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Resumo

Aqui, apresentamos o protocolo passo a passo para investigar os efeitos terapêuticos e inibitórios vasculares da fórmula de Sanleng Jiashen em camundongos BALB/c-nu com carcinoma hepatocelular ortotópico.

Resumo

A letalidade do câncer de fígado e a resistência a drogas químicas forçaram a busca por prescrições eficazes de ervas tradicionais para o câncer de fígado. Modelos animais que são repetíveis, fáceis de manipular e altamente imitam os processos fisiopatológicos do câncer de fígado são o pré-requisito para a triagem bem-sucedida de candidatos a medicamentos eficazes. Enquanto isso, indicadores e meios confiáveis de avaliação da eficácia do medicamento também são a garantia da pesquisa e desenvolvimento de medicamentos anticâncer de fígado.

Fórmula Sanleng Jiachen, uma prescrição representativa da medicina tradicional chinesa contendo Sparganium stoloni erum, Buch. -Presunto. (Sanleng), Panax ginseng C. A. Mey. (ginseng), Rheum officinale Baill. (ruibarbo) e Ligusticum chuanxiong Hort. (Chuanxiong), é prescrito para nutrir o fígado e limpar o calor, remover toxinas e promover a circulação sanguínea para tratar o câncer de fígado. Este protocolo experimental descreve a preparação da fórmula liofilizada de Sanleng Jiashen e o processo de estabelecimento do câncer de fígado in situ em camundongos BALB/c-nu. Coloração histopatológica, detecção imuno-histoquímica de marcadores de câncer, imagem in vivo de camundongos e teste de membrana corioalantóide de embrião de galinha foram usados para explorar a inibição e o efeito antiangiogênese da fórmula de Sanleng Jiashen na proliferação maligna do tecido de câncer de fígado. Os dados mostram que a fórmula Sanleng Jiashen pode resistir efetivamente à proliferação maligna do tecido cancerígeno do fígado, que se manifesta pela redução do volume de massa tumoral, melhora do dano patológico e níveis mais baixos do marcador de câncer ki67.

A inibição superior da angiogênese também sugere que a fórmula Sanleng Jiashen pode ter o potencial de tratar e prevenir a progressão e deterioração do câncer de fígado. Todo o esquema experimental mostra um processo abrangente de componentes da medicina tradicional chinesa no tratamento do câncer de fígado de camundongo, que fornece uma referência para o estabelecimento e otimização de um modelo de câncer de fígado, bem como a pesquisa e desenvolvimento de medicamentos para prevenir e tratar o câncer de fígado.

Introdução

O câncer de fígado é um câncer mortal que se origina no fígado e é a segunda causa mais comum de morte relacionada ao câncer em todo o mundo1. As taxas de doenças hepáticas nos Estados Unidos e em alguns países em desenvolvimento estão mostrando níveis elevados, e pode haver mais de 1 milhão de casos de câncer de fígado em todo o mundo até 20302. Devido a hábitos de vida pouco saudáveis, como tabagismo, obesidade e bebida, e aos estragos da hepatite B, hepatite C e outros vírus, a incidência e a mortalidade do câncer de fígado aumentaram significativamente ano a ano3. Como um tumor maligno heterogêneo com diferentes características histológicas e mau prognóstico, o câncer de fígado tem uma ampla gama de incidência, incluindo carcinoma hepatocelular, colangiocarcinoma intra-hepático e câncer de fígado fibrolamelar4. O câncer de fígado é frequentemente diagnosticado em estágio avançado, e muitos pacientes avançados não são candidatos à radioterapia5. O inibidor da multiquinase sorafenibe é um medicamento altamente aceito para pacientes com câncer de fígado avançado, mas os pacientes geralmente desenvolvem resistência significativa em um curto período6. Atualmente, os inibidores de checkpoint imunológico PD-1 e PD-L1 combinados com sorafenibe fizeram algum progresso no controle do desenvolvimento do câncer de fígado, mas o efeito terapêutico ainda é controverso7.

O câncer de fígado ortotópico é um tipo precoce de câncer de fígado: as células cancerígenas não se espalharam pelo tecido hepático ou ocorrem metástases interorgânicas, e a função do fígado não é muito afetada8. Como o câncer de fígado ortotópico geralmente não apresenta sintomas óbvios de desconforto, alguns pacientes podem apresentar dor hepática leve, fadiga e outros sintomas9. Na prática clínica, a ultrassonografia com Doppler colorido do fígado e o exame de tomografia computadorizada aprimorada podem diagnosticar lesões substanciais que ocupam espaço no fígado10. Embora o câncer de fígado local que não se espalhou e metastatizou possa ser removido por cirurgia, existem certos riscos cirúrgicos e a inevitável carga psicológica para os pacientes11. A quimiorradioterapia pode matar todas ou parte das células cancerígenas do fígado, e a imunossupressão a longo prazo em pacientes com medicação pode afetar a eficácia do tratamento e aumentar o risco de outras doenças12. Portanto, buscar terapia medicamentosa segura e eficaz para prevenção e tratamento precoce do câncer de fígado é a chave para conter a progressão e a deterioração do câncer de fígado.

O princípio da medicina chinesa que trata o câncer de fígado é baseado no conceito de equilíbrio e harmonia dentro do corpo. A medicina chinesa vê o câncer de fígado como um desequilíbrio ou desarmonia na energia do corpo, conhecido como Qi, que afeta o fígado13. O tratamento da medicina chinesa para o câncer de fígado envolve várias abordagens, incluindo fitoterapia, acupuntura, terapia dietética e recomendações de estilo de vida. O princípio é restaurar o equilíbrio do Qi, fortalecer os mecanismos de defesa do corpo e promover a capacidade do corpo de se curar14,15. O câncer de fígado na medicina tradicional chinesa pertence à categoria "timpanitas" e "acúmulo de fígado". Já que o "Cânone Interno de Huangdi" tem um registro detalhado de seus sintomas, o câncer de fígado é causado por estase sanguínea e deficiência de Zhengqi e é tratado removendo a estase sanguínea, eliminando timpanitos e fortalecendo a resistência do corpo para consolidar a constituição13. A pílula Sanleng originou-se do livro "Weisheng Baojian" escrito por Luo Tianyi, um famoso médico da dinastia Yuan. É composto por três tipos de drogas: Sparganium stoloni erum, Buch. -Presunto. (Sanleng), Ligusticum chuanxiong Hort. (Chuanxiong) e Rheum officinale Baill. (ruibarbo). Esses três tipos de drogas podem entrar no meridiano hepático e ter valor terapêutico para o tratamento do câncer de fígado14. A fórmula de Sanleng Jiashen é composta por 16 g de Sanleng, 16 g de Panax ginseng C.A.Mey. (ginseng), 8 g de ruibarbo e 2 g de Chuanxiong (Figura 1), que é prescrito para tonificar o fígado, limpar o calor, eliminar toxinas e promover a circulação sanguínea. Acredita-se que essas ervas tenham propriedades anticancerígenas e ajudem a reduzir o crescimento do tumor, aliviar os sintomas e melhorar o bem-estar geral. Nos experimentos in vitro anteriores, a fórmula Sanleng Jiashen pode inibir a proliferação de células cancerígenas do fígado15. No entanto, como avaliar o efeito inibitório dos compostos fitoterápicos chineses no câncer de fígado de forma eficiente e razoável? Ao estabelecer um modelo de câncer de fígado in situ em camundongos BALB/c-nu, o efeito inibitório da fórmula de Sanleng Jiashen no câncer de fígado e na angiogênese foi investigado principalmente por meio de imagens vivas de pequenos animais e teste de membrana corioalantóide de embrião de galinha.

Protocolo

Camundongos nus machos BALB/c-nu livres de patógenos específicos, com 5 semanas de idade e pesando 18-22 g foram alimentados no Centro Experimental Animal de Transformação Medical College da Universidade de Jilin; as condições de alimentação foram de 22 °C-24 °C com 40%-60% de umidade relativa. O número de licença do animal experimental é SYXK(Ji) 2018-0006, e o processo experimental está em conformidade com as regras e regulamentos do Comitê de Ética da Universidade de Jilin, e o número de aprovação da ética animal é 20221228-01.

1. Preparação da fórmula Sanleng Jiashen liofilizada15

  1. Coloque 16 g de Sanleng, 16 g de ginseng, 8 g de ruibarbo e 2 g de Chuanxiong em um pote de decocção inteligente (consulte a Tabela de Materiais) e mergulhe em 294 mL de água deionizada em temperatura ambiente por 30 min. Depois de aquecer e ferver, continue a cozinhar por 30 min a 100 ° C e filtre o líquido com gaze médica dupla (consulte a Tabela de Materiais). Adicione 252 mL de água deionizada ao resíduo, cozinhe por 30 min a 100 °C e filtre o líquido com gaze dupla.
  2. Recolher o filtrado do passo 1.1 numa cápsula limpa de aço inoxidável e congelar durante 12 h a -80 °C (ver Tabela de Materiais).
  3. Coloque a fórmula Sanleng Jiashen da etapa 1.2 em um liofilizador a vácuo (consulte a Tabela de Materiais) (temperatura da armadilha fria: -55 °C) e seque por 48 h para obter o pó liofilizado da fórmula Sanleng Jiachen.

2. Construção da linhagem celular HCCLM3 expressando luciferase de forma estável16

  1. Adicionar 1,0 ml de suspensão de células HCCLM3 na placa de 24 poços (ver Tabela de Materiais) com 5 × 105 células/alvéolo e cultura num meio completo (10% de soro fetal bovino + 1% de solução de penicilina-estreptomicina + DMEM) (ver Tabela de Materiais) contendo 3 μg/ml de puromicina durante 72 h numa incubadora de células (37 °C, 5% CO2, ver Tabela de Materiais).
  2. Descarte o sobrenadante celular na etapa 2.1 e adicione 100 μL de solução de tripsina a 0,25% para digerir as células em uma incubadora de células por 1 min (consulte a Tabela de Materiais). Adicione 300 μL de meio completo e use uma pipeta para liberar as células aderentes e interromper a digestão. Colete todas as suspensões de células e coloque-as em um tubo de centrífuga de 15 mL em temperatura ambiente a 1.000 × g por 5 min. Depois de descartar o sobrenadante, adicione 1 mL de meio completo e misture por pipetagem.
  3. Adicione 100 μL de suspensão celular de 4 × 103 células HCCLM3 / poço da etapa 2.2 em uma placa de 96 poços e cultive em uma incubadora de células por 24 h (37 ° C, 5% CO2, consulte a Tabela de Materiais).
  4. Adicione 0,27 μL de lentivírus GFP às placas de 96 poços na etapa 2.3 e cultive em uma incubadora de células por 15 h (37 ° C, 5% CO2, consulte a Tabela de Materiais). Descarte o sobrenadante celular, adicione 100 μL de meio de cultura completo e adquira imagens usando um microscópio de fluorescência no comprimento de onda de excitação de 488 nm e no comprimento de onda de emissão de 507 nm (consulte a Tabela de Materiais).
  5. Substitua 2 mL de lentivírus GFP e continue a cultivar por 24 h. Substitua 2 mL de meio de cultura completo sem lentivírus GFP por mais 24 h.
    NOTA: A eficiência de transfecção do lentivírus GFP em células HCCLM3 foi de 80%, conforme visto em um microscópio de fluorescência invertida.
  6. Adicione 5 mL de suspensão de 2 × 105 células da etapa 2.1 em uma placa de Petri de 60 mm e cultive em uma incubadora de células por 24 h. Adicione 64,5 μL de luciferase e continue a cultivar em uma incubadora de células por 15 h (37 ° C, 5% CO2, consulte a Tabela de Materiais).
  7. Descarte o sobrenadante e adicione 5 mL de meio completo para continuar a cultura até que as células se tornem 90% confluentes na placa de Petri. Descarte o sobrenadante celular, lave com 2 x 1 mL de PBS e adicione 1 mL de solução de tripsina a 0,25% para digerir as células em uma incubadora de células por 1 min (37 ° C, 5% CO2, consulte a Tabela de Materiais). Adicione 3 mL de meio completo e pipete para cima e para baixo para liberar as células aderentes e interromper a digestão. Colete todas as suspensões de células para injeção subsequente no camundongo.
    NOTA: Para obter um número suficiente de células, as células foram continuamente passadas e cultivadas.

3. Estabelecimento de camundongos nus BALB/c-nu modelo de câncer de fígado in situ e tratamento15

  1. Adicione 100 μL de 1 × 107 células HCCLM3 transfectadas com luciferase na etapa 2.7 e 100 μL de cola de matriz (ver Tabela de Materiais) em um tubo de centrífuga de 1.5 mL (ver Tabela de Materiais) e misture levemente com uma pipeta de 1 mL (ver Tabela de Materiais).
    NOTA: Todo o processo de preparação da solução deve ser realizado em gelo para evitar a cura da cola da matriz.
  2. Desinfete as axilas esquerda e direita de camundongos nus BALB/c-nu com iodopina (ver Tabela de Materiais) e desiodizado com álcool (ver Tabela de Materiais).
  3. Injete lentamente 100 μL da mistura de células HCCLM3 e cola de matriz da etapa 3.1 nas axilas esquerda e direita de camundongos nus BALB/c-nu com uma seringa descartável de 1 mL.
    NOTA: Após aproximadamente 10 dias, os camundongos nus BALB / c-nu desenvolveram uma massa tumoral de aproximadamente 0,5 cm3 no local da injeção bilateral nas axilas.
  4. Anestesiar camundongos nus BALB/c-nu na etapa 3.3 por injeção intraperitoneal de 1%, 50 mg/kg de pentobarbital sódico. Corte a pele de ambas as axilas com uma tesoura oftálmica e uma pinça (ver Tabela de Materiais) e descasque suavemente a massa tumoral subcutânea para colocá-la em uma placa de cultura de células (ver Tabela de Materiais) contendo tampão PBS pré-resfriado (ver Tabela de Materiais) e corte-a em pedaços de 1 mme 3 com um bisturi (ver Tabela de Materiais).
    NOTA: A massa tumoral nas axilas de camundongos nus BALB/c-nu deve ser colhida em gelo dentro de 0,5 h para manter a atividade das células tumorais e aumentar a taxa de sucesso do modelo. No final da amostragem, os camundongos foram mortos pela remoção das vértebras cervicais. Se houver uma parte necrótica do tumor, ela precisa ser removida, deixando apenas o tumor branco de peixe para evitar a infecção durante o transplante de câncer ortotópico.
  5. Anestesiar camundongos nus BALB / c-nu com 1%, 50 mg / kg de pentobarbital sódico por via intraperitoneal (ver Tabela de Materiais), desinfetar o abdômen com iodo (ver Tabela de Materiais) e desiodar com álcool (ver Tabela de Materiais).
  6. Use uma tesoura oftálmica e uma pinça (consulte a Tabela de Materiais) para cortar uma incisão cirúrgica de 45° cerca de 1 cm na posição de 0,5 cm abaixo do processo xifóide para expor o fígado, pressione suavemente o fígado para espremer o tecido hepático e fixe o fígado com papel de pesagem.
    NOTA: Cotonetes ou palitos podem ser colocados sob as costelas de camundongos para expor efetivamente o fígado.
  7. Pegue um pequeno pedaço de tecido tumoral na etapa 3.4 com uma agulha de injeção descartável de 10 mL e implante a massa tumoral no fígado cerca de 0,5 cm paralela ao fígado para fixá-la sob a cápsula hepática e retire lentamente a agulha.
    NOTA: Use uma seringa descartável de 1 mL para soltar 2 gotas da cola da matriz derretida, observe a massa tumoral sem deslizamentos acidentais e sem sangramento e, em seguida, suture a incisão cirúrgica.
  8. Feche a incisão cirúrgica com uma pinça de agulha de 12 cm e suturas cirúrgicas 6-0 (ver Tabela de Materiais). Aplique pomada ocular com eritromicina (consulte a Tabela de Materiais) no local da cirurgia para prevenir infecções. Coloque os ratos em uma almofada aquecida (consulte a Tabela de Materiais) e mantenha-os em gaiolas separadas após o despertar.
  9. A partir do primeiro dia após a modelagem, administre 7,5 mg / kg de sorafenibe e fórmula Sanleng Jiashen (7,8 g / kg, 15,6 g / kg e 31,2 g / kg) via gavagem aos camundongos da etapa 3.8 por 14 dias, uma vez ao dia. Administre um volume igual de solução salina normal aos camundongos do grupo modelo.

4. Avaliação de imagem in vivo

NOTA: No dia 14, a imagem ao vivo foi realizada 1 h após o término da administração.

  1. Ligue o computador e o instrumento de imagem in vivo (consulte a Tabela de Materiais). Clique duas vezes no ícone Imagem em Tempo Real na área de trabalho para iniciar o programa. Clique em inicializar sistema IVIS no painel de controle para iniciar todo o sistema IVIS.
    NOTA: Depois que a máquina concluir o autoteste, a luz de status de temperatura no painel de controle ficará vermelha. Aguarde cerca de 5 a 10 minutos após a temperatura cair e a luz ficar verde, a aquisição da imagem pode ser realizada.
  2. Desinfetar o abdômen de camundongos com álcool e injetar intraperitonealmente 10 μL de D-luciferina por g de peso corporal (ver Tabela de Materiais) com uma seringa descartável. Anestesiar camundongos por injeção intraperitoneal de 1%, 50 mg / kg de pentobarbital sódico.
    NOTA: A D-luciferina foi diluída com PBS estéril a 15 mg / mL.
  3. Coloque os camundongos anestesiados na etapa 4.3 na caixa de observação e feche a porta, defina o tempo de exposição como 30 s no painel de controle: Seleção de modo: selecione a luminescência de acordo com o tipo de amostra, selecione o programa automático por padrão e pressione adquirir para adquirir imagens.
  4. Clique em Salvar dados de imagem viva, selecione Todos os arquivos de dados de imagem viva e salve-os na área de trabalho do computador.
  5. Clique na imagem Sair em Vida na tela principal. Desligue a alimentação da câmera, a alimentação do instrumento de imagem e a alimentação do computador.
  6. Após a imagem, eutanasiar os camundongos anestesiados (injeção intraperitoneal de 1%, 50 mg/kg de pentobarbital sódico) por luxação das vértebras cervicais.

5. Coloração de hematoxilina-eosina17

  1. Fixe o tecido hepático fresco de camundongos da etapa 4.7 em paraformaldeído a 4% por 48 h e, em seguida, enxágue com água corrente 3 vezes por 5 minutos de cada vez para lavar o paraformaldeído (consulte a Tabela de Materiais).
  2. Desidrate os tecidos hepáticos na etapa 5.1 em etanol a 30%, etanol a 50%, etanol a 70%, etanol figure-protocol-11620a 95%, etanol figure-protocol-11722a 95% e etanol anidro por 1 h por vez (consulte a Tabela de Materiais).
  3. Coloque os tecidos hepáticos desidratados na etapa 5.2 a 50% de etanol, 50% de xileno, xileno figure-protocol-12003, xileno figure-protocol-12100e xileno figure-protocol-12197 sequencialmente para torná-los transparentes por 1 h (consulte a Tabela de Materiais).
    NOTA: O xileno é volátil e tóxico, esta etapa é realizada na hotte.
  4. Derreta a cera de parafina e mantenha a temperatura em cerca de 55 °C. Coloque os blocos de tecido hepático na etapa 5.3 em uma máquina de inclusão de parafina (consulte a Tabela de Materiais) cheia de solução de cera para incorporação.
  5. Fixe o bloco de cera embutido do tecido hepático de camundongos na etapa 5.4 na máquina de fatiar parafina (consulte a Tabela de Materiais), corte-o em fatias de 5 μm de espessura, coloque as fatias completamente planas em água a 50 ° C e retire-as com uma lâmina. Por fim, coloque-os em uma máquina de cozimento de lenços biológicos para secar 20 min a 70 °C (ver Tabela de Materiais).
  6. Mergulhe as seções de 5 μm na etapa 5.5 em xileno figure-protocol-13217, xileno figure-protocol-13314, etanol figure-protocol-13411anidro e etanol figure-protocol-13515 anidro por 10 min sucessivamente, depois mergulhe em etanol a 95%, etanol a 90%, etanol a 80% e etanol a 70% por 5 min, respectivamente, e finalmente lave com água destilada para tratamento de desparafinação (consulte a Tabela de Materiais).
  7. Tingir as seções de tecido hepático de cera de parafrabina, com 5 μm de espessura, desidratadas com hematoxilina por 8 min e depois enxaguar com água corrente.
  8. Diferencie em solução de ácido clorídrico a 1% por 10 s e enxágue com água corrente por 30 min (consulte a Tabela de Materiais).
  9. Tingir com solução de eosina a 0,5% por 1 min (ver Tabela de Materiais).
  10. Coloque as fatias em álcool figure-protocol-1432795%, álcool figure-protocol-1442795%, etanol figure-protocol-14527anidro, etanol anidro, xileno figure-protocol-14645figure-protocol-14733e xileno figure-protocol-14830 por 5 min cada para desidratar (consulte a Tabela de Materiais).
  11. Sele com goma neutra e tire fotos sob um microscópio de luz invertida (consulte a Tabela de Materiais).

6. Coloração imuno-histoquímica18

  1. Coloque 1,5% de H2O2 nas seções de 5 μm do fígado de camundongo na etapa 5.6 e incube em temperatura ambiente por 10 min, depois lave com PBS por 2 x 5 min (consulte a Tabela de Materiais).
  2. Repare o tecido com uma solução de ácido cítrico (ver Tabela de Materiais) por 5 min e lave com PBS por 3 x 5 min.
  3. Incube com 0,2% de triton X-100 (consulte a Tabela de Materiais) em temperatura ambiente por 4 min, depois incube com 0,5% de triton X-100 em temperatura ambiente por 4 min e lave com PBS.
  4. Adicione soro de cabra (ver Tabela de Materiais) para selar por 15 min e, em seguida, adicione o anticorpo primário ki67 (ver Tabela de Materiais) diluído com PBS (1:300) para incubar a 4 ° C durante a noite. Lave com PBS por 3 x 5 min.
  5. Incubar com anticorpo secundário diluído com PBS (1:200) à temperatura ambiente por 1 h e lavar com PBS por 3 x 5 min (ver Tabela de Materiais).
  6. Manchar com a solução reveladora por 5 min e enxaguar com água bidestilada (ver Tabela de Materiais).
  7. Coloração novamente com hematoxilina por 2 min, diferencie em solução de ácido clorídrico a 1% por 10 s e enxágue com água corrente por 30 min (consulte a Tabela de Materiais).
  8. Coloque as fatias em álcool figure-protocol-1666595%, álcool figure-protocol-1676595%, etanol figure-protocol-16865anidro, etanol anidro, xileno figure-protocol-16983figure-protocol-17071e xileno figure-protocol-17168 por 5 min cada para desidratar (consulte a Tabela de Materiais).
  9. Sele com goma neutra e tire fotos sob um microscópio de luz invertida (consulte a Tabela de Materiais).

7. Teste de membrana corioalantóide de embrião de pintinho19

  1. Deixe os ovos de galinha de penas brancas (ver Tabela de Materiais) em temperatura ambiente por 2 h e borrife com álcool para desinfetar. Faça um furo na câmara de ar com uma broca de crânio (consulte a Tabela de Materiais) e incube os ovos com a câmara de ar por 7 dias (temperatura de incubação 37,8-38,2 ° C e umidade relativa de 65%).
    NOTA: Durante os primeiros 3 dias de incubação, o botão automático de giro do ovo é ligado para evitar que a membrana corioalantóide do embrião de pintinho adira à casca e crie uma câmara de ar falsa.
  2. Descarte os ovos fracos/não fertilizados no iluminador de ovos (consulte a Tabela de Materiais). Retire uma janela de 1 x 1 cm cuidadosamente com uma pinça de olho (consulte a Tabela de Materiais) depois de fazer um furo na câmara de ar falsa com uma broca de caveira (consulte a Tabela de Materiais).
    NOTA: Observe que a casca do ovo não deve cair na membrana corioalantóide do embrião de pintinho.
  3. No dia 8 de incubação, adicione 100 μL de suspensão de células tumorais (1 × 106 células) a cada ovo da câmara de ar falsa, exceto para o grupo controle. Nos grupos de medicamentos, adicione 100 μL de solução de sorafenibe e fórmula Sanleng Jiachen. Nos grupos controle e modelo, adicione 100 μL de PBS.
    NOTA: A suspensão de células tumorais é composta por células HCCLM3 e cola de matriz em igual volume. A concentração do medicamento é definida da seguinte forma: 7,5 mg/kg de sorafenibe e fórmula Sanleng Jiashen (7,8 g/kg, 15,6 g/kg e 31,2 g/kg).
  4. Cubra a janela com um penso transparente (ver Tabela de Materiais) e desinfete com spray de álcool (ver Tabela de Materiais). Após 7 dias de incubação, remova o curativo transparente e adicione 1 mL de fixador (metanol: acetona = 1: 1) (consulte a Tabela de Materiais) da câmara de ar falsa para uma fixação de 30 minutos.
  5. Descarte o fixador com uma seringa de 1 mL. Corte a membrana corioalantóide de ~ 5 x 5 cm na câmara de ar falsa com uma tesoura oftálmica e coloque em uma placa de Petri de 60 mm.
    NOTA: Para membrana corioalantóide de embrião de pintinho com sangue, enxágue com PBS. Para membrana corioalantóide de embrião de galinha presa ao tecido, separe com tesoura oftálmica.
  6. Coloque a membrana corioalantóide da etapa 7.5 sob um microscópio óptico e fotografe os vasos (consulte a Tabela de Materiais).

Resultados

Conforme mostrado na Figura 2A, estabelecemos um modelo de câncer de fígado in situ de camundongos BALB/c-nu e avaliamos o efeito antitumoral da fórmula Sanleng Jiachen. A Figura 2B mostra que a fórmula de Sanleng Jiashen pode suprimir significativamente o crescimento de tumores hepáticos. Os resultados patológicos indicaram que, em comparação com o grupo controle, os focos tumorais no grupo modelo tinham limite...

Discussão

Uma grande quantidade de evidências confirmou que Sanleng, ginseng, ruibarbo e Chuanxiong na fórmula Sanleng Jiashen têm efeitos farmacológicos no tratamento do câncer de fígado. Estudos mostraram que o Sanleng pode inibir significativamente a proliferação e o crescimento de células tumorais para prevenir a invasão e metástase de células tumorais, induzir a apoptose celular e regular o ciclo celular e o microambiente tumoral20. Foi provado que o kaempf...

Divulgações

Os autores não têm nada a divulgar.

Agradecimentos

Este trabalho foi apoiado pela Fundação de Filosofia e Ciências Sociais da China (20VYJ070), pelo Projeto do Departamento de Educação da Província de Jilin (JJKH20230963KJ) e pelo Segundo Lote do Projeto de Engenharia de Acadêmicos Xinglin na Universidade de Medicina Chinesa de Changchun (QNKXJ2-2021 + ZR25).

Materiais

NameCompanyCatalog NumberComments
0.25% trypsin solutionHyClone, AmericaSH30042.01B
1 mL disposable syringeMingankang Medical Equipment Co., Ltd., ChinaRWSB
1% Penicillin & streptomycin solutionHyclone, AmericaSV30010
1.5 mL centrifuge tubeCorning, AmericaMCT-150-C-S
12 cm needle forcepsHesdick, ChinaHKQS-211
6-0 surgical suturesShanghai Jinhuan Medical Equipment Co., Ltd., Shanghai, ChinaCR631
75% alcoholSichuan Youbang Enterprise Co., Ltd., Sichuan, China1.00009E+11
96-well platesNEST, China701001
AcetoneTianjin Dingfu Chemical General Plant, Tianjin, ChinaGB686-89
BALB/c-nu male nude miceBeijing Weitonglihua Experimental Animal Technology Co., Ltd., Beijing, ChinaSYXK(Ji) 2018-0006
Biological tissue baking machineLeica, GermanyLeica HI1220
Cell culture dishNEST, ChinaNEST.706001
Citric acid solutionWuhan Canos Technology Co., Ltd., Wuhan, Chinasj1074
D-luciferinGold Biotechnology®, Inc., ChinaLUCK-100
DMEMHyclone, AmericaSH30243.01
Egg illuminatorShandong Weizhen Incubation Equipment Company, Shandong, ChinaWZSDT
Eosin staining solutionHunan BKMAM Biotechnology Co., Ltd., Hunan, China110703061
Erythromycin eye ointment Cisen Pharmaceutical Co., Ltd., Shanghai, ChinaH37022025
Fetal bovine serumClark, AmericaFB25015 
Fully automatic intelligent chick incubatorShandong Weizhen Incubation Equipment Company, Shandong, China29538
GFP lentivirus solutionSuzhou GenePharma Co.,Ltd., Suzhou, ChinaF22AZ
Goat serumShenyang Wanlei Biotechnology Co., Ltd., Shengyang, ChinaWLA067
Hand-held mouse skull drillSTRONGWT, China190
HCCLM3 cell lineWheLab, Shanghai, ChinaC1010
Heating padZhongke Life Technology Co., Ltd., Hangzhou, ChinaGEJRD-10W
HematoxylinHunan BKMAM Biotechnology Co., Ltd., Hunan, ChinaB-YH250-1
Intelligent decoction potHangzhou Jiuyang living Appliance Co., Ltd., Hangzhou, China3003BQ
 Inverted fluorescence microscopeOlympus, JapanIX73
ki67 primary antibodyWuhan Servicebio Technology Co., Ltd., Wuhan, ChinaGB121141-100
Lodophor disinfectantCofoe Medical Technology Co.,Ltd., Hunan, China202110073
LuciferaseSuzhou GenePharma Co.,Ltd., Suzhou, ChinaE26JZ
Matrix glueCorning, America356234
Medical gauzeYunnan Chenye Biotechnology Co., Ltd., Yunnan, China71712049971
MethanolGuangdong Guanghua Sci-Tech Co., Ltd., Guangdong, China1.17001.023
Ophthalmic scissorHesdick, ChinaHKQS-209
Ophthalmic tweezerHesdick, ChinaHKCL-20
Paraffin embedding machineLeica, Germany EG1150H
Paraffin slicing machineLeica, GermanyLeica CM1950
ParaformaldehydeBiosharp, ChinaBL539A
PBS bufferWuhan Servicebio Technology Co., Ltd., Wuhan, ChinaG2156-1L
PuromycinBeijing Solarbio Science & Technology Co., Ltd., Beijing, ChinaP8230
RefrigeratorThermo Scientific, AmericaTDE40086FV-ULTS
ScalpelHesdick, ChinaHKCL-93
Secondary antibodyWuhan Servicebio Technology Co., Ltd., Wuhan, ChinaGB23301
Small animal live imaging systemCaliper Life Sciences, AmericaIVIS Lumina XR
SorafenibShanghai Aladdin Biochemical Technology Co., Ltd., Shanghai, China284461-73-0 
Transparent dressing3M, America9534HP
Triton X-100Beijing Solarbio Science & Technology Co., Ltd., Beijing, ChinaT8200
Vacuum freeze dryer Ningbo Xinzhi Biotechnology Co., Ltd., Ningbo, Chinasz-10N
White feather chicken eggsShandong Haotai Experimental Animal Breeding Co., Ltd., Shandong, ChinaSCXK(Lu) 20180004
XyleneSigma-Aldrich, , America534056

Referências

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