, China | 284461-73-0 | |
Transparent dressing | 3M, America | 9534HP | |
Triton X-100 | Beijing Solarbio Science & Technology Co., Ltd., Beijing, China | T8200 | |
Vacuum freeze dryer | Ningbo Xinzhi Biotechnology Co., Ltd., Ningbo, China | sz-10N | |
White feather chicken eggs | Shandong Haotai Experimental Animal Breeding Co., Ltd., Shandong, China | SCXK(Lu) 20180004 | |
Xylene | Sigma-Aldrich, , America | 534056 |
Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article
Request PermissionThis article has been published
Video Coming Soon
Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved