Evaluación dinámica multiparamétrica de la función plaquetaria mediante un biosensor capacitivo

Resumen

Aquí se presenta un protocolo para un nuevo ensayo funcional plaquetario multiparamétrico dinámico utilizando un biosensor capacitivo. Este enfoque, diseñado dentro de un microambiente semirrígido para mejorar la relevancia fisiológica, proporciona tres parámetros de salida sensibles al recuento de plaquetas, las fuerzas de estimulación y las vías de activación.

Resumen

Las plaquetas desempeñan un papel fundamental en la coagulación de la sangre a través de una serie de respuestas reguladas, que incluyen la adhesión, la propagación, la secreción granular, la agregación y la contracción del citoesqueleto. Sin embargo, los ensayos actuales se limitan al análisis parcial de la función plaquetaria en condiciones no fisiológicas. Por lo tanto, es necesario un ensayo mejorado que refleje la naturaleza dinámica y multifacética de la función plaquetaria en entornos fisiológicos. En este contexto, se introduce un enfoque novedoso para medir varios parámetros clave relacionados con la función plaquetaria en un microambiente semirrígido ex vivo más relevante fisiológicamente en comparación con los ensayos tradicionales. Este método utiliza un biosensor eléctrico avanzado, el sensor de capacitancia de membrana (MCS), que proporciona información única sobre el proceso de coagulación a través de tres lecturas distintas. Estas lecturas son muy sensibles a las variaciones en el recuento de plaquetas, la intensidad de la estimulación y las vías de activación específicas. Como plataforma de detección puramente eléctrica, el MCS demuestra un potencial significativo como herramienta de diagnóstico para detectar trastornos de la función hemostática primaria, evaluar la eficacia de los tratamientos terapéuticos y avanzar en la comprensión más amplia de las funciones de las plaquetas en la hemostasia y la trombosis.

Introducción

Las plaquetas, células sanguíneas especializadas, son fundamentales para orquestar la respuesta hemostática para detener el sangrado después de una lesión y para facilitar la curación de^{los vasos} sanguíneos. Además, también sirven como mediadores cruciales en la trombosis, una de las principales causas de muertes relacionadas con la enfermedad tromboembólica a nivel mundial 2,3,4,5,6. Cuando se produce una lesión vascular, las plaquetas se someten a una serie de procesos funcionales complejos, regulados y en múltiples etapas. Estos incluyen la adhesión a la matriz intimal, una afluencia de calcio intracelular que desencadena cambios conformacionales en las plaquetas, activación, secreción de gránulos, agregación y contracción del citoesqueleto, formando y estabilizando tapones hemostáticos para sellar los sitios dañados y prevenir el sangrado ^7,8. A pesar de los avances significativos en los fármacos antiagregantes plaquetarios y en las estrategias terapéuticas ^9,10,11, el riesgo de trombosis persiste. El manejo de la terapia antiplaquetaria presenta desafíos, incluyendo el riesgo de sangrado iatrogénico, la dificultad para lograr la eficacia antitrombótica mientras se mantiene la hemostasia y la variabilidad en la respuesta del paciente, incluida la resistencia a los medicamentos^12,13.

Aunque los mecanismos moleculares que gobiernan las fases de respuesta plaquetaria están bien documentados, los métodos actuales para evaluar la función plaquetaria siguen siendo subóptimos. Las pruebas tradicionales de laboratorio a menudo se quedan cortas, ya que solo evalúan aspectos limitados de la actividad plaquetaria en etapa temprana a media, como la adhesión, la agregación o la viscosidad del coágulo 7,14,15,16,17,18. Este análisis parcial puede conducir a una información insuficiente. Además, estas pruebas no ofrecen una evaluación simultánea, continua y rápida de múltiples elementos funcionales plaquetarios cruciales dentro de un solo ensayo. En consecuencia, esta limitación dificulta los avances tanto en hematología clínica como experimental. Con el tiempo, se han desarrollado una gran cantidad de sensores impedimétricos o capacitivos para diversas aplicaciones biomédicas 19,20,21,22,23,24,25,26,27,28.

En este trabajo se presenta el protocolo para la evaluación de la función plaquetaria multiplexada mediante un biosensor capacitivo. El enfoque propuesto ofrece una característica atractiva al monitorear sensiblemente los cambios dinámicos en un amplio espectro de funciones plaquetarias a nivel celular. El enfoque presentado utiliza un biosensor compuesto por dos microchips: un chip de silicona superior, que es desechable, con un pocillo de muestra para plasma rico en plaquetas citrato y un electrodo de detección recubierto con fibronectina humana para facilitar la adhesión de las plaquetas, junto con un chip de silicona inferior reutilizable que alberga un electrodo de referencia. La medición continua de los cambios dinámicos en la capacitancia durante todo el proceso de coagulación, que abarca la adhesión, activación y postactivación de las plaquetas, permite un análisis sensible relacionado con las variaciones en los recuentos de plaquetas, los niveles de activación de las plaquetas y la inhibición de las vías de activación. La viabilidad clínica y la utilidad de este método se demostraron utilizando muestras de plasma humano pertinentes, lo que subraya su potencial para una evaluación sólida de la función plaquetaria en entornos clínicos.

Protocolo

La propuesta de estudio fue aprobada por la División de Sujetos Humanos (HSD) de la Junta de Revisión Interna de la Universidad de Washington (UW-IRB; ID del estudio: STUDY00005211). Todos los sujetos voluntarios que participaron en el estudio dieron su consentimiento informado por escrito. Los detalles de los reactivos y equipos utilizados en este estudio se enumeran en la Tabla de Materiales.

1. Pasos de fabricación del sensor capacitivo de membrana (MCS)

NOTA: El sensor MCS se fabricó utilizando técnicas tradicionales de microfabricación. Este biosensor estaba compuesto por un chip de capacitancia de membrana (MCC) superior (T-) e inferior (B-). Brevemente, los pasos de fabricación se muestran en la Figura 1.

1. Pasos de microfabricación para T-MCC (Figura 1A)
   1. Diseñe el diseño del T-MCC utilizando un software de diseño CAD estándar para un sustrato de oblea de silicio de 4 pulgadas.
   2. Transfiera el diseño a una fotomáscara de vidrio de cromo utilizando el proceso estándar de fabricación de máscaras^29,30.
   3. Sobre un sustrato limpio de silicio pulido de doble cara (400 μm de espesor), deposite 500 nm de espesor de Si₃N₄ utilizando la técnica estándar de deposición química de vapor a baja presión (LPCVD)³¹. Aplicar una capa de centrifugado de 12 μm de fotorresistencia AZ 9260 a 2000 rpm durante 25 s utilizando un barnizador de centrifugación manual.
   4. Utilizando la técnica estándar de fotolitografía UV³², modele la fotorresistencia, que implica exponer la fotorresistencia con la fotomáscara de vidrio cromado en un alineador UV, y desarrollar la resistencia en una solución reveladora para eliminar la región expuesta a los rayos UV de la resistencia.
   5. Modele la capa subyacente de nitruro de silicio de 500 nm de espesor mediante un proceso de grabado iónico reactivo, que expone el sustrato de silicio.
   6. Elimine el sustrato de silicio de 400 μm de espesor expuesto utilizando un proceso estándar de Bosch: Proceso de grabado de iones reactivos profundos³³.
   7. Calcule el número deseado de ciclos de grabado para eliminar 400 μm de silicio.
      NOTA: Esto variará dependiendo de la herramienta que se utilice para el proceso, ya que influirán en la velocidad de grabado (en este caso, fue de 1,8 μm/ciclo).
   8. Para evitar el grabado accidental de la capa de Si₃N₄ , detenga el grabado en seco al menos 10 μm antes (es decir, a 390 μm). Retire el silicio restante utilizando el KOH tradicional altamente selectivo a 80 °C durante 5 min.
   9. Deposite 20 nm de capas metálicas de Cr y 150 nm de Au consecutivamente utilizando un proceso de evaporación por haz de E³⁴ y una máscara de sombra para fabricar el electrodo de detección en el T-MCC.
   10. En esta etapa, los T-MCC en la oblea estarán conectados por pequeños soportes de silicio. Separe los T-MCC perforando cuidadosamente los pequeños soportes.
2. Pasos de microfabricación para B-MCC (Figura 1B)
   1. Sobre un sustrato limpio de silicio oxidado térmicamente (400 μm de espesor), deposite capas de metal de Cr/Au (20 nm, 150 nm) utilizando una máscara de sombra, similar al paso 1.1.9.
   2. Utilice fotolitografía^{estándar 32} con alineación trasera, seguida de un paso de grabado en húmedo KOH para liberar los B-MCC.
      NOTA: El T- y el B-MCC tienen almohadillas de contacto de 2,5 x 1,5 cm.

2. Biofuncionalización del sensor capacitivo

NOTA: Brevemente, este paso consiste en recubrir el electrodo T-MCC con fibronectina humana (Fn) para facilitar la fijación de las plaquetas al sensor.

1. Antes de los recubrimientos biomoleculares, limpie el electrodo de detección con plasma de oxígeno durante 45 s a 100 W.
2. Agregue 1-dodecanetiol (1 mM) en etanol de 200 grados al pocillo de muestra en T-MCC.
3. Coloque los T-MCC en un recipiente lleno de nitrógeno seco, sellado y envuelto con parafilm durante 24-48 h.
4. Enjuague la superficie de oro con agua desionizada y etanol de prueba 200, seguido de un secado con nitrógeno a temperatura ambiente. En esta etapa, almacene los sensores a 2-8 °C en una atmósfera de nitrógeno seco hasta los siguientes pasos.
5. Añadir solución de Fn en solución salina tamponada con fosfato (PBS, 50 μg/mL) al pocillo 12 h antes de la medición e incubar a 37 °C durante 2-8 h.

3. Configuración del sensor de capacitancia

NOTA: La figura 2 representa la fotografía de la configuración experimental.

1. Utilice un medidor LCR con microposicionadores y sondas de aguja para hacer contacto eléctrico con el sensor.
2. Emplee accesorios de plástico impresos en 3D (consulte la tabla de materiales) para colocar de forma segura el T- y el B-MCC. El accesorio inferior está equipado con topes en el eje x-y para garantizar una alineación precisa del T-MCC sobre el B-MCC para formar un condensador.
   NOTA: Todas las impresoras 3D utilizadas eran de la Universidad de Washington.
3. Aplique una señal sinusoidal (0,5 V) a 100 kHz y una frecuencia de muestreo de 8 Hz.

4. Preparación de plasma rico en plaquetas citrato (c-PRP)

NOTA: Todas las muestras de sangre fueron de voluntarios que participaron en esta investigación. Ninguno de los participantes tenía una anormalidad plaquetaria o un trastorno de coagulación previamente conocidos, y no habían tomado ningún medicamento plaquetario, incluidos los antiinflamatorios no esteroideos (AINE), en las dos semanas anteriores a la recolección de la muestra. Un flebotomista autorizado realizó una extracción de sangre utilizando una aguja de 21 G en tubos de citrato estándar al 3,2%. El primer 1 mL se desechó para evitar la contaminación del factor tisular. Las muestras se transportaron en un contenedor de poliestireno y todas las mediciones se realizaron dentro de las 6 horas posteriores a la extracción de sangre.

1. Centrifugar la muestra de sangre entera a 200 x g durante 10 min a 20 °C para obtener c-PRP.
2. Transfiera el c-PRP a un recipiente estéril y realice el recuento de plaquetas. En el caso de los estudios de inhibidores, incube el c-PRP con una concentración predefinida del fármaco en el tampón de Tyrode (consulte la sección Resultados para obtener más información).

5. Ensayo funcional de plaquetas

NOTA: El esquema del ensayo funcional plaquetario presentado se muestra en la Figura 3.

1. Ensamble el T- y el B-MCC en los accesorios impresos en 3D.
2. Mida la medición de capacitancia de referencia durante 5 minutos, luego agregue 45 μL de c-PRP al pocillo de muestra en el T-MCC.
3. Espere 30 minutos para que las plaquetas se adhieran al electrodo recubierto de Fn en el T-MCC.
4. Retire 30 μL del c-PRP con cuidado sin tocar las plaquetas adheridas a la membrana, y reponga inmediatamente con el tampón Tyrode. Repita el lavado al menos 5 veces con un intervalo de 20 segundos para asegurarse de que no caigan plaquetas o macroagregados adicionales en el electrodo sensor después de la activación.
5. Añadir 10 μL de la solución agonista (trombina o ADP) a la concentración deseada. Permita un tiempo de equilibrio de 80 minutos.

6. Análisis de datos y estadísticas para los marcadores de señal

NOTA: La capacitancia se mide continuamente desde los pasos 5.2-5.5.

1. Para la señal de capacitancia durante la fase de adhesión (paso 5.3), mida el cambio máximo en la capacitancia después del tiempo de equilibrio de 30 min, que se denomina ΔC_adh.
2. De manera similar, para la fase de activación (paso 5.5), mida el cambio máximo en la capacitancia, que se conoce como _acto Δ C, y la pendiente de la curva entre 200 y 300 s después de la activación, que se conoce como _acto S.
3. Utilice el análisis de varianza (ANOVA) con el post-hoc de Tukey para comparar los resultados entre los grupos. Utilice la bondad de ajuste de Shapiro-Wilk para el análisis de distribución normal.

Resultados

Este estudio tiene como objetivo realizar una evaluación dinámica de la función plaquetaria. Siguiendo el protocolo descrito anteriormente, se preparó la solución de c-PRP y las plaquetas se sembraron en el electrodo recubierto de Fn en T-MCC. Las plaquetas que flotaban libremente se lavaron en la etapa de lavado y se agregó un agonista para activar las plaquetas adheridas. Los resultados detallados y el análisis se pueden encontrar en nuestro informe anterior^28<...

Discusión

Este estudio fue pionero en un nuevo método basado en capacitancia para evaluar la función plaquetaria, que evalúa tanto la adhesión como la dinámica plaquetaria posterior a la activación dentro de un solo dispositivo, marcando el primer caso reportado de tal enfoque. El novedoso protocolo experimental introduce una técnica relativamente sencilla para contrarrestar los impactos de la formación de fibrina y los factores de coagulación del plasma a través de un procedimiento de l...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
1-Dodecanethiol	Sigma-Aldrich, MO, U.S.A	471364-100ML	1 mM
200-proof ethanol	Sigma-Aldrich, MO, U.S.A	EX0276-1
3D printer	Shenzhen Creality 3D Technology Co, Ltd.	Ender-3 V3
3D printing material	HATCHBOX 3D, CA, U.S.A	3D PLA-1KG-1.75
Adenosine 5′-diphosphate	Sigma Aldrich, U.S.A	01905-250MG-F	ADP
Aspirin	Sigma-Aldrich, MO, U.S.A	A2093-100G
Deep Reactive Ion Etching	Omega Engineering, Inc.	SPTS Rapier DRIE
Dimethyl Sulfoxide	Sigma-Aldrich, MO, U.S.A	D8418-50ML	DMSO
High Vacuum Deposition Systems	CHA	SEC-600
Human Fibronectin	Sigma-Aldrich, MO, U.S.A	CLS356008-1EA	Fn
KOH	Sigma-Aldrich, MO, U.S.A	P1767-250G
LCR meter	Keithley Instruments, Inc., OH, U.S.A	Keithley EL 4980AL
LCR meter holders	Signatone Corporation, CA, U.S.A	SCA-50-4
Mask Aligner System	ABM, U.S.A, Inc.	ABM/6/350/NUV/DCCD/SA
Micro-positioners	Signatone, CA, U.S.A	S-725
needle probe	Signatone Corporation, CA, U.S.A	SCAT5T-4	12.5 μm radius
Phosphate Buffered Saline	Sigma-Aldrich, MO, U.S.A	P4474-1L	PBS, pH 7.4
Reactive Ion Etching	Plasma-Therm,U.S.A	RIE Vision 320
silicon substrate	Wafer World Inc	SKU# 1766
Standard 3.2% citrate tubes	Tiger Medical, NJ, U.S.A.	Covidien / Cardinal Health 8881340478 Monoject
Thrombin	Enzyme Research Laboratories, U.S.A	HT 1002a
Ticagrelor	Sigma-Aldrich, MO, U.S.A	PHR2788-400MG
Tyrode’s buffer	Boston Bioproducts, U.S.A	BSS-375
UV photoresist	AZ electronic materials, NC, U.S.A.	AZ 9260	15um