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Method Article
Aqui, apresentamos o protocolo passo a passo para investigar os efeitos terapêuticos e inibitórios vasculares da fórmula de Sanleng Jiashen em camundongos BALB/c-nu com carcinoma hepatocelular ortotópico.
A letalidade do câncer de fígado e a resistência a drogas químicas forçaram a busca por prescrições eficazes de ervas tradicionais para o câncer de fígado. Modelos animais que são repetíveis, fáceis de manipular e altamente imitam os processos fisiopatológicos do câncer de fígado são o pré-requisito para a triagem bem-sucedida de candidatos a medicamentos eficazes. Enquanto isso, indicadores e meios confiáveis de avaliação da eficácia do medicamento também são a garantia da pesquisa e desenvolvimento de medicamentos anticâncer de fígado.
Fórmula Sanleng Jiachen, uma prescrição representativa da medicina tradicional chinesa contendo Sparganium stoloni erum, Buch. -Presunto. (Sanleng), Panax ginseng C. A. Mey. (ginseng), Rheum officinale Baill. (ruibarbo) e Ligusticum chuanxiong Hort. (Chuanxiong), é prescrito para nutrir o fígado e limpar o calor, remover toxinas e promover a circulação sanguínea para tratar o câncer de fígado. Este protocolo experimental descreve a preparação da fórmula liofilizada de Sanleng Jiashen e o processo de estabelecimento do câncer de fígado in situ em camundongos BALB/c-nu. Coloração histopatológica, detecção imuno-histoquímica de marcadores de câncer, imagem in vivo de camundongos e teste de membrana corioalantóide de embrião de galinha foram usados para explorar a inibição e o efeito antiangiogênese da fórmula de Sanleng Jiashen na proliferação maligna do tecido de câncer de fígado. Os dados mostram que a fórmula Sanleng Jiashen pode resistir efetivamente à proliferação maligna do tecido cancerígeno do fígado, que se manifesta pela redução do volume de massa tumoral, melhora do dano patológico e níveis mais baixos do marcador de câncer ki67.
A inibição superior da angiogênese também sugere que a fórmula Sanleng Jiashen pode ter o potencial de tratar e prevenir a progressão e deterioração do câncer de fígado. Todo o esquema experimental mostra um processo abrangente de componentes da medicina tradicional chinesa no tratamento do câncer de fígado de camundongo, que fornece uma referência para o estabelecimento e otimização de um modelo de câncer de fígado, bem como a pesquisa e desenvolvimento de medicamentos para prevenir e tratar o câncer de fígado.
O câncer de fígado é um câncer mortal que se origina no fígado e é a segunda causa mais comum de morte relacionada ao câncer em todo o mundo1. As taxas de doenças hepáticas nos Estados Unidos e em alguns países em desenvolvimento estão mostrando níveis elevados, e pode haver mais de 1 milhão de casos de câncer de fígado em todo o mundo até 20302. Devido a hábitos de vida pouco saudáveis, como tabagismo, obesidade e bebida, e aos estragos da hepatite B, hepatite C e outros vírus, a incidência e a mortalidade do câncer de fígado aumentaram significativamente ano a ano3. Como um tumor maligno heterogêneo com diferentes características histológicas e mau prognóstico, o câncer de fígado tem uma ampla gama de incidência, incluindo carcinoma hepatocelular, colangiocarcinoma intra-hepático e câncer de fígado fibrolamelar4. O câncer de fígado é frequentemente diagnosticado em estágio avançado, e muitos pacientes avançados não são candidatos à radioterapia5. O inibidor da multiquinase sorafenibe é um medicamento altamente aceito para pacientes com câncer de fígado avançado, mas os pacientes geralmente desenvolvem resistência significativa em um curto período6. Atualmente, os inibidores de checkpoint imunológico PD-1 e PD-L1 combinados com sorafenibe fizeram algum progresso no controle do desenvolvimento do câncer de fígado, mas o efeito terapêutico ainda é controverso7.
O câncer de fígado ortotópico é um tipo precoce de câncer de fígado: as células cancerígenas não se espalharam pelo tecido hepático ou ocorrem metástases interorgânicas, e a função do fígado não é muito afetada8. Como o câncer de fígado ortotópico geralmente não apresenta sintomas óbvios de desconforto, alguns pacientes podem apresentar dor hepática leve, fadiga e outros sintomas9. Na prática clínica, a ultrassonografia com Doppler colorido do fígado e o exame de tomografia computadorizada aprimorada podem diagnosticar lesões substanciais que ocupam espaço no fígado10. Embora o câncer de fígado local que não se espalhou e metastatizou possa ser removido por cirurgia, existem certos riscos cirúrgicos e a inevitável carga psicológica para os pacientes11. A quimiorradioterapia pode matar todas ou parte das células cancerígenas do fígado, e a imunossupressão a longo prazo em pacientes com medicação pode afetar a eficácia do tratamento e aumentar o risco de outras doenças12. Portanto, buscar terapia medicamentosa segura e eficaz para prevenção e tratamento precoce do câncer de fígado é a chave para conter a progressão e a deterioração do câncer de fígado.
O princípio da medicina chinesa que trata o câncer de fígado é baseado no conceito de equilíbrio e harmonia dentro do corpo. A medicina chinesa vê o câncer de fígado como um desequilíbrio ou desarmonia na energia do corpo, conhecido como Qi, que afeta o fígado13. O tratamento da medicina chinesa para o câncer de fígado envolve várias abordagens, incluindo fitoterapia, acupuntura, terapia dietética e recomendações de estilo de vida. O princípio é restaurar o equilíbrio do Qi, fortalecer os mecanismos de defesa do corpo e promover a capacidade do corpo de se curar14,15. O câncer de fígado na medicina tradicional chinesa pertence à categoria "timpanitas" e "acúmulo de fígado". Já que o "Cânone Interno de Huangdi" tem um registro detalhado de seus sintomas, o câncer de fígado é causado por estase sanguínea e deficiência de Zhengqi e é tratado removendo a estase sanguínea, eliminando timpanitos e fortalecendo a resistência do corpo para consolidar a constituição13. A pílula Sanleng originou-se do livro "Weisheng Baojian" escrito por Luo Tianyi, um famoso médico da dinastia Yuan. É composto por três tipos de drogas: Sparganium stoloni erum, Buch. -Presunto. (Sanleng), Ligusticum chuanxiong Hort. (Chuanxiong) e Rheum officinale Baill. (ruibarbo). Esses três tipos de drogas podem entrar no meridiano hepático e ter valor terapêutico para o tratamento do câncer de fígado14. A fórmula de Sanleng Jiashen é composta por 16 g de Sanleng, 16 g de Panax ginseng C.A.Mey. (ginseng), 8 g de ruibarbo e 2 g de Chuanxiong (Figura 1), que é prescrito para tonificar o fígado, limpar o calor, eliminar toxinas e promover a circulação sanguínea. Acredita-se que essas ervas tenham propriedades anticancerígenas e ajudem a reduzir o crescimento do tumor, aliviar os sintomas e melhorar o bem-estar geral. Nos experimentos in vitro anteriores, a fórmula Sanleng Jiashen pode inibir a proliferação de células cancerígenas do fígado15. No entanto, como avaliar o efeito inibitório dos compostos fitoterápicos chineses no câncer de fígado de forma eficiente e razoável? Ao estabelecer um modelo de câncer de fígado in situ em camundongos BALB/c-nu, o efeito inibitório da fórmula de Sanleng Jiashen no câncer de fígado e na angiogênese foi investigado principalmente por meio de imagens vivas de pequenos animais e teste de membrana corioalantóide de embrião de galinha.
Camundongos nus machos BALB/c-nu livres de patógenos específicos, com 5 semanas de idade e pesando 18-22 g foram alimentados no Centro Experimental Animal de Transformação Medical College da Universidade de Jilin; as condições de alimentação foram de 22 °C-24 °C com 40%-60% de umidade relativa. O número de licença do animal experimental é SYXK(Ji) 2018-0006, e o processo experimental está em conformidade com as regras e regulamentos do Comitê de Ética da Universidade de Jilin, e o número de aprovação da ética animal é 20221228-01.
1. Preparação da fórmula Sanleng Jiashen liofilizada15
2. Construção da linhagem celular HCCLM3 expressando luciferase de forma estável16
3. Estabelecimento de camundongos nus BALB/c-nu modelo de câncer de fígado in situ e tratamento15
4. Avaliação de imagem in vivo
NOTA: No dia 14, a imagem ao vivo foi realizada 1 h após o término da administração.
5. Coloração de hematoxilina-eosina17
6. Coloração imuno-histoquímica18
7. Teste de membrana corioalantóide de embrião de pintinho19
Conforme mostrado na Figura 2A, estabelecemos um modelo de câncer de fígado in situ de camundongos BALB/c-nu e avaliamos o efeito antitumoral da fórmula Sanleng Jiachen. A Figura 2B mostra que a fórmula de Sanleng Jiashen pode suprimir significativamente o crescimento de tumores hepáticos. Os resultados patológicos indicaram que, em comparação com o grupo controle, os focos tumorais no grupo modelo tinham limite...
Uma grande quantidade de evidências confirmou que Sanleng, ginseng, ruibarbo e Chuanxiong na fórmula Sanleng Jiashen têm efeitos farmacológicos no tratamento do câncer de fígado. Estudos mostraram que o Sanleng pode inibir significativamente a proliferação e o crescimento de células tumorais para prevenir a invasão e metástase de células tumorais, induzir a apoptose celular e regular o ciclo celular e o microambiente tumoral20. Foi provado que o kaempf...
Os autores não têm nada a divulgar.
Este trabalho foi apoiado pela Fundação de Filosofia e Ciências Sociais da China (20VYJ070), pelo Projeto do Departamento de Educação da Província de Jilin (JJKH20230963KJ) e pelo Segundo Lote do Projeto de Engenharia de Acadêmicos Xinglin na Universidade de Medicina Chinesa de Changchun (QNKXJ2-2021 + ZR25).
Name | Company | Catalog Number | Comments |
0.25% trypsin solution | HyClone, America | SH30042.01B | |
1 mL disposable syringe | Mingankang Medical Equipment Co., Ltd., China | RWSB | |
1% Penicillin & streptomycin solution | Hyclone, America | SV30010 | |
1.5 mL centrifuge tube | Corning, America | MCT-150-C-S | |
12 cm needle forceps | Hesdick, China | HKQS-211 | |
6-0 surgical sutures | Shanghai Jinhuan Medical Equipment Co., Ltd., Shanghai, China | CR631 | |
75% alcohol | Sichuan Youbang Enterprise Co., Ltd., Sichuan, China | 1.00009E+11 | |
96-well plates | NEST, China | 701001 | |
Acetone | Tianjin Dingfu Chemical General Plant, Tianjin, China | GB686-89 | |
BALB/c-nu male nude mice | Beijing Weitonglihua Experimental Animal Technology Co., Ltd., Beijing, China | SYXK(Ji) 2018-0006 | |
Biological tissue baking machine | Leica, Germany | Leica HI1220 | |
Cell culture dish | NEST, China | NEST.706001 | |
Citric acid solution | Wuhan Canos Technology Co., Ltd., Wuhan, China | sj1074 | |
D-luciferin | Gold Biotechnology®, Inc., China | LUCK-100 | |
DMEM | Hyclone, America | SH30243.01 | |
Egg illuminator | Shandong Weizhen Incubation Equipment Company, Shandong, China | WZSDT | |
Eosin staining solution | Hunan BKMAM Biotechnology Co., Ltd., Hunan, China | 110703061 | |
Erythromycin eye ointment | Cisen Pharmaceutical Co., Ltd., Shanghai, China | H37022025 | |
Fetal bovine serum | Clark, America | FB25015 | |
Fully automatic intelligent chick incubator | Shandong Weizhen Incubation Equipment Company, Shandong, China | 29538 | |
GFP lentivirus solution | Suzhou GenePharma Co.,Ltd., Suzhou, China | F22AZ | |
Goat serum | Shenyang Wanlei Biotechnology Co., Ltd., Shengyang, China | WLA067 | |
Hand-held mouse skull drill | STRONGWT, China | 190 | |
HCCLM3 cell line | WheLab, Shanghai, China | C1010 | |
Heating pad | Zhongke Life Technology Co., Ltd., Hangzhou, China | GEJRD-10W | |
Hematoxylin | Hunan BKMAM Biotechnology Co., Ltd., Hunan, China | B-YH250-1 | |
Intelligent decoction pot | Hangzhou Jiuyang living Appliance Co., Ltd., Hangzhou, China | 3003BQ | |
Inverted fluorescence microscope | Olympus, Japan | IX73 | |
ki67 primary antibody | Wuhan Servicebio Technology Co., Ltd., Wuhan, China | GB121141-100 | |
Lodophor disinfectant | Cofoe Medical Technology Co.,Ltd., Hunan, China | 202110073 | |
Luciferase | Suzhou GenePharma Co.,Ltd., Suzhou, China | E26JZ | |
Matrix glue | Corning, America | 356234 | |
Medical gauze | Yunnan Chenye Biotechnology Co., Ltd., Yunnan, China | 71712049971 | |
Methanol | Guangdong Guanghua Sci-Tech Co., Ltd., Guangdong, China | 1.17001.023 | |
Ophthalmic scissor | Hesdick, China | HKQS-209 | |
Ophthalmic tweezer | Hesdick, China | HKCL-20 | |
Paraffin embedding machine | Leica, Germany | EG1150H | |
Paraffin slicing machine | Leica, Germany | Leica CM1950 | |
Paraformaldehyde | Biosharp, China | BL539A | |
PBS buffer | Wuhan Servicebio Technology Co., Ltd., Wuhan, China | G2156-1L | |
Puromycin | Beijing Solarbio Science & Technology Co., Ltd., Beijing, China | P8230 | |
Refrigerator | Thermo Scientific, America | TDE40086FV-ULTS | |
Scalpel | Hesdick, China | HKCL-93 | |
Secondary antibody | Wuhan Servicebio Technology Co., Ltd., Wuhan, China | GB23301 | |
Small animal live imaging system | Caliper Life Sciences, America | IVIS Lumina XR | |
Sorafenib | Shanghai Aladdin Biochemical Technology Co., Ltd., Shanghai, China | 284461-73-0 | |
Transparent dressing | 3M, America | 9534HP | |
Triton X-100 | Beijing Solarbio Science & Technology Co., Ltd., Beijing, China | T8200 | |
Vacuum freeze dryer | Ningbo Xinzhi Biotechnology Co., Ltd., Ningbo, China | sz-10N | |
White feather chicken eggs | Shandong Haotai Experimental Animal Breeding Co., Ltd., Shandong, China | SCXK(Lu) 20180004 | |
Xylene | Sigma-Aldrich, , America | 534056 |
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