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  • Résumé
  • Résumé
  • Introduction
  • Protocole
  • Résultats
  • Discussion
  • Déclarations de divulgation
  • Remerciements
  • matériels
  • Références
  • Réimpressions et Autorisations

Résumé

Un protocole pour un nouveau test fonctionnel dynamique multiparamètre des plaquettes à l’aide d’un biocapteur capacitif est présenté ici. Cette approche, conçue dans un microenvironnement semi-rigide pour améliorer la pertinence physiologique, fournit trois paramètres de sortie sensibles à la numération plaquettaire, aux forces de stimulation et aux voies d’activation.

Résumé

Les plaquettes jouent un rôle fondamental dans la coagulation du sang par le biais d’une série de réponses régulées, notamment l’adhésion, l’étalement, la sécrétion granulaire, l’agrégation et la contraction du cytosquelette. Cependant, les tests actuels se limitent à l’analyse partielle de la fonction plaquettaire dans des conditions non physiologiques. Par conséquent, il est nécessaire de disposer d’un test amélioré qui reflète la nature dynamique et multidimensionnelle de la fonction plaquettaire dans des contextes physiologiques. Dans ce contexte, une nouvelle approche est introduite pour mesurer plusieurs paramètres clés liés à la fonction plaquettaire dans un microenvironnement semi-rigide ex vivo plus pertinent sur le plan physiologique par rapport aux tests traditionnels. Cette méthode utilise un biocapteur électrique avancé, le capteur de capacité à membrane (MCS), qui fournit des informations uniques sur le processus de coagulation grâce à trois lectures distinctes. Ces lectures sont très sensibles aux variations de la numération plaquettaire, de l’intensité de la stimulation et des voies d’activation spécifiques. En tant que plate-forme de détection purement électrique, le MCS démontre un potentiel significatif en tant qu’outil de diagnostic pour détecter les troubles de la fonction hémostatique primaires, évaluer l’efficacité des traitements thérapeutiques et faire progresser la compréhension plus large des rôles des plaquettes dans l’hémostase et la thrombose.

Introduction

Les plaquettes, des cellules sanguines spécialisées, jouent un rôle essentiel dans l’orchestration de la réponse hémostatique pour arrêter les saignements après une blessure et pour faciliter la guérison des vaisseaux sanguins1. De plus, ils servent également de médiateurs cruciaux dans la thrombose, l’une des principales causes de décès liés aux maladies thromboemboliques dans le monde 2,3,4,5,6. Lorsqu’une lésion vasculaire se produit, les plaquettes subissent une série de processus fonctionnels complexes, régulés et en plusieurs étapes. Il s’agit notamment de l’adhésion à la matrice intimale, d’un afflux de calcium intracellulaire déclenchant des changements de conformation plaquettaire, de l’activation, de la sécrétion de granules, de l’agrégation et de la contraction cytosquelettique, formant et stabilisant finalement des bouchons hémostatiques pour sceller les sites endommagés et prévenir les saignements 7,8. Malgré des progrès significatifs dans les médicaments antiplaquettaires et les stratégies thérapeutiques 9,10,11, le risque de thrombose persiste. La prise en charge du traitement antiplaquettaire présente des défis, notamment le risque d’hémorragie iatrogène, la difficulté d’obtenir une efficacité antithrombotique tout en maintenant l’hémostase et la variabilité de la réponse du patient, y compris la résistance aux médicaments12,13.

Bien que les mécanismes moléculaires régissant les phases de réponse plaquettaire soient bien documentés, les méthodes actuelles pour tester la fonction plaquettaire restent sous-optimales. Les tests traditionnels en laboratoire sont souvent insuffisants car ils n’évaluent que des aspects limités de l’activité plaquettaire à un stade précoce ou intermédiaire, tels que l’adhésion, l’agrégation ou la viscosité du caillot 7,14,15,16,17,18. Cette analyse partielle peut conduire à des informations insuffisantes. De plus, ces tests n’offrent pas d’évaluation simultanée, continue et rapide de plusieurs éléments fonctionnels plaquettaires cruciaux au sein d’un seul test. Par conséquent, cette limitation entrave les progrès de l’hématologie clinique et expérimentale. Au fil du temps, une pléthore de capteurs impedimétriques ou capacitifs ont été développés pour diverses applications biomédicales 19,20,21,22,23,24,25,26,27,28.

Ici, nous présentons le protocole pour une évaluation de la fonction plaquettaire multiplexée à l’aide d’un biocapteur capacitif. L’approche proposée offre une caractéristique attrayante en surveillant de manière sensible les changements dynamiques dans un large spectre de fonctions plaquettaires au niveau cellulaire. L’approche présentée utilise un biocapteur composé de deux micropuces : une puce supérieure en silicone, qui est jetable, avec un puits d’échantillon pour le plasma riche en plaquettes citrated et une électrode de détection recouverte de fibronectine humaine pour faciliter l’adhésion des plaquettes, ainsi qu’une puce inférieure en silicium réutilisable abritant une électrode de référence. La mesure continue des changements de capacité dynamique tout au long du processus de coagulation, englobant l’adhésion, l’activation et la post-activation des plaquettes, permet une analyse sensible liée aux variations de la numération plaquettaire, aux niveaux d’activation des plaquettes et à l’inhibition des voies d’activation. La faisabilité clinique et l’utilité de cette méthode ont été démontrées à l’aide d’échantillons de plasma humain pertinents, soulignant son potentiel pour une évaluation robuste de la fonction plaquettaire en milieu clinique.

Protocole

La proposition d’étude a été approuvée par la Division des sujets humains (HSD) du Conseil d’examen interne de l’Université de Washington (UW-IRB ; Numéro de l’étude : STUDY00005211). Tous les sujets volontaires qui ont participé à l’étude ont fourni un consentement éclairé écrit. Les détails des réactifs et de l’équipement utilisés dans cette étude sont énumérés dans la table des matériaux.

1. Étapes de fabrication du capteur capacitif à membrane (MCS)

REMARQUE : Le capteur MCS a été fabriqué à l’aide de techniques de microfabrication traditionnelles. Ce biocapteur était composé d’une puce capacitive à membrane (MCC) supérieure (T) et inférieure (B). En bref, les étapes de fabrication sont illustrées à la figure 1.

  1. Étapes de microfabrication pour le T-MCC (Figure 1A)
    1. Concevez la disposition du T-MCC à l’aide d’un logiciel de CAO standard pour un substrat de plaquette de silicium de 4 pouces.
    2. Transférez le motif sur un photomasque en verre chromé en utilisant le procédé de fabrication de masque standard29,30.
    3. Sur un substrat de silicium poli double face propre (400 μm d’épaisseur), déposer 500 nm d’épaisseur de Si3N4 en utilisant la technique standard de dépôt chimique en phase vapeur à basse pression (LPCVD)31. Couche de centrifugation de 12 μm de résine photosensible AZ 9260 à 2000 tr/min pendant 25 s à l’aide d’une machine d’essorage manuelle.
    4. À l’aide de la technique standard de photolithographie UV32, modélisez la résine photosensible, ce qui implique d’exposer la résine photosensible avec le photomasque en verre chromé dans un aligneur UV, et de développer la résine dans une solution de révélateur pour éliminer la région exposée aux UV de la réserve.
    5. Modélisez la couche de nitrure de silicium sous-jacente de 500 nm d’épaisseur à l’aide d’un processus de gravure ionique réactive, qui expose le substrat de silicium.
    6. Retirez le substrat de silicium exposé de 400 m d’épaisseur à l’aide d’un procédé Bosch standard : Deep Reactive Ion Si Etchprocess 33.
    7. Calculez le nombre de cycles de gravure souhaité pour enlever 400 μm de silicium.
      REMARQUE : Cela variera en fonction de l’outil utilisé pour le processus, car ils influenceront le taux de gravure (dans ce cas, il était de 1,8 μm/cycle).
    8. Pour éviter de graver accidentellement la couche de Si3N4 , arrêtez la gravure à sec au moins 10 μm avant (c’est-à-dire à 390 μm). Retirez le silicium restant à l’aide du KOH traditionnel hautement sélectif à 80 °C pendant 5 min.
    9. Déposez consécutivement 20 nm de couches métalliques de Cr et 150 nm d’Au à l’aide d’un procédé d’évaporation par faisceau d’E34 et d’un masque d’ombre pour fabriquer l’électrode de détection dans le T-MCC.
    10. À ce stade, les T-MCC de la plaquette seront reliés par de minuscules supports en silicium. Séparez les T-MCC en perforant soigneusement les minuscules supports.
  2. Étapes de microfabrication pour le B-MCC (Figure 1B)
    1. Sur un substrat de silicium oxydé thermiquement propre (400 μm d’épaisseur), déposez des couches métalliques Cr/Au (20 nm, 150 nm) à l’aide d’un masque d’ombre, comme à l’étape 1.1.9.
    2. Utilisez la photolithographie standard32 avec alignement de l’arrière, suivie d’une étape de gravure humide KOH pour libérer les B-MCC.
      REMARQUE : Le T- et le B-MCC ont des patins de contact de 2,5 x 1,5 cm.

2. Biofonctionnalisation du capteur capacitif

REMARQUE : Brièvement, cette étape consiste à recouvrir l’électrode T-MCC de fibronectine humaine (Fn) pour faciliter la fixation des plaquettes sur le capteur.

  1. Avant les revêtements biomoléculaires, nettoyez l’électrode de détection avec du plasma d’oxygène pendant 45 s à 100 W.
  2. Ajoutez du 1-dodécanéthiol (1 mM) dans de l’éthanol à 200 degrés dans le puits d’échantillon sur les T-MCC.
  3. Placez les T-MCC dans un récipient rempli d’azote sec, scellé et enveloppé de parafilm pendant 24 à 48 h.
  4. Rincez la surface dorée avec de l’eau déminéralisée et de l’éthanol à 200 degrés, puis séchez-le à l’azote à température ambiante. À ce stade, stockez les capteurs à une température de 2 à 8 °C dans une atmosphère d’azote sec jusqu’aux étapes suivantes.
  5. Ajouter une solution de Fn dans une solution saline tamponnée au phosphate (PBS, 50 μg/mL) dans le puits 12 h avant la mesure et incuber à 37 °C pendant 2 à 8 h.

3. Configuration du capteur capacitif

REMARQUE : La figure 2 représente la photographie de l’installation expérimentale.

  1. Utilisez un compteur LCR avec des micropositionneurs et des sondes à aiguille pour établir un contact électrique avec le capteur.
  2. Utilisez des fixations en plastique imprimées en 3D (voir le tableau des matériaux) pour placer en toute sécurité le T- et le B-MCC. Le luminaire inférieur est équipé de butées sur l’axe x-y pour assurer un alignement précis du T-MCC sur le B-MCC pour former un condensateur.
    REMARQUE : Toutes les imprimantes 3D utilisées provenaient de l’Université de Washington.
  3. Appliquez un signal sinusoïdal (0,5 V) à 100 kHz et une fréquence d’échantillonnage de 8 Hz.

4. Préparation de plasma riche en plaquettes citrated (c-PRP)

REMARQUE : Tous les échantillons de sang provenaient de volontaires qui ont participé à cette recherche. Aucun des participants n’avait d’anomalie plaquettaire ou de trouble de la coagulation connu auparavant, et ils n’avaient pris aucun médicament plaquettaire, y compris des anti-inflammatoires non stéroïdiens (AINS), au cours des deux semaines précédant le prélèvement de l’échantillon. Un phlébotomiste agréé a effectué une prise de sang à l’aide d’une aiguille de 21 G sur des tubes de citrate standard à 3,2 %. La première dose de 1 mL a été jetée pour éviter la contamination par les facteurs tissulaires. Les échantillons ont été transportés dans un contenant en polystyrène, et toutes les mesures ont été effectuées dans les 6 heures suivant la prise de sang.

  1. Centrifuger l’échantillon de sang entier à 200 x g pendant 10 min à 20 °C pour obtenir le c-PRP.
  2. Transférez le c-PRP dans un récipient stérile et effectuez la numération plaquettaire. Pour les études sur les inhibiteurs, incubez le c-PRP avec une concentration prédéfinie du médicament dans le tampon de Tyrode (voir la section Résultats pour plus de détails).

5. Dosage fonctionnel des plaquettes

REMARQUE : Le schéma du dosage fonctionnel plaquettaire présenté est illustré à la figure 3.

  1. Assemblez le T et le B-MCC dans les fixations imprimées en 3D.
  2. Mesurez la mesure de capacité de base pendant 5 min, puis ajoutez 45 μL de c-PRP dans le puits de l’échantillon dans le T-MCC.
  3. Attendez 30 minutes pour que les plaquettes adhèrent à l’électrode enrobée de Fn dans le T-MCC.
  4. Prélever soigneusement 30 μL de c-PRP sans toucher les plaquettes attachées à la membrane, et remplir immédiatement avec le tampon de Tyrode. Répétez le lavage au moins 5 fois avec un intervalle de 20 s pour vous assurer qu’aucune plaquette ou macroagrégat supplémentaire ne se pose sur l’électrode de détection après l’activation.
  5. Ajouter 10 μL de la solution agoniste (thrombine ou ADP) à la concentration souhaitée. Prévoyez un temps d’équilibrage de 80 minutes.

6. Analyse des données et statistiques pour les marqueurs de signal

REMARQUE : La capacité est mesurée en continu à partir des étapes 5.2-5.5.

  1. Pour le signal de capacité pendant la phase d’adhésion (étape 5.3), mesurez la variation maximale de la capacité après le temps d’équilibre de 30 minutes, appelé ΔCadh.
  2. De même, pour la phase d’activation (étape 5.5), mesurez la variation maximale de la capacité, appelée acte Δ C, et la pente de la courbe entre 200 et 300 s après l’activation, appelée acte S.
  3. Utilisez l’analyse de variance (ANOVA) avec l’analyse post-hoc de Tukey pour comparer les résultats entre les groupes. Utilisez la qualité de l’ajustement de Shapiro-Wilk pour l’analyse de la distribution normale.

Résultats

Cette étude vise à effectuer une évaluation dynamique de la fonction plaquettaire. En suivant le protocole décrit ci-dessus, la solution de c-PRP a été préparée et les plaquettes ont été ensemencées sur l’électrode enrobée de Fn dans le T-MCC. Les plaquettes flottantes ont été lavées par l’étape de lavage, et un agoniste a été ajouté pour activer les plaquettes attachées. Les résultats détaillés et l’analyse se trouvent dans notre précédent rapport

Discussion

Cette étude a été à l’origine d’une nouvelle méthode basée sur la capacité pour évaluer la fonction plaquettaire, qui évalue à la fois l’adhésion et la dynamique plaquettaire post-activation au sein d’un seul dispositif, marquant le premier exemple signalé d’une telle approche. Le nouveau protocole expérimental introduit une technique relativement simple pour contrer les impacts de la formation de fibrine et des facteurs de coagulation plasmatique par une procédur...

Déclarations de divulgation

Les auteurs ne déclarent aucun intérêt concurrent.

Remerciements

Les auteurs expriment leur gratitude au Dr Moritz Stolla et au Dr Jason Acker pour leurs précieuses discussions et leur assistance technique. Ils remercient également le Centre d’imagerie biologique de l’Université de Washington pour son infrastructure et son soutien. Ce travail a reçu un financement partiel du CoMotion Innovation Fund de l’Université de Washington (subvention n° 682548, D.Y.G.).

matériels

NameCompanyCatalog NumberComments
1-DodecanethiolSigma-Aldrich, MO, U.S.A471364-100ML1 mM
200-proof ethanolSigma-Aldrich, MO, U.S.AEX0276-1
3D printerShenzhen Creality 3D Technology Co, Ltd.Ender-3 V3
3D printing materialHATCHBOX 3D, CA, U.S.A3D PLA-1KG-1.75
Adenosine 5′-diphosphateSigma Aldrich, U.S.A01905-250MG-FADP
Aspirin Sigma-Aldrich, MO, U.S.AA2093-100G
Deep Reactive Ion EtchingOmega Engineering, Inc.SPTS Rapier DRIE
Dimethyl SulfoxideSigma-Aldrich, MO, U.S.AD8418-50MLDMSO
High Vacuum Deposition SystemsCHA SEC-600
Human FibronectinSigma-Aldrich, MO, U.S.ACLS356008-1EAFn
KOHSigma-Aldrich, MO, U.S.AP1767-250G
LCR meter Keithley Instruments, Inc., OH, U.S.AKeithley EL 4980AL
LCR meter holdersSignatone Corporation, CA, U.S.ASCA-50-4
Mask Aligner SystemABM, U.S.A, Inc.ABM/6/350/NUV/DCCD/SA
Micro-positionersSignatone, CA, U.S.AS-725
needle probeSignatone Corporation, CA, U.S.ASCAT5T-412.5 μm radius
Phosphate Buffered SalineSigma-Aldrich, MO, U.S.AP4474-1LPBS, pH 7.4
Reactive Ion EtchingPlasma-Therm,U.S.ARIE Vision 320
silicon substrateWafer World IncSKU# 1766
Standard 3.2% citrate tubesTiger Medical, NJ, U.S.A.Covidien / Cardinal Health 8881340478 Monoject
ThrombinEnzyme Research Laboratories, U.S.AHT 1002a
TicagrelorSigma-Aldrich, MO, U.S.APHR2788-400MG
Tyrode’s bufferBoston Bioproducts, U.S.ABSS-375
UV photoresistAZ electronic materials, NC, U.S.A.AZ 926015um

Références

  1. George, J. N. Platelets. Lancet. 355 (9214), 1531-1539 (2000).
  2. Wendelboe, A. M., Raskob, G. E. Global burden of thrombosis: Epidemiologic aspects. Circ Res. 118 (9), 1340-1347 (2016).
  3. Heit, J. A. Epidemiology of venous thromboembolism. Nat Rev Cardiol. 12 (8), 464-474 (2015).
  4. Moran, A. E., et al. The global burden of ischemic heart disease in 1990 and 2010: The global burden of disease 2010 study. Circulation. 129 (14), 1493-1501 (2014).
  5. Campbell, B. C. V., et al. Ischaemic stroke. Nat Rev Dis Primers. 5 (1), 70 (2019).
  6. Ruggeri, Z. M. Platelets in atherothrombosis. Nat Med. 8 (11), 1227-1234 (2002).
  7. Harrison, P. Platelet function analysis. Blood Rev. 19 (2), 111-123 (2005).
  8. Van Der Meijden, P. E. J., Heemskerk, J. W. M. Platelet biology and functions: New concepts and clinical perspectives. Nat Rev Cardiol. 16 (3), 166-179 (2019).
  9. Bhatt, D. L., Topol, E. J. Scientific and therapeutic advances in antiplatelet therapy. Nat Rev Drug Discov. 2 (1), 15-28 (2003).
  10. Mcfadyen, J. D., Schaff, M., Peter, K. Current and future antiplatelet therapies: Emphasis on preserving hemostasis. Nat Rev Cardiol. 15 (3), 181-191 (2018).
  11. Michelson, A. D. Advances in antiplatelet therapy. Hematology Am Soc Hematol Educ Program. 2011, 62-69 (2011).
  12. Sweeny, J. M., Gorog, D. A., Fuster, V. Antiplatelet drug 'resistance'. Part 1: Mechanisms and clinical measurements. Nat Rev Cardiol. 6 (4), 273-282 (2009).
  13. Mega, J. L., Simon, T. Pharmacology of antithrombotic drugs: An assessment of oral antiplatelet and anticoagulant treatments. Lancet. 386 (9990), 281-291 (2015).
  14. Carr, M. E. Development of platelet contractile force as a research and clinical measure of platelet function. Cell Biochem Biophys. 38 (1), 55-78 (2003).
  15. Gresele, P., Bury, L., Mezzasoma, A. M., Falcinelli, E. Platelet function assays in diagnosis: An update. Expert Rev Hematol. 12 (1), 29-46 (2019).
  16. Pakala, R., Waksman, R. Currently available methods for platelet function analysis: Advantages and disadvantages. Cardiovasc Revasc Med. 12 (5), 312-322 (2011).
  17. Paniccia, R., Priora, R., Liotta, A. A., Abbate, R. Platelet function tests: A comparative review. Vasc Health Risk Manag. 11, 133-148 (2015).
  18. Rand, M. L., Leung, R., Packham, M. A. Platelet function assays. Transfus Apher Sci. 28 (3), 307-317 (2003).
  19. Alafeef, M., Dighe, K., Moitra, P., Pan, D. Rapid, ultrasensitive, and quantitative detection of sars-cov-2 using antisense oligonucleotides directed electrochemical biosensor chip. ACS Nano. 14 (12), 17028-17045 (2020).
  20. Chowdhury, A. D., Takemura, K., Li, T. C., Suzuki, T., Park, E. Y. Electrical pulse-induced electrochemical biosensor for hepatitis e virus detection. Nat Commun. 10 (1), 3737 (2019).
  21. Park, J. H., et al. Capacitive biosensor based on vertically paired electrodes for the detection of sars-cov-2. Biosens Bioelectron. 202, 113975 (2022).
  22. Qureshi, A., Pandey, A., Chouhan, R. S., Gurbuz, Y., Niazi, J. H. Whole-cell based label-free capacitive biosensor for rapid nanosize-dependent toxicity detection. Biosens Bioelectron. 67, 100-106 (2015).
  23. Rassaei, L., Mathwig, K., Kang, S., Heering, H. A., Lemay, S. G. Integrated biodetection in a nanofluidic device. ACS Nano. 8 (8), 8278-8284 (2014).
  24. Wang, L., et al. A sensitive DNA capacitive biosensor using interdigitated electrodes. Biosens Bioelectron. 87, 646-653 (2017).
  25. Zhurauski, P., et al. Sensitive and selective affimer-functionalized interdigitated electrode-based capacitive biosensor for her4 protein tumor biomarker detection. Biosens Bioelectron. 108, 1-8 (2018).
  26. Pourang, S., et al. Assessment of fibrinolytic status in whole blood using a dielectric coagulometry microsensor. Biosens Bioelectron. 210, 114299 (2022).
  27. Sekar, P. K., et al. Simultaneous multiparameter whole blood hemostasis assessment using a carbon nanotube-paper composite capacitance sensor. Biosens Bioelectron. 197, 113786 (2022).
  28. P, K. S., et al. Comprehensive multiparameter evaluation of platelet function using a highly sensitive membrane capacitance sensor. Biosens Bioelectron. 228, 115192 (2023).
  29. Franssila, S. . Introduction to microfabrication. , (2010).
  30. Syed Rizvi, S. R. . Handbook of photomask manufacturing technology. , (2018).
  31. Yota, J., Hander, J., Saleh, A. A. A comparative study on inductively-coupled plasma high-density plasma, plasma-enhanced, and low pressure chemical vapor deposition silicon nitride films. J Vacuum Sci Technol A. 18 (2), 372-376 (2000).
  32. Thompson, L. F. An introduction to lithography. ACS Symp Series. 219, 1-13 (1983).
  33. Laermer, F., Urban, A. Challenges, developments and applications of silicon deep reactive ion etching. Microelectron Eng. 67 - 8, 349-355 (2003).
  34. Harsha, K. S. . Principles of vapor deposition of thin films. , (2005).
  35. Lea-Henry, T. N., Carland, J. E., Stocker, S. L., Sevastos, J., Roberts, D. M. Clinical pharmacokinetics in kidney disease: Fundamental principles. Clin J Am Soc Nephrol. 13 (7), 1085-1095 (2018).
  36. Offermanns, S. Activation of platelet function through g protein-coupled receptors. Circ Res. 99 (12), 1293-1304 (2006).
  37. Trejo-Velasco, B., et al. Impact of comorbidities and antiplatelet regimen on platelet reactivity levels in patients undergoing transcatheter aortic valve implantation. J Cardiovasc Pharmacol. 78 (3), 463-473 (2021).
  38. Violi, F., Pignatelli, P., Basili, S. Nutrition, supplements, and vitamins in platelet function and bleeding. Circulation. 121 (8), 1033-1044 (2010).

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