BALB/c-nuマウスにおける肝癌の確立とSanleng Jiashen製剤の治療効果の検討

要約

ここでは、同所性肝細胞癌のBALB/c-nuマウスに対するSanleng Jiahen製剤の治療効果および血管阻害効果を調査するための段階的なプロトコルを紹介します。

要約

肝臓がんの致死性と化学薬品への耐性により、肝臓がんに対する伝統的なハーブの効果的な処方箋の探求を余儀なくされています。再現性があり、操作が容易で、肝臓がんの病態生理学的プロセスを高度に模倣する動物モデルは、効果的な薬剤候補のスクリーニングを成功させるための前提条件です。一方、信頼性の高い薬効評価指標と手段は、抗肝臓がん薬の研究開発の保証でもあります。

Sanleng Jiashen フォーミュラは、 Sparganium stoloni erum、Buchを含む伝統的な漢方薬の代表的な処方箋です。-ハム。(Sanleng)、 オタネニンジン CA.メイ。(高麗人参)、 Rheum officinale Baill。(ルバーブ)、 およびLigusticum chuanxiong Hort.(Chuanxiong)は、肝臓に栄養を与え、熱を取り除き、毒素を取り除き、肝臓がんを治療するための血液循環を促進するために処方されています。この実験プロトコルは、凍結乾燥されたSanleng Jiashenフォーミュラの調製と、BALB/c-nuマウスにおけるin-situ肝臓癌の確立プロセスについて説明しています。病理組織学的染色、がんマーカーの免疫組織化学的検出、マウスの in vivo イメージング、およびニワトリ胚絨毛尿膜試験を使用して、肝臓がん組織の悪性増殖に対するSanleng Jiahenフォーミュラの阻害および抗血管新生効果を調査しました。データは、Sanleng Jiashen式が、腫瘍量の減少、病理学的損傷の改善、および癌マーカーki67のレベルの低下によって現れる肝臓癌組織の悪性増殖に効果的に抵抗できることを示しています。

血管新生の優れた阻害は、Sanleng Jiashenフォーミュラが肝臓がんの進行と悪化を治療および予防する可能性があることも示唆しています。.全体の実験スキームは、マウスの肝臓がんの治療における伝統的な漢方薬成分の包括的なプロセスを示しており、肝臓がんモデルの確立と最適化、および肝臓がんの予防と治療のための薬の研究開発の参考を提供します。

概要

肝臓がんは、肝臓に由来する致命的ながんであり、世界中で2番目に多いがん関連死の原因です¹。米国と一部の発展途上国の肝臓病率は高いレベルを示しており、2030年までに世界中で100万人以上の肝臓がんの症例が発生する可能性があります^2。喫煙、肥満、飲酒などの不健康な生活習慣や、B型肝炎、C型肝炎、その他のウイルスの被害により、肝臓がんの発生率と死亡率は³年ごとに大幅に増加しています。肝臓がんは、組織学的特徴が異なり予後不良の不均一な悪性腫瘍であるため、肝細胞がん、肝内胆管がん、線維層状^{肝がんなど}、非常に幅広い発生率があります4。肝臓がんは進行した段階で診断されることが多く、多くの進行した患者は放射線療法の候補ではありません⁵。マルチキナーゼ阻害剤であるソラフェニブは、進行性肝がん患者に広く受け入れられている薬剤ですが、患者は短期間で大きな耐性を発現することがよくあります⁶。現在、免疫チェックポイント阻害剤であるPD-1およびPD-L1とソラフェニブの併用により、肝臓がんの発症制御に一定の進歩が見られましたが、その治療効果についてはまだ議論の余地があります⁷。

同所性肝がんは、がん細胞が肝臓組織の周囲に広がったり、臓器間転移を起こさなかったり、肝臓の機能に大きな影響が出ない^など、初期の肝臓がんの一種である8。同所性肝がんは一般に明らかな不快感症状を示さないため、一部の患者は軽度の肝痛、疲労、およびその他の症状を有することがある⁹。臨床診療では、肝臓のカラードップラー超音波検査と強化されたコンピューター断層撮影検査により、肝臓のかなりのスペース占有病変を診断できます¹⁰。転移や転移がなかった局所的な肝臓がんは手術で切除できるが、一定の外科的リスクがあり、患者にとって心理的な負担は避けられない¹¹。化学放射線療法は肝臓がん細胞の全部または一部を殺すことができ、薬物療法を受けている患者の長期的な免疫抑制は治療の有効性に影響を与え、他の疾患のリスクを高める可能性があります¹²。したがって、肝臓がんの早期予防と治療のために安全で効果的な薬物療法を求めることは、肝臓がんの進行と悪化を抑制するための鍵です。

肝臓がんを治療する漢方薬の原則は、体内のバランスと調和の概念に基づいています。中国医学では、肝臓がんは、肝臓に影響を与える気として知られる体のエネルギーの不均衡または不調和と見なしています¹³。肝臓がんの漢方治療には、漢方薬、鍼灸、食事療法、ライフスタイルの推奨など、さまざまなアプローチが含まれます。その原理は、気のバランスを回復し、体の防御メカニズムを強化し、体の自己治癒能力を促進することです^14,15。伝統的な中国医学の肝臓がんは、「ティンパナイト」と「肝臓の蓄積」のカテゴリーに属します。「黄帝の内正典」がその症状の詳細な記録を持っていると早くも、肝臓癌はうっ血と正気欠乏症によって引き起こされ、うっ血を取り除き、鼓膜を排除し、体の抵抗を強化して体質を強化することによって治療されます¹³。三嶺丸薬は、元王朝の有名な医師である羅天一によって書かれた本「WeishengBaojian」に由来します。それは3種類の薬で構成されています:Sparganium stoloni erum、Buch。-ハム。(Sanleng)、Ligusticum chuanxiong Hort.(Chuanxiong)、およびRheum officinale Baill。(ルバーブ)。これらの3種類の薬物は、肝臓の経絡に入ることができ、肝臓癌の治療に治療的価値があります¹⁴。Sanleng Jiashenフォーミュラは、Sanlengの16 g、Panax ginseng C.A.Meyの16 gで構成されています。(高麗人参)、ルバーブ8g、チュアンション2g(図1)は、肝臓を強壮し、熱を清め、毒素を排除し、血液循環を促進するために処方されます。これらのハーブには抗がん作用があり、腫瘍の成長を抑え、症状を緩和し、全体的な健康状態を改善するのに役立つと考えられています。以前のin vitro実験では、Sanleng Jiashen式は肝臓癌細胞の増殖を阻害することができる¹⁵。しかし、肝臓がんに対する漢方化合物の阻害効果を効率的かつ合理的に評価するにはどうすればよいでしょうか?BALB/c-nu in situ肝臓がんモデルを確立することにより、Sanleng Jiashenフォーミュラの肝臓がんおよび血管新生に対する阻害効果を、主に小動物のライブイメージングとニワトリ胚絨毛尿膜試験を通じて調査しました。

プロトコル

特定の病原体を持たず、生後5週間、体重18-22gのBALB/c-nu雄ヌードマウスを吉林大学トランスフォーメーション医科大学動物実験センターで給餌した。給餌条件は22°C〜24°Cで、相対湿度は40%〜60%でした。実験動物免許番号はSYXK(Ji)2018-0006で、実験プロセスは吉林大学倫理委員会の規則と規制に準拠しており、動物倫理承認番号は20221228-01です。

1.凍結乾燥Sanleng Jiashen式¹⁵の調製

1. Sanleng16 g、高麗人参16 g、ルバーブ8 g、Chuanxiong2 gをインテリジェント煎じ薬ポット( 材料表を参照)に入れ、294 mLの脱イオン水に室温で30分間浸します。加熱して沸騰させた後、100°Cで30分間調理を続け、二重の医療用ガーゼで液体をろ過します( 材料の表を参照)。残渣に252 mLの脱イオン水を加え、100°Cで30分間調理し、液体を二重ガーゼでろ過します。
2. ステップ1.1の濾液を清潔なステンレス製の皿に集め、-80°Cで12時間凍結します( 材料の表を参照)。
3. ステップ1.2のSanleng Jiashenフォーミュラを真空凍結乾燥機( 材料の表を参照)(コールドトラップ温度:-55°C)に入れ、48時間乾燥させてSanleng Jiashenフォーミュラの凍結乾燥粉末を取得します。

2. ルシフェラーゼを安定的に発現するHCCLM3細胞株の構築¹⁶

1. 24ウェルプレート(材料表を参照)にHCCLM3細胞懸濁液1.0 mLを5個×10個/ウェルで加え、3 μg/mLピューロマイシンを含む完全培地(10%ウシ胎児血清+1%ペニシリン-ストレプトマイシン溶液+ DMEM)(材料表を参照)で細胞インキュベーター(37°C、5%CO 2、5%_CO2、1000μm未満)で72時間培養します。 資料の表を参照)。
2. ステップ2.1で細胞上清を捨て、0.25%トリプシン溶液100 μLを加えて、細胞インキュベーターで細胞を1分間消化します( 材料の表を参照)。300 μLの完全培地を加え、ピペットを使用して接着細胞を遊離し、消化を終了します。すべての細胞懸濁液を回収し、15 mLの遠心チューブに室温1,000 × g で5分間入れます。上清を捨てた後、1 mLの完全培地を加え、ピペッティングで混合します。
3. ステップ2.2の4 ×^{10 3} HCCLM3細胞/ウェルの細胞懸濁液100 μLを96ウェルプレートに加え、細胞インキュベーターで24時間(37°C、5%CO₂、 材料表を参照)培養します。
4. ステップ2.3で0.27 μLのGFPレンチウイルスを96ウェルプレートに加え、細胞インキュベーターで15時間培養します(37°C、5%CO₂、 材料表を参照)。細胞上清を捨て、100 μLの完全培地を加え、蛍光顕微鏡を用いて励起波長488 nm、発光波長507 nmの画像を取得します( 材料表を参照)。
5. GFPレンチウイルス2mLを交換し、24時間培養を続けます。GFPレンチウイルスを含まない2 mLの完全培地をさらに24時間交換します。
   注:GFPレンチウイルスのHCCLM3細胞へのトランスフェクション効率は、倒立蛍光顕微鏡で観察されたように80%でした。
6. ステップ2.1の2 × 10⁵ 細胞懸濁液5 mLを60 mmシャーレに加え、細胞インキュベーターで24時間培養します。64.5 μLのルシフェラーゼを加え、細胞インキュベーターで15時間培養します(37°C、5%CO₂、 材料の表を参照)。
7. 上清を捨て、5 mLの完全培地を加えて、細胞がペトリ皿内で90%コンフルエントになるまで培養を続けます。細胞上清を捨て、2 x 1 mLのPBSで洗浄し、0.25%トリプシン溶液1 mLを加えて、細胞インキュベーターで細胞を1分間消化します(37°C、5%CO₂、 材料の表を参照)。3 mLの完全培地を加え、ピペットで上下に動かして遊離付着細胞まで調製を終了します。その後のマウス注射のために、すべての細胞懸濁液を回収します。
   注:十分な数の細胞を得るために、細胞を連続的に継代し、培養した。

3. BALB/c-nuヌードマウスを用いた肝臓癌のin situ モデルの構築と治療¹⁵

1. ステップ2.7でルシフェラーゼをトランスフェクトした1 × 10⁷ HCCLM3細胞100 μLとマトリックス接着剤100 μL( 材料表を参照)を1.5 mL遠心チューブ( 材料表を参照)に加え、1 mLピペット(材料表を参照)で軽く混合します( 材料表を参照)。
   注:溶液調製の全プロセスは、マトリックス接着剤が硬化するのを防ぐために氷上で実行する必要があります。
2. BALB/c-nuヌードマウスの左右の脇の下をヨードピンで消毒し( 材料の表を参照)、アルコールで脱ヨウ素化します( 材料の表を参照)。
3. ステップ3.1のHCCLM3細胞とマトリックス接着剤の混合物100μLを、1mLの使い捨て注射器でBALB/c-nuヌードマウスの左右の脇の下にゆっくりと注入します。
   注:約10日後、BALB / c-nuヌードマウスは、両側の脇の下注射部位に約0.5 cm³ の腫瘍塊を発症しました。
4. ステップ 3.3 で BALB/c-nu ヌードマウスを 1%、50 mg/kg ペントバルビタールナトリウムの腹腔内注射で麻酔します。両脇の下の皮膚を眼科用ハサミとピンセットで切開し(材料表参照)、皮下腫瘍塊をやさしく剥がして、予冷したPBS緩衝液を入れた細胞培養皿(材料表参照)に入れ(材料表参照)、メスで1mm3個に切ります(材料表参照)。
   注:BALB/c-nuヌードマウスの脇の下の腫瘍塊は、腫瘍細胞の活性を維持し、モデルの成功率を高めるために、0.5時間以内に氷上で採取する必要があります。サンプリングの終了時に、マウスは頸椎の除去によって死滅しました。腫瘍に壊死性部分がある場合は、それを切除する必要があり、同所性癌移植中の感染を防ぐために魚の白い腫瘍だけを残します。
5. BALB/c-nuヌードマウスを1%、50 mg / kgのペントバルビタールナトリウム腹腔内麻酔( 材料の表を参照)、腹部をヨウ素で消毒し( 材料の表を参照)、アルコールで脱ヨウ素化します( 材料の表を参照)。.
6. 眼科用ハサミとピンセット( 材料の表を参照)を使用して、剣状突起の下の0.5cmの位置で約1cmの45°の外科的切開を切開して肝臓を露出させ、肝臓を優しく押して肝臓組織を絞り出し、肝臓を計量紙で固定します。
   注:綿棒やスティックをマウスの肋骨の下に置くと、肝臓を効果的に露出させることができます。
7. ステップ 3.4 で腫瘍組織の小片を 10 mL の使い捨て注射針で取り、腫瘍塊を肝臓と平行に約 0.5 cm の肝臓に移植して肝臓カプセルの下に固定し、針をゆっくりと引き抜きます。
   注:1 mLの使い捨てシリンジを使用して、溶かしたマトリックス接着剤を2滴滴下し、偶発的な滑りや出血なしに腫瘍塊を観察してから、外科的切開部を縫合します。
8. 12cmの針保持鉗子と6-0の外科用縫合糸で外科的切開を閉じます( 材料の表を参照)。エリスロマイシン眼軟膏( 材料の表を参照)を手術部位に塗布して、感染を防ぎます。.マウスを加熱パッド( 材料の表を参照)に置き、目覚めた後は別々のケージに保管します。
9. モデリングの初日から、7.5 mg/kg のソラフェニブと Sanleng Jiashen 製剤 (7.8 g/kg、15.6 g/kg、31.2 g/kg) をステップ 3.8 からマウスに強制経口投与し、1 日 1 回 14 日間投与します。モデルグループのマウスに等量の生理食塩水を投与します。

4. in vivo イメージング評価

注:14日目に、投与終了後1時間後にライブイメージングを行いました。

1. コンピュータと in vivo イメージング機器の電源を入れます( 資料の表を参照)。デスクトップの Living Imageアイコン をダブルクリックして、プログラムを起動します。コントロールパネルの「 IVISシステムの初期化 」をクリックして、IVISシステム全体を起動します。
   注意: マシンがセルフテストを完了すると、コントロールパネルの温度ステータスライトが赤になります。温度が下がってライトが緑色に変わった後、約5〜10分待つと、画像取得を行うことができます。
2. マウスの腹部をアルコールで消毒し、使い捨て注射器で体重1gあたり10μLのD-ルシフェリン( 材料の表を参照)を腹腔内に注射します。.1%、50 mg / kgのペントバルビタールナトリウムの腹腔内注射によりマウスを麻酔します。
   注:D-ルシフェリンは滅菌PBSで15 mg / mLに希釈されました。.
3. ステップ4.3で麻酔をかけたマウスを観察ボックスに入れてドアを閉め、コントロールパネルで露光時間を30秒に設定します: モード選択:サンプルタイプに応じて 発光 を選択し、デフォルトで 自動プログラム を選択し、 取得 を押して画像を取得します。
4. [ Living Image Dataを保存]をクリックし、[ All Living Image Data Files]を選択して、コンピューターのデスクトップに保存します。
5. メイン画面のLiving画像で終了をクリックします。カメラの電源、イメージング機器の電源、コンピューターの電源を順番にオフにします。
6. イメージング後、麻酔マウスを安楽死させます(腹腔内注射1%、ペントバルビタールナトリウム50mg / kg)頸椎脱臼により。

5. ヘマトキシリン-エオシン染色¹⁷

1. ステップ4.7のマウスの新鮮な肝臓組織を4%パラホルムアルデヒドで48時間固定し、その後、パラホルムアルデヒドを洗い流すために、毎回5分間、流水で3回すすぎます( 材料の表を参照)。
2. ステップ5.1で肝臓組織を30%エタノール、50%エタノール、70%エタノール、95%エタノール 、95%エタノール 、および無水エタノールで順番に1時間脱水します( 材料の表を参照)。
3. 脱水した肝臓組織をステップ5.2〜50%エタノール、50%キシレン、キシレン 、キシレン 、キシレン 順に並べて、1時間透明にします( 材料の表を参照)。
   注:キシレンは揮発性で有毒であり、このステップはヒュームフード内で行われます。
4. パラフィンワックスを溶かし、温度を約55°Cに保ちます。 ステップ5.3の肝臓組織ブロックを、ワックス溶液で満たされたパラフィン包埋機( 材料の表を参照)に埋め込みます。
5. ステップ5.4でマウス肝臓組織の埋め込みワックスブロックをパラフィンスライス機( 材料表を参照)に固定し、厚さ5μmのスライスにカットし、スライスを50°Cの水で完全に平らに置き、スライドですくい上げます。最後に、生体組織焼成機にかけ、70°Cで20分間乾燥させます( 材料の表を参照)。
6. ステップ 5.5 の 5 μm 切片をキシレン 、キシレン 、無水エタノール 、および無水エタノール に 10 分間連続して浸漬し、次に 95% エタノール、90% エタノール、80% エタノール、および 70% エタノールにそれぞれ 5 分間浸漬し、最後に蒸留水で洗浄して脱ロウ処理を行います ( 材料の表を参照)。
7. 脱水した厚さ5μmのパラフィンワックス肝臓組織切片をヘマトキシリンで8分間染色し、流水ですすいでください。
8. 1%塩酸溶液で10秒間分化し、流水で30分間すすぎます( 材料の表を参照)。
9. 0.5%エオシン溶液で1分間染色します( 材料の表を参照)。
10. スライスをアルコール95% 、アルコール95% 、無水エタノール 、無水エタノール 、キシレン 、キシレン にそれぞれ5分間入れて脱水します( 材料の表を参照)。
11. 中性ガムで密封し、倒立型光学顕微鏡で写真を撮ります( 材料の表を参照)。

6. 免疫組織化学染色¹⁸

1. ステップ5.6でマウス肝臓の5 μm切片に1.5% H₂O₂ を滴下し、室温で10分間インキュベートした後、PBSで2 x 5分間洗浄します( 材料の表を参照)。
2. クエン酸溶液( 材料表を参照)で組織を修復し、PBSで3 x 5分間洗浄します。
3. 0.2% triton X-100( 材料表参照)と室温で4分間インキュベートし、次に0.5% triton X-100と室温で4分間インキュベートし、PBSで洗浄します。
4. ヤギ用血清( 材料表を参照)を添加して15分間密封した後、PBS(材料表)で希釈したki67一次抗体( 材料表を参照)を添加し、4°Cで一晩インキュベートします。PBSで3 x 5分間洗浄します。
5. PBS(1:200)で希釈した二次抗体と室温で1時間インキュベートし、PBSで3 x 5分間洗浄します( 材料表を参照)。
6. 現像液で5分間染色し、二重蒸留水ですすいでください( 材料の表を参照)。
7. ヘマトキシリンで2分間再染色し、1%塩酸溶液で10秒間分化し、流水で30分間すすぎます( 材料の表を参照)。
8. スライスを95%アルコール 、95%アルコール 、無水エタノール 、無水エタノール 、キシレン 、キシレン にそれぞれ5分間入れて脱水します( 材料の表を参照)。
9. 中性ガムで密封し、倒立光学顕微鏡で写真を撮ります( 材料の表を参照)。

7. ニワトリ胚絨毛尿膜試験¹⁹

1. 白い羽毛の鶏の卵( 材料の表を参照)を室温で2時間放置し、アルコールをスプレーして消毒します。ドクロドリルで空気室に穴を開け( 材料表を参照)、空気室を上げて卵を7日間インキュベートします(インキュベーション温度37.8-38.2°C、相対湿度65%)。
   注:孵卵の最初の3日間は、ニワトリ胚の絨毛尿膜が殻に付着して偽の空気室を作るのを防ぐために、自動卵回転ボタンがオンになります。
2. 弱い/未受精の卵を卵イルミネーターに捨てます( 材料の表を参照)。ドクロドリルで偽の空気室に穴を開けた後(材料の表を参照)、アイピンセット( 材料の表を参照)で1 x 1 cmの窓を慎重に剥がします( 材料の表を参照)。
   注:卵殻がニワトリ胚の絨毛尿膜に落ちないように注意してください。
3. インキュベーションの8日目に、対照群を除く偽の空気室から各卵子に100μLの腫瘍細胞懸濁液(1×10⁶ 細胞)を追加します。薬剤群では、100μLのソラフェニブ溶液とSanleng Jiashen製剤を追加します。.コントロールグループとモデルグループで、PBSを100μL追加します。
   注:腫瘍細胞懸濁液は、HCCLM3細胞とマトリックス接着剤を等量で構成しています。薬物濃度は次のように設定されます:7.5 mg / kgソラフェニブとSanleng Jiashenフォーミュラ(7.8 g / kg、15.6 g / kg、および31.2 g / kg)。.
4. 窓を透明なドレッシングで覆い( 材料の表を参照)、アルコールスプレーで消毒します( 材料の表を参照)。7日間のインキュベーション後、透明包帯をはがし、フェイクエアチャンバーから1 mLの固定剤(メタノール:アセトン = 1:1)( 材料表を参照)を加えて30分間固定します。
5. 固定液を1mLのシリンジで廃棄します。眼科用ハサミで偽の空気室で~5 x 5 cmの絨毛尿膜を切断し、60 mmのシャーレに入れます。
   注:血液を含むニワトリ胚絨毛尿膜の場合は、PBSですすいでください。ニワトリ胚の絨毛尿膜が組織に付着している場合は、眼科用ハサミで分離します。
6. ステップ7.5の絨毛尿膜を光学顕微鏡の下に置き、血管を撮影します( 材料の表を参照)。

結果

図2Aに示すように、BALB/c-nuマウスのin-situ肝臓がんモデルを確立し、Sanleng Jiashen式の抗腫瘍効果を評価しました。図2Bは、Sanleng Jiashen式が肝臓腫瘍の成長を大幅に抑制できることを示しています。病理学的結果から、モデル群の腫瘍病巣は対照群と比較して、周囲組織との境界が明確で、腫瘍病巣が大きく、結節性拡?...

ディスカッション

Sanleng Jiashenフォーミュラに含まれるSanleng、高麗人参、ルバーブ、Chuanxiongが肝臓がんの治療に薬理学的効果があることは、大量の証拠で確認されています。研究によると、Sanlengは腫瘍細胞の増殖と増殖を大幅に阻害して、腫瘍細胞の浸潤と転移を防ぎ、細胞アポトーシスを誘導し、細胞周期と腫瘍微小環境を調節できることが示されています²⁰。Sanl...

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.25% trypsin solution	HyClone, America	SH30042.01B
1 mL disposable syringe	Mingankang Medical Equipment Co., Ltd., China	RWSB
1% Penicillin & streptomycin solution	Hyclone, America	SV30010
1.5 mL centrifuge tube	Corning, America	MCT-150-C-S
12 cm needle forceps	Hesdick, China	HKQS-211
6-0 surgical sutures	Shanghai Jinhuan Medical Equipment Co., Ltd., Shanghai, China	CR631
75% alcohol	Sichuan Youbang Enterprise Co., Ltd., Sichuan, China	1.00009E+11
96-well plates	NEST, China	701001
Acetone	Tianjin Dingfu Chemical General Plant, Tianjin, China	GB686-89
BALB/c-nu male nude mice	Beijing Weitonglihua Experimental Animal Technology Co., Ltd., Beijing, China	SYXK(Ji) 2018-0006
Biological tissue baking machine	Leica, Germany	Leica HI1220
Cell culture dish	NEST, China	NEST.706001
Citric acid solution	Wuhan Canos Technology Co., Ltd., Wuhan, China	sj1074
D-luciferin	Gold Biotechnology®, Inc., China	LUCK-100
DMEM	Hyclone, America	SH30243.01
Egg illuminator	Shandong Weizhen Incubation Equipment Company, Shandong, China	WZSDT
Eosin staining solution	Hunan BKMAM Biotechnology Co., Ltd., Hunan, China	110703061
Erythromycin eye ointment	Cisen Pharmaceutical Co., Ltd., Shanghai, China	H37022025
Fetal bovine serum	Clark, America	FB25015
Fully automatic intelligent chick incubator	Shandong Weizhen Incubation Equipment Company, Shandong, China	29538
GFP lentivirus solution	Suzhou GenePharma Co.,Ltd., Suzhou, China	F22AZ
Goat serum	Shenyang Wanlei Biotechnology Co., Ltd., Shengyang, China	WLA067
Hand-held mouse skull drill	STRONGWT, China	190
HCCLM3 cell line	WheLab, Shanghai, China	C1010
Heating pad	Zhongke Life Technology Co., Ltd., Hangzhou, China	GEJRD-10W
Hematoxylin	Hunan BKMAM Biotechnology Co., Ltd., Hunan, China	B-YH250-1
Intelligent decoction pot	Hangzhou Jiuyang living Appliance Co., Ltd., Hangzhou, China	3003BQ
Inverted fluorescence microscope	Olympus, Japan	IX73
ki67 primary antibody	Wuhan Servicebio Technology Co., Ltd., Wuhan, China	GB121141-100
Lodophor disinfectant	Cofoe Medical Technology Co.,Ltd., Hunan, China	202110073
Luciferase	Suzhou GenePharma Co.,Ltd., Suzhou, China	E26JZ
Matrix glue	Corning, America	356234
Medical gauze	Yunnan Chenye Biotechnology Co., Ltd., Yunnan, China	71712049971
Methanol	Guangdong Guanghua Sci-Tech Co., Ltd., Guangdong, China	1.17001.023
Ophthalmic scissor	Hesdick, China	HKQS-209
Ophthalmic tweezer	Hesdick, China	HKCL-20
Paraffin embedding machine	Leica, Germany	EG1150H
Paraffin slicing machine	Leica, Germany	Leica CM1950
Paraformaldehyde	Biosharp, China	BL539A
PBS buffer	Wuhan Servicebio Technology Co., Ltd., Wuhan, China	G2156-1L
Puromycin	Beijing Solarbio Science & Technology Co., Ltd., Beijing, China	P8230
Refrigerator	Thermo Scientific, America	TDE40086FV-ULTS
Scalpel	Hesdick, China	HKCL-93
Secondary antibody	Wuhan Servicebio Technology Co., Ltd., Wuhan, China	GB23301
Small animal live imaging system	Caliper Life Sciences, America	IVIS Lumina XR
Sorafenib	Shanghai Aladdin Biochemical Technology Co., Ltd., Shanghai, China	284461-73-0
Transparent dressing	3M, America	9534HP
Triton X-100	Beijing Solarbio Science & Technology Co., Ltd., Beijing, China	T8200
Vacuum freeze dryer	Ningbo Xinzhi Biotechnology Co., Ltd., Ningbo, China	sz-10N
White feather chicken eggs	Shandong Haotai Experimental Animal Breeding Co., Ltd., Shandong, China	SCXK(Lu) 20180004
Xylene	Sigma-Aldrich, , America	534056