JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • תוצאות
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

כאן, אנו מציגים את הפרוטוקול שלב אחר שלב לחקירת ההשפעות הטיפוליות ומעכבות כלי הדם של נוסחת Sanleng Jiashen על עכברי BALB/c-nu עם קרצינומה הפטו-תאית אורתוטופית.

Abstract

הקטלניות של סרטן הכבד והעמידות לתרופות כימיות אילצו את החיפוש אחר מרשמים יעילים של צמחי מרפא מסורתיים לסרטן הכבד. מודלים של בעלי חיים הניתנים לחזרה, קלים למניפולציה ומחקים מאוד את התהליכים הפתופיזיולוגיים של סרטן הכבד הם תנאי מוקדם לסינון מוצלח של מועמדים יעילים לתרופות. בינתיים, אינדיקטורים ואמצעים אמינים להערכת יעילות תרופות הם גם הערובה למחקר ופיתוח תרופות נגד סרטן הכבד.

נוסחת Sanleng Jiashen, מרשם מייצג של רפואה סינית מסורתית המכילה Sparganium stoloni erum, Buch. -שינקן. (Sanleng), Panax ginseng C. A. Mey. (ג'ינסנג), Rheum officinale Baill. (ריבס), ו-Ligusticum chuanxiong Hort. (Chuanxiong), נקבעים כדי להזין את הכבד ולנקות חום, להסיר רעלים ולקדם את זרימת הדם לטיפול בסרטן הכבד. פרוטוקול ניסיוני זה מתאר את הכנת פורמולת Sanleng Jiashen שעברה ליופיליזציה ואת תהליך ההקמה של סרטן כבד במקום בעכברי BALB/c-nu. צביעה היסטופתולוגית, זיהוי אימונוהיסטוכימי של סמני סרטן, הדמיה in vivo של עכברים ובדיקת ממברנה כוריואלנטואית של עובר אפרוח שימשו כדי לחקור את ההשפעה העיכובית והאנטי-אנגיוגנזה של פורמולת Sanleng Jiashen על התפשטות ממאירה של רקמת סרטן הכבד. הנתונים מראים כי נוסחת Sanleng Jiashen יכולה להתנגד ביעילות להתפשטות הממאירה של רקמת סרטן הכבד, המתבטאת בהפחתת נפח מסת הגידול, שיפור הנזק הפתולוגי ורמות נמוכות יותר של סמן הסרטן ki67.

העיכוב המעולה של אנגיוגנזה מצביע גם על כך שלנוסחת Sanleng Jiashen עשוי להיות פוטנציאל לטפל ולמנוע התקדמות והידרדרות של סרטן הכבד. כל תוכנית הניסוי מציגה תהליך מקיף של מרכיבי הרפואה הסינית המסורתית בטיפול בסרטן הכבד של עכברים, המספק התייחסות להקמה ואופטימיזציה של מודל סרטן הכבד, כמו גם מחקר ופיתוח של תרופות למניעה וטיפול בסרטן הכבד.

Introduction

סרטן הכבד הוא סרטן קטלני שמקורו בכבד והוא הגורם השני בשכיחותו למוות הקשור לסרטן ברחבי העולם1. שיעורי מחלות הכבד בארצות הברית ובכמה מדינות מתפתחות מראים רמות גבוהות, ויכולים להיות יותר ממיליון מקרי סרטן כבד ברחבי העולם עד 20302. בשל הרגלי חיים לא בריאים כמו עישון, השמנת יתר ושתייה, והנזקים של הפטיטיס B, הפטיטיס C ווירוסים אחרים, השכיחות והתמותה של סרטן הכבד עלו משמעותית משנה לשנההשלישית. כגידול ממאיר הטרוגני עם מאפיינים היסטולוגיים שונים ופרוגנוזה גרועה, לסרטן הכבד יש מגוון רחב מאוד של שכיחות, כולל קרצינומה של הכבד, כולנגיוקרצינומה תוך כבדית וסרטן כבד פיברולמלרי4. סרטן הכבד מאובחן לרוב בשלב מתקדם, וחולים מתקדמים רבים אינם מועמדים לטיפול בקרינה5. מעכב המולטי-קינאז סורפניב היא תרופה מקובלת מאוד לחולים עם סרטן כבד מתקדם, אך חולים מפתחים לעתים קרובות עמידות משמעותית תוך תקופה קצרה6. נכון לעכשיו, מעכבי מחסום חיסוני PD-1 ו-PD-L1 בשילוב עם סורפניב עשו התקדמות מסוימת בשליטה על התפתחות סרטן הכבד, אך ההשפעה הטיפולית עדיין שנויה במחלוקת7.

סרטן כבד אורתוטופי הוא סוג מוקדם של סרטן כבד: תאי סרטן לא התפשטו סביב רקמת הכבד או התרחשו גרורות בין איברים, ותפקוד הכבד אינו מושפע מאוד8. מכיוון שסרטן כבד אורתוטופי בדרך כלל אינו מופיע תסמיני אי נוחות ברורים, חלק מהחולים עשויים לסבול מכאבי כבד קלים, עייפות ותסמינים אחרים9. בפרקטיקה הקלינית, אולטרסאונד דופלר צבעוני של הכבד ובדיקת טומוגרפיה ממוחשבת משופרת יכולים לאבחן נגעים משמעותיים תופסי מקום בכבד10. למרות שסרטן הכבד המקומי שלא התפשט ושלח גרורות ניתן להסרה בניתוח, ישנם סיכונים כירורגיים מסוימים והנטל הפסיכולוגי הבלתי נמנע עבור החולים11. כימותרפיה יכולה להרוג את כל תאי סרטן הכבד או חלקם, ודיכוי חיסוני ארוך טווח בחולים עם תרופות עלול להשפיע על יעילות הטיפול ולהגביר את הסיכון למחלות אחרות12. לכן, חיפוש אחר טיפול תרופתי בטוח ויעיל למניעה וטיפול מוקדם בסרטן הכבד הוא המפתח לבלימת ההתקדמות וההידרדרות של סרטן הכבד.

עקרון הרפואה הסינית המטפלת בסרטן הכבד מבוסס על תפיסת האיזון וההרמוניה בתוך הגוף. הרפואה הסינית רואה בסרטן הכבד חוסר איזון או חוסר הרמוניה באנרגיית הגוף, המכונה צ'י, המשפיע על הכבד13. הטיפול ברפואה סינית בסרטן הכבד כולל גישות שונות, כולל רפואת צמחים, דיקור, טיפול תזונתי והמלצות לאורח חיים. העיקרון הוא להחזיר את האיזון של הצ'י, לחזק את מנגנוני ההגנה של הגוף ולקדם את יכולת הגוף לרפא את עצמו14,15. סרטן הכבד ברפואה הסינית המסורתית שייך לקטגוריית "טימפניטים" ו"צבירת כבד". כבר ב"קאנון הפנימי של הואנגדי" יש תיעוד מפורט של הסימפטומים שלו, סרטן הכבד נגרם על ידי קיפאון דם ומחסור בג'נגצ'י ומטופל על ידי הסרת קיפאון דם, סילוק טימפניטים וחיזוק התנגדות הגוף לגיבוש החוקה13. מקורה של גלולת סנלנג בספר "Weisheng Baojian" שנכתב על ידי לואו טיאן-יי, רופא מפורסם בשושלת יואן. הוא מורכב משלושה סוגים של תרופות: Sparganium stoloni erum, Buch. -שינקן. (Sanleng), Ligusticum chuanxiong Hort. (Chuanxiong) ו-Rheum officinale Baill. (ריבס). שלושת סוגי התרופות הללו יכולים להיכנס למרידיאן הכבד ויש להם ערך טיפולי לטיפול בסרטן הכבד14. נוסחת Sanleng Jiashen מורכבת מ-16 גרם של Sanleng, 16 גרם של Panax ginseng C.A.Mey. (ג'ינסנג), 8 גרם ריבס ו-2 גרם צ'ואן-שיונג (איור 1), שנקבע לחיזוק הכבד, לניקוי חום, לסילוק רעלים ולקידום זרימת הדם. מאמינים כי לצמחי מרפא אלה יש תכונות אנטי סרטניות ועוזרים להפחית את צמיחת הגידול, להקל על התסמינים ולשפר את הרווחה הכללית. בניסויים הקודמים במבחנה, נוסחת Sanleng Jiashen יכולה לעכב את התפשטות תאי סרטן הכבד15. עם זאת, כיצד להעריך את ההשפעה המעכבת של תרכובות צמחים סיניות על סרטן הכבד ביעילות ובסבירות? על ידי הקמת מודל סרטן כבד ממוקד של עכבר BALB/c-nu, ההשפעה המעכבת של נוסחת Sanleng Jiashen על סרטן הכבד ואנגיוגנזה נחקרה בעיקר באמצעות הדמיה חיה של בעלי חיים קטנים ובדיקת ממברנה כוריואלנטואית של עובר אפרוח.

Protocol

עכברים עירומים זכרים BALB/c-nu שהיו נטולי פתוגנים ספציפיים, בני 5 שבועות ובמשקל 18-22 גרם הוזנו במרכז הניסויים לבעלי חיים של המכללה הרפואית לטרנספורמציה של אוניברסיטת ג'ילין; תנאי ההזנה היו 22-24 מעלות צלזיוס עם 40%-60% לחות יחסית. מספר הרישיון של חיית הניסוי הוא SYXK(Ji) 2018-0006, ותהליך הניסוי תואם את הכללים והתקנות של ועדת האתיקה של אוניברסיטת ג'ילין, ומספר אישור האתיקה של בעלי חיים הוא 20221228-01.

1. הכנת פורמולת Sanleng Jiashen מיובשת בהקפאה15

  1. מניחים 16 גרם סנלנג, 16 גרם ג'ינסנג, 8 גרם ריבס ו -2 גרם צ'ואן-שיונג בסיר מרתח אינטליגנטי (ראה טבלת חומרים) ומשרים ב -294 מ"ל מים נטולי יונים בטמפרטורת החדר למשך 30 דקות. לאחר החימום והרתיחה ממשיכים לבשל 30 דקות בחום של 100 מעלות צלזיוס, ומסננים את הנוזל דרך גזה רפואית כפולה (ראה טבלת חומרים). מוסיפים לשאריות 252 מ"ל מים נטולי יונים, מבשלים 30 דקות בחום של 100 מעלות צלזיוס ומסננים את הנוזל בגזה כפולה.
  2. אוספים את המסנן משלב 1.1 בכלי נירוסטה נקי ומקפיאים למשך 12 שעות בחום של -80 מעלות צלזיוס (ראה טבלת חומרים).
  3. הנח את נוסחת Sanleng Jiashen משלב 1.2 במייבש הקפאה בוואקום (ראה טבלת חומרים) (טמפרטורת מלכודת קרה: -55 מעלות צלזיוס) וייבש במשך 48 שעות כדי לקבל את האבקה המיובשת בהקפאה של נוסחת Sanleng Jiashen.

2. בניית קו תאים HCCLM3 המבטא לוציפראז ביציבות16

  1. הוסף 1.0 מ"ל של תרחיף תאים HCCLM3 בצלחת של 24 בארות (ראה טבלת חומרים) עם 5 × 105 תאים לבאר ותרבית במדיום שלם (10% סרום בקר עוברי + 1% תמיסת פניצילין-סטרפטומיצין + DMEM) (ראה טבלת חומרים) המכיל 3 מיקרוגרם/מ"ל פורומיצין למשך 72 שעות בחממת תאים (37 מעלות צלזיוס, 5% CO2, ראה טבלת חומרים).
  2. השליכו את הסופרנטנט של התא בשלב 2.1, והוסיפו 100 מיקרוליטר של תמיסת טריפסין של 0.25% כדי לעכל את התאים בחממת תאים למשך דקה אחת (ראו טבלת חומרים). הוסף 300 מיקרוליטר של מדיום שלם והשתמש בפיפטה כדי לשחרר את התאים הדבקים ולהפסיק את העיכול. אוספים את כל מתלי התאים ומניחים אותם בצינור צנטריפוגה של 15 מ"ל בטמפרטורת החדר בטמפרטורה של 1,000 × גרם למשך 5 דקות. לאחר השלכת הסופרנטנט, מוסיפים 1 מ"ל של מדיום שלם ומערבבים על ידי פיפטינג.
  3. הוסף 100 מיקרוליטר של תרחיף תאים של 4 ×10 3 תאי HCCLM3 / באר משלב 2.2 לצלחת של 96 בארות ותרבית בחממת תאים למשך 24 שעות (37 מעלות צלזיוס, 5% CO2, ראה טבלת חומרים).
  4. הוסף 0.27 מיקרוליטר של GFP lentivirus לצלחות 96 הבארות בשלב 2.3 ותרבית בחממת תאים למשך 15 שעות (37 מעלות צלזיוס, 5% CO2, ראה טבלת חומרים). השליכו את הסופרנטנט של התא, הוסיפו 100 מיקרוליטר של מדיום תרבית שלם, ורכשו תמונות באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי באורך גל עירור של 488 ננומטר ואורך גל פליטה של 507 ננומטר (ראה טבלת חומרים).
  5. יש להחליף 2 מ"ל של GFP lentivirus ולהמשיך בתרבית למשך 24 שעות. החלף 2 מ"ל של מדיום תרבית שלם ללא GFP lentivirus למשך 24 שעות נוספות.
    הערה: יעילות הטרנספקציה של GFP lentivirus לתאי HCCLM3 הייתה 80% כפי שנראה במיקרוסקופ פלואורסצנטי הפוך.
  6. הוסף 5 מ"ל של תרחיף 2 × 105 תאים משלב 2.1 לצלחת פטרי 60 מ"מ ותרבית בחממת תאים למשך 24 שעות. הוסף 64.5 מיקרוליטר של לוציפראז, והמשך לתרבית בחממת תאים למשך 15 שעות (37 מעלות צלזיוס, 5% CO2, ראה טבלת חומרים).
  7. השליכו את הסופרנטנט והוסיפו 5 מ"ל של מדיום שלם כדי להמשיך בתרבית עד שהתאים יהפכו ל-90% בצלחת הפטרי. השליכו את הסופרנטנט של התאים, שטפו עם 2 x 1 מ"ל של PBS, והוסיפו 1 מ"ל של תמיסת טריפסין של 0.25% כדי לעכל את התאים בחממת תאים למשך דקה אחת (37 מעלות צלזיוס, 5% CO2, ראו טבלת חומרים). הוסף 3 מ"ל של מדיום שלם ופיפטה למעלה ולמטה כדי לשחרר תאים דבקים ולסיים את העיכול. אסוף את כל תרחיפי התאים להזרקת עכבר לאחר מכן.
    הערה: כדי להשיג מספר מספיק של תאים, התאים עברו ותרבו ברציפות.

3. הקמת מודל עכברים עירומים BALB/c-nu של סרטן הכבד באתרו וטיפול 15

  1. הוסף 100 מיקרוליטר של 1 × 107 תאי HCCLM3 שהועברו עם לוציפראז בשלב 2.7 ו-100 מיקרוליטר של דבק מטריצה (ראה טבלת חומרים) לתוך צינור צנטריפוגה של 1.5 מ"ל (ראה טבלת חומרים), וערבב קלות עם פיפטה של 1 מ"ל (ראה טבלת חומרים).
    הערה: כל תהליך הכנת התמיסה חייב להתבצע על קרח כדי למנוע את ריפוי דבק המטריצה.
  2. לחטא את בתי השחי השמאלי והימני של עכברים עירומים BALB/c-nu ביודופן (ראה טבלת חומרים) ולהסיר יוד באלכוהול (ראה טבלת חומרים).
  3. הזרקו לאט 100 מיקרוליטר מתערובת תאי HCCLM3 ודבק מטריצה משלב 3.1 לבתי השחי השמאלי והימני של עכברי BALB/c-nu עירומים עם מזרק חד פעמי של 1 מ"ל.
    הערה: לאחר כ-10 ימים, עכברי BALB/c-nu עירומים פיתחו מסת גידול של כ-0.5ס" מ 3 באתר ההזרקה הדו-צדדית לבית השחי.
  4. להרדים עכברים עירומים BALB/c-nu בשלב 3.3 על ידי הזרקה תוך-צפקית של 1%, 50 מ"ג/ק"ג נתרן פנטוברביטל. חותכים את העור של שני בתי השחי בעזרת מספריים ופינצטה עיניים (ראה טבלת חומרים), ומקלפים בעדינות את מסת הגידול התת עורית כדי להניח אותה בצלחת תרבית תאים (ראה טבלת חומרים) המכילה מאגר PBS מקורר מראש (ראה טבלת חומרים), וחתוך אותו ל-1 מ"מ3 חתיכות בעזרת אזמל (ראה טבלת חומרים).
    הערה: יש לקצור את מסת הגידול בבית השחי של עכברים עירומים BALB/c-nu על קרח תוך 0.5 שעות כדי לשמור על פעילות תאי הגידול ולהגדיל את שיעור ההצלחה של המודל. בתום הדגימה, העכברים נהרגו על ידי הסרת חוליות צוואר הרחם. אם יש חלק נמק של הגידול, יש להסירו, ולהשאיר רק את הגידול הלבן של הדג כדי למנוע זיהום במהלך השתלת הסרטן האורתוטופית.
  5. להרדים עכברים עירומים BALB/c-nu עם 1%, 50 מ"ג/ק"ג נתרן פנטוברביטל תוך צפקי (ראה טבלת חומרים), לחטא את הבטן ביוד (ראה טבלת חומרים), ולהסיר יוד באלכוהול (ראה טבלת חומרים).
  6. השתמש במספריים ופינצטה עיניים (ראה טבלת חומרים) כדי לחתוך חתך כירורגי של 45 מעלות כ-1 ס"מ במיקום של 0.5 ס"מ מתחת לתהליך ה-xiphoid כדי לחשוף את הכבד, לחץ בעדינות על הכבד כדי לסחוט רקמת כבד ולקבע את הכבד בנייר שקילה.
    הערה: ניתן להניח צמר גפן או מקלות מתחת לצלעות של עכברים כדי לחשוף את הכבד ביעילות.
  7. קח חתיכה קטנה של רקמת גידול בשלב 3.4 עם מחט הזרקה חד פעמית של 10 מ"ל, והשתיל את מסת הגידול בכבד כ-0.5 ס"מ במקביל לכבד כדי לקבע אותה מתחת לקפסולת הכבד ולמשוך לאט את המחט.
    הערה: השתמש במזרק חד פעמי של 1 מ"ל כדי להפיל 2 טיפות מדבק המטריצה המומס, התבונן במסת הגידול ללא החלקות מקריות וללא דימום, ולאחר מכן תפר את החתך הניתוחי.
  8. סגור את החתך הניתוחי עם מחט 12 ס"מ המחזיקה מלקחיים ותפרים כירורגיים 6-0 (ראה טבלת חומרים). יש למרוח משחת עיניים אריתרומיצין (ראה טבלת חומרים) על מקום הניתוח כדי למנוע זיהום. הניחו את העכברים על כרית מחוממת (ראו טבלת חומרים) ושמרו אותם בכלובים נפרדים לאחר ההתעוררות.
  9. החל מהיום הראשון לאחר הדוגמנות, יש לתת לעכברים 7.5 מ"ג/ק"ג סורפניב ופורמולה של סנלנג ג'יאשן (7.8 גרם/ק"ג, 15.6 גרם/ק"ג ו-31.2 גרם/ק"ג) באמצעות גבאג' לעכברים משלב 3.8 למשך 14 יום, פעם ביום. לתת נפח שווה של מי מלח רגילים לעכברים בקבוצת המודל.

4. הערכת הדמיה in vivo

הערה: ביום ה-14 בוצעה הדמיה חיה שעה לאחר סיום המתן.

  1. הפעל את המחשב ומכשיר הדמיה in vivo (ראה טבלת חומרים). לחץ פעמיים על סמל התמונה החיה בשולחן העבודה כדי להפעיל את התוכנית. לחץ על אתחול מערכת IVIS בלוח הבקרה כדי להפעיל את כל מערכת IVIS.
    הערה: לאחר השלמת הבדיקה העצמית של המכשיר, נורית מצב הטמפרטורה בלוח הבקרה אדומה. המתן כ-5-10 דקות לאחר שהטמפרטורה יורדת והאור הופך לירוק, ניתן לבצע רכישת תמונה.
  2. יש לחטא את בטן העכברים באלכוהול ולהזריק תוך צפקית 10 מיקרוליטר D-לוציפרין לכל גרם משקל גוף (ראה טבלת חומרים) עם מזרק חד פעמי. להרדים עכברים על ידי הזרקה תוך צפקית של 1%, 50 מ"ג/ק"ג נתרן פנטוברביטל.
    הערה: D-לוציפרין דולל ב-PBS סטרילי ל-15 מ"ג/מ"ל.
  3. הכניסו את העכברים המורדמים בשלב 4.3 לתיבת התצפית וסגרו את הדלת, הגדירו את זמן החשיפה כ-30 שניות בלוח הבקרה: בחירת מצב: בחר זוהר בהתאם לסוג הדגימה, בחר תוכנית אוטומטית כברירת מחדל ולחץ על רכישה כדי לרכוש תמונות.
  4. לחץ על שמור נתוני תמונה חיים, בחר את כל קבצי נתוני התמונה החיים ושמור אותם על שולחן העבודה של המחשב.
  5. לחץ על יציאה בתמונה חיה במסך הראשי. כבה את מתח המצלמה, את מתח מכשיר ההדמיה ואת מתח המחשב בתורם.
  6. לאחר ההדמיה, המתת חסד של העכברים המורדמים (הזרקה תוך צפקית של 1%, 50 מ"ג/ק"ג נתרן פנטוברביטל) על ידי פריקת חוליות צוואר הרחם.

5. צביעת המטוקסילין-אאוזין17

  1. יש לתקן את רקמת הכבד הטרייה של עכברים משלב 4.7 ב-4% פרפורמלדהיד למשך 48 שעות, ולאחר מכן לשטוף במים זורמים 3 פעמים למשך 5 דקות בכל פעם כדי לשטוף את הפרפורמלדהיד (ראה טבלת חומרים).
  2. יבש את רקמות הכבד בשלב 5.1 ב 30% אתנול, 50% אתנול, 70% אתנול, 95% אתנול figure-protocol-9159, 95% אתנול figure-protocol-9259ואתנול נטול מים למשך שעה אחת בתורו (ראה טבלת חומרים).
  3. שים את רקמות הכבד המיובשות בשלב 5.2 עד 50% אתנול, 50% קסילן, קסילן figure-protocol-9495, קסילן figure-protocol-9591וקסילן figure-protocol-9686 ברצף כדי להפוך אותן לשקופות למשך שעה אחת (ראה טבלת חומרים).
    הערה: קסילן נדיף ורעיל, שלב זה מתבצע במכסה האדים.
  4. ממיסים את שעוות הפרפין ושומרים על הטמפרטורה על כ-55 מעלות צלזיוס. הנח את גושי רקמת הכבד בשלב 5.3 למכונת הטמעת פרפין (ראה טבלת חומרים) מלאה בתמיסת שעווה להטמעה.
  5. תקן את גוש השעווה המוטבע של רקמת כבד עכברים בשלב 5.4 על מכונת חיתוך הפרפין (ראה טבלת חומרים), חתוך אותו לפרוסות בעובי 5 מיקרומטר, הניח את הפרוסות שטוחות לחלוטין במים של 50 מעלות צלזיוס וגרף אותן בעזרת שקופית. לבסוף הכניסו אותם למכונת אפיית רקמות ביולוגית לייבוש 20 דקות ב-70 מעלות צלזיוס (ראה טבלת חומרים).
  6. משרים את חלקי 5 מיקרומטר בשלב 5.5 בקסילן figure-protocol-10495, קסילן figure-protocol-10591, אתנול figure-protocol-10687נטול מים ואתנול figure-protocol-10791 נטול מים למשך 10 דקות ברציפות, ואז משרים פנימה 95% אתנול, 90% אתנול, 80% אתנול ו-70% אתנול למשך 5 דקות בהתאמה, ולבסוף שוטפים במים מזוקקים לטיפול בהסרת שעווה (ראה טבלת חומרים).
  7. צבעו את חלקי רקמת הכבד המיובשים בעובי 5 מיקרומטר עם המטוקסילין למשך 8 דקות, ולאחר מכן שטפו במים זורמים.
  8. להבדיל בתמיסת חומצה הידרוכלורית 1% למשך 10 שניות, ולשטוף במים זורמים למשך 30 דקות (ראה טבלת חומרים).
  9. צבעו בתמיסת אאוזין של 0.5% למשך דקה אחת (ראו טבלת חומרים).
  10. הכניסו את הפרוסות ל-95% אלכוהול figure-protocol-11443, 95% אלכוהול figure-protocol-11545, אתנול figure-protocol-11641נטול מים , אתנול figure-protocol-11746נטול מים , קסילן figure-protocol-11851וקסילן figure-protocol-11946 למשך 5 דקות כל אחד להתייבשות (ראה טבלת חומרים).
  11. אטמו עם מסטיק ניטרלי, וצלמו תמונות תחת מיקרוסקופ אור הפוך (ראו טבלת חומרים).

6. צביעה אימונוהיסטוכימית18

  1. זרוק 1.5% H2O2 על חלקי 5 מיקרומטר של כבד העכבר בשלב 5.6 ודגר בטמפרטורת החדר למשך 10 דקות, ולאחר מכן שטוף עם PBS למשך 2 x 5 דקות (ראה טבלת חומרים).
  2. תיקון רקמות עם תמיסת חומצת לימון (ראה טבלת חומרים) למשך 5 דקות ושטיפה עם PBS למשך 3 x 5 דקות.
  3. דגירה עם 0.2% טריטון X-100 (ראה טבלת חומרים) בטמפרטורת החדר למשך 4 דקות, לאחר מכן דגירה עם 0.5% טריטון X-100 בטמפרטורת החדר למשך 4 דקות, ושטיפה עם PBS.
  4. הוסיפו סרום עיזים (ראו טבלת חומרים) כדי לאטום למשך 15 דקות, ולאחר מכן הוסיפו את הנוגדן הראשוני ki67 (ראו טבלת חומרים) מדולל ב-PBS (1:300) כדי לדגור בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס למשך הלילה. שטפו עם PBS למשך 3 x 5 דקות.
  5. יש לדגור עם נוגדן משני מדולל ב-PBS (1:200) בטמפרטורת החדר למשך שעה, ולשטוף עם PBS למשך 3 x 5 דקות (ראה טבלת חומרים).
  6. יש לצבוע בתמיסה המתפתחת למשך 5 דקות ולשטוף במים מזוקקים כפולים (ראה טבלת חומרים).
  7. יש לצבוע מחדש עם המטוקסילין למשך 2 דקות, להבדיל בתמיסת חומצה הידרוכלורית 1% למשך 10 שניות, ולשטוף במים זורמים למשך 30 דקות (ראה טבלת חומרים).
  8. הכניסו את הפרוסות ל-95% אלכוהול figure-protocol-13531, 95% אלכוהול figure-protocol-13633, אתנול figure-protocol-13729נטול מים , אתנול figure-protocol-13834נטול מים , קסילן figure-protocol-13939וקסילן figure-protocol-14034 למשך 5 דקות כל אחד להתייבשות (ראה טבלת חומרים).
  9. אטמו עם מסטיק ניטרלי וצלמו תמונות תחת מיקרוסקופ אור הפוך (ראו טבלת חומרים).

7. בדיקת ממברנה כוריואלנטואית של עובר אפרוח19

  1. השאירו את ביצי העוף הלבנות (ראו טבלת חומרים) בטמפרטורת החדר למשך שעתיים ורססו באלכוהול לחיטוי. קדחו חור בתא האוויר בעזרת מקדחת גולגולת (ראו טבלת חומרים), ודגרו את הביצים עם תא האוויר למשך 7 ימים (טמפרטורת הדגירה 37.8-38.2 מעלות צלזיוס ולחות יחסית 65%).
    הערה: במהלך 3 הימים הראשונים של הדגירה, כפתור סיבוב הביציות האוטומטי מופעל כדי למנוע מהממברנה הכוריואלנטואית של עובר הגוזל להיצמד לקליפה וליצור תא אוויר כוזב.
  2. השליכו את הביצים החלשות/לא מופרות במאיר הביצים (ראו טבלת חומרים). קלף חלון בגודל 1X1 ס"מ בזהירות בעזרת פינצטה לעיניים (ראה טבלת חומרים) לאחר קידוח חור בתא האוויר המזויף בעזרת מקדחת גולגולת (ראה טבלת חומרים).
    הערה: שימו לב שקליפת הביצה לא צריכה ליפול לתוך הממברנה הכוריואלנטואית של עובר הגוזל.
  3. ביום 8 של הדגירה, הוסף 100 מיקרוליטר של תרחיף תאי גידול (1 × 106 תאים) לכל ביצה מתא האוויר המזויף למעט קבוצת הביקורת. בקבוצות התרופות מוסיפים 100 מיקרוליטר של תמיסת סורפניב ונוסחת Sanleng Jiashen. בקבוצות הבקרה והמודל, הוסף 100 מיקרוליטר של PBS.
    הערה: תרחיף תאי הגידול מורכב מתאי HCCLM3 ודבק מטריצה בנפח שווה. ריכוז התרופה נקבע כדלקמן: 7.5 מ"ג/ק"ג סורפניב ופורמולת Sanleng Jiashen (7.8 גרם/ק"ג, 15.6 גרם/ק"ג ו-31.2 גרם/ק"ג).
  4. מכסים את החלון בתחבושת שקופה (ראה טבלת חומרים) ומחטאים בתרסיס אלכוהול (ראה טבלת חומרים). לאחר 7 ימי דגירה, הסר את התחבושת השקופה והוסף 1 מ"ל של קיבוע (מתנול: אצטון = 1: 1) (ראה טבלת חומרים) מתא האוויר המזויף לקיבוע של 30 דקות.
  5. השלך את הקיבוע עם מזרק של 1 מ"ל. חותכים קרום כוריואלנטואי ~ 5X5 ס"מ בתא האוויר המזויף בעזרת מספריים עיניים ומניחים בצלחת פטרי 60 מ"מ.
    הערה: עבור קרום כוריואלנטואי של עובר אפרוח עם דם, יש לשטוף עם PBS. לעובר אפרוח קרום כוריואלנטואי המחובר לרקמה, הפרד בעזרת מספריים עיניים.
  6. שים את הממברנה הכוריואלנטואית משלב 7.5 מתחת למיקרוסקופ אופטי וצלם את הכלים (ראה טבלת חומרים).

תוצאות

כפי שמוצג באיור 2A, ביססנו מודל סרטן כבד ממוקד של עכברי BALB/c-nu והערכנו את ההשפעה האנטי-גידולית של נוסחת Sanleng Jiashen. איור 2B מציג כי נוסחת Sanleng Jiashen יכולה לדכא באופן משמעותי את הצמיחה של גידולי כבד. התוצאות הפתולוגיות הצביעו על כך שבהשוואה לק...

Discussion

כמות גדולה של ראיות אישרה כי לסנלנג, ג'ינסנג, ריבס וצ'ואן-שיונג בנוסחת סנלנג ג'יאשן יש השפעות פרמקולוגיות על הטיפול בסרטן הכבד. מחקרים הראו כי Sanleng יכול לעכב באופן משמעותי את התפשטותם וצמיחתם של תאי גידול כדי למנוע פלישת תאי גידול וגרורות, לגרום לאפופטוזיס של תאים ולווסת א...

Disclosures

למחברים אין מה לחשוף.

Acknowledgements

עבודה זו נתמכה על ידי הקרן לפילוסופיה ומדעי החברה של סין (20VYJ070), הפרויקט של מחלקת החינוך המחוזית של ג'ילין (JJKH20230963KJ), והקבוצה השנייה של פרויקט ההנדסה של חוקרי שינגלין באוניברסיטת צ'אנגצ'ון לרפואה סינית (QNKXJ2-2021+ZR25).

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
0.25% trypsin solutionHyClone, AmericaSH30042.01B
1 mL disposable syringeMingankang Medical Equipment Co., Ltd., ChinaRWSB
1% Penicillin & streptomycin solutionHyclone, AmericaSV30010
1.5 mL centrifuge tubeCorning, AmericaMCT-150-C-S
12 cm needle forcepsHesdick, ChinaHKQS-211
6-0 surgical suturesShanghai Jinhuan Medical Equipment Co., Ltd., Shanghai, ChinaCR631
75% alcoholSichuan Youbang Enterprise Co., Ltd., Sichuan, China1.00009E+11
96-well platesNEST, China701001
AcetoneTianjin Dingfu Chemical General Plant, Tianjin, ChinaGB686-89
BALB/c-nu male nude miceBeijing Weitonglihua Experimental Animal Technology Co., Ltd., Beijing, ChinaSYXK(Ji) 2018-0006
Biological tissue baking machineLeica, GermanyLeica HI1220
Cell culture dishNEST, ChinaNEST.706001
Citric acid solutionWuhan Canos Technology Co., Ltd., Wuhan, Chinasj1074
D-luciferinGold Biotechnology®, Inc., ChinaLUCK-100
DMEMHyclone, AmericaSH30243.01
Egg illuminatorShandong Weizhen Incubation Equipment Company, Shandong, ChinaWZSDT
Eosin staining solutionHunan BKMAM Biotechnology Co., Ltd., Hunan, China110703061
Erythromycin eye ointment Cisen Pharmaceutical Co., Ltd., Shanghai, ChinaH37022025
Fetal bovine serumClark, AmericaFB25015 
Fully automatic intelligent chick incubatorShandong Weizhen Incubation Equipment Company, Shandong, China29538
GFP lentivirus solutionSuzhou GenePharma Co.,Ltd., Suzhou, ChinaF22AZ
Goat serumShenyang Wanlei Biotechnology Co., Ltd., Shengyang, ChinaWLA067
Hand-held mouse skull drillSTRONGWT, China190
HCCLM3 cell lineWheLab, Shanghai, ChinaC1010
Heating padZhongke Life Technology Co., Ltd., Hangzhou, ChinaGEJRD-10W
HematoxylinHunan BKMAM Biotechnology Co., Ltd., Hunan, ChinaB-YH250-1
Intelligent decoction potHangzhou Jiuyang living Appliance Co., Ltd., Hangzhou, China3003BQ
 Inverted fluorescence microscopeOlympus, JapanIX73
ki67 primary antibodyWuhan Servicebio Technology Co., Ltd., Wuhan, ChinaGB121141-100
Lodophor disinfectantCofoe Medical Technology Co.,Ltd., Hunan, China202110073
LuciferaseSuzhou GenePharma Co.,Ltd., Suzhou, ChinaE26JZ
Matrix glueCorning, America356234
Medical gauzeYunnan Chenye Biotechnology Co., Ltd., Yunnan, China71712049971
MethanolGuangdong Guanghua Sci-Tech Co., Ltd., Guangdong, China1.17001.023
Ophthalmic scissorHesdick, ChinaHKQS-209
Ophthalmic tweezerHesdick, ChinaHKCL-20
Paraffin embedding machineLeica, Germany EG1150H
Paraffin slicing machineLeica, GermanyLeica CM1950
ParaformaldehydeBiosharp, ChinaBL539A
PBS bufferWuhan Servicebio Technology Co., Ltd., Wuhan, ChinaG2156-1L
PuromycinBeijing Solarbio Science & Technology Co., Ltd., Beijing, ChinaP8230
RefrigeratorThermo Scientific, AmericaTDE40086FV-ULTS
ScalpelHesdick, ChinaHKCL-93
Secondary antibodyWuhan Servicebio Technology Co., Ltd., Wuhan, ChinaGB23301
Small animal live imaging systemCaliper Life Sciences, AmericaIVIS Lumina XR
SorafenibShanghai Aladdin Biochemical Technology Co., Ltd., Shanghai, China284461-73-0 
Transparent dressing3M, America9534HP
Triton X-100Beijing Solarbio Science & Technology Co., Ltd., Beijing, ChinaT8200
Vacuum freeze dryer Ningbo Xinzhi Biotechnology Co., Ltd., Ningbo, Chinasz-10N
White feather chicken eggsShandong Haotai Experimental Animal Breeding Co., Ltd., Shandong, ChinaSCXK(Lu) 20180004
XyleneSigma-Aldrich, , America534056

References

  1. Sia, D., Villanueva, A., Friedman, S. L., Llovet, J. M. Liver cancer cell of origin, molecular class, and effects on patient prognosis. Gastroenterology. 152 (4), 745-761 (2017).
  2. Starley, B. Q., Calcagno, C. J., Harrison, S. A. Nonalcoholic fatty liver disease and hepatocellular carcinoma: a weighty connection. Hepatology. 51 (5), 1820-1832 (2010).
  3. Siegel, R. L., Miller, K. D., Wagle, N. S., Jemal, A. Cancer statistics. CA-A Cancer J. Clin. 73 (1), 17-48 (2023).
  4. Lozano, R., et al. Global and regional mortality from 235 causes of death for 20 age groups in 1990 and 2010: a systematic analysis for the Global Burden of Disease Study 2010. Lancet. 380 (9859), 2095-2128 (2012).
  5. Verslype, C., et al. The management of hepatocellular carcinoma. Current expert opinion and recommendations derived from the 10th World Congress on Gastrointestinal Cancer, Barcelona, 2008. Ann. Oncol. , (2009).
  6. Greten, T. F., et al. Biomarkers for immunotherapy of hepatocellular carcinoma. Nat. Rev. Clin. Oncol. 20 (11), 780-798 (2023).
  7. Rimassa, L., Finn, R. S., Sangro, B. Combination immunotherapy for hepatocellular carcinoma. J. Hepatol. 79 (2), 506-515 (2023).
  8. Wu, Z. H., et al. A terrylene-anthraquinone dyad as a chromophore for photothermal therapy in the NIR-II window. J. Am. Chem. Soc. 145 (48), 26487-26493 (2023).
  9. Pawlik, T. M. Hepatocellular carcinoma. Sure. Oncol. Clin. N. Am. 33 (1), (2024).
  10. Schwarze, V., et al. Diagnostic value of contrast-enhanced ultrasound versus computed tomography for hepatocellular carcinoma: a retrospective, single-center evaluation of 234 patients. J. Int. Med. Res. 48 (6), 1-10 (2020).
  11. Maki, H., Hasegawa, K. Advances in the surgical treatment of liver cancer. Biosci. Trends. 16 (3), 178-188 (2022).
  12. Pepe, A., et al. Medical radiology: current progress. Diagnostics. 13 (14), 2439 (2023).
  13. Li, Y., Zhang, C. Significance of 'harmonious' thinking in Inner Canon of Huangdi on the prevention and treatment of primary liver cancer. China Journal of Traditional Chinese Medicine and Pharmacy. 28 (02), 305-308 (2013).
  14. Luo, T. . Wishing Baojian (M). , (2019).
  15. Li, Y. . Effect and mechanism of Sanlengjiashen Decoction on hepatocellular carcinoma by JAK2/STAT3 signaling pathway [D]. , (2022).
  16. Wang, P., et al. BTF3 promotes proliferation and glycolysis in hepatocellular carcinoma by regulating GLUT1. Cancer Biol. Ther. 24 (1), 2225884 (2023).
  17. Xie, N., et al. Rhodiola crenulate alleviates hypobaric hypoxia-induced brain injury via adjusting NF-κB/NLRP3-mediated inflammation. Phytomedicine. 103, 154240 (2022).
  18. Wang, X., et al. Rhodiola crenulata attenuates apoptosis and mitochondrial energy metabolism disorder in rats with hypobaric hypoxia-induced brain injury by regulating the HIF-1α/microRNA210/ISCU1/2 (COX10) signaling pathway. J. Ethnopharmacol. 241, 111801 (2019).
  19. Guerrieri, A. N., et al. A novel patient-derived immortalised cell line of myxofibrosarcoma: a tool for preclinical drugs testing and the generation of near-patient models. BMC Cancer. 23 (1), 1194 (2023).
  20. Li, Y., Zhao, J., Zhao, H., Yu, C. Research progress of Sparganium Stoloniferum. Journal of Liaoning University of Traditional Chinese Medicine. 20 (09), 92-94 (2018).
  21. Kim, T. W., Lee, S. Y., Kim, M., Cheon, C., Ko, S. G. Kaempferol induces autophagic cell death via IRE1-JNK-CHOP pathway and inhibition of G9a in gastric cancer cells. Cell Death Dis. 9 (9), 875 (2018).
  22. Lee, M. J., et al. Kaempferol alleviates mitochondrial damage by reducing mitochondrial reactive oxygen species production in lipopolysaccharide-induced prostate organoids. Foods. 12 (20), 3836 (2023).
  23. Zhang, Q., et al. Molecular docking and in vitro experiments verified that kaempferol induced apoptosis and inhibited human HepG2 cell proliferation by targeting BAX, CDK1, and JUN. Mol. Cell. Biochem. 478 (4), 767-780 (2023).
  24. Kumar, S., et al. Myricetin: a potential plant-derived anticancer bioactive compound-an updated overview. N-S Arch. Pharmacol. 396 (10), 2179-2196 (2023).
  25. Wang, M., et al. Myricetin reverses epithelial-endothelial transition and inhibits vasculogenic mimicry and angiogenesis of hepatocellular carcinoma by directly targeting PAR1. Phytother. Res. 36 (4), 1807-1821 (2022).
  26. Li, J., Li, F., Jin, D. Ginsenosides are promising medicine for tumor and inflammation: A review. Am. J. Chinese Med. 51 (4), 883-908 (2023).
  27. Guo, X., Hu, N., Sun, G., Li, M., Zhang, P. Shenyi capsule plus chemotherapy versus chemotherapy for non-small cell lung cancer:A systematic review of overlapping meta-analyses. Chinese Journal of Integrative Medicine. 24 (3), 227-231 (2018).
  28. Zhang, R., et al. Network Meta-analysis of oral Chinese patent medicine for adjuvant treatment of primary liver cancer. China Journal of Chinese Materia Medica. 46 (09), 2333-2343 (2021).
  29. Oh, H. M., Cho, C. K., Son, C. G. Experimental evidence for the anti-metastatic action of ginsenoside Rg3: A systematic review. Int. J. Mol. Sci. 23 (16), 9077 (2022).
  30. Nowak-Perlak, M., Ziółkowski, P., Woźniak, M. A promising natural anthraquinones mediated by photodynamic therapy for anti-cancer therapy. Phytomedicine. 119, 155035 (2023).
  31. Bai, J., et al. Emodin, a natural anthraquinone, suppresses liver cancer in vitro and in vivo by regulating VEGFR and miR-34a. Invest. New Drug. 38 (2), 229-245 (2020).
  32. Cheng, G., et al. Cell metabolomics reveals the potential mechanism of aloe emodin and emodin inhibiting breast cancer metastasis. Int. J. Mol. Sci. 23 (22), 13738 (2022).
  33. Wang, X., et al. Inhibition of tetramethylpyrazine on P-gp, MRP2, MRP3 and MRP5 in multidrug resistant human hepatocellular carcinoma cells. Oncol. Rep. 23 (1), 211-215 (2010).
  34. Hu, J., et al. Ultrasonic extraction, antioxidant and anticancer activities of novel polysaccharides from Chuanxiong rhizome. Int. J. Biol. Macromol. 85, 277-284 (2016).
  35. Zhong, C., et al. Physicochemical properties of polysaccharides from Ligusticum chuanxiong and analysis of their anti-tumor potential through immunoregulation. Food Funct. 12 (4), 1719-1731 (2021).
  36. Hou, Y., et al. Salidroside intensifies mitochondrial function of CoCl2-damaged HT22 cells by stimulating PI3K-AKT-MAPK signaling pathway. Phytomedicine. 109, 154568 (2023).
  37. Wang, X., et al. Salidroside, a phenyl ethanol glycoside from Rhodiola crenulata, orchestrates hypoxic mitochondrial dynamics homeostasis by stimulating Sirt1/p53/Drp1 signaling. J. Ethnopharmacol. 293, 115278 (2022).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

BALB c nuSanleng JiashenKi67

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved