JoVE Logo
АВТОРЫ
СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

Войдите в систему

Для просмотра этого контента требуется подписка на Jove Войдите в систему или начните бесплатную пробную версию.

В этой статье

  • Резюме
  • Аннотация
  • Введение
  • протокол
  • Результаты
  • Обсуждение
  • Раскрытие информации
  • Благодарности
  • Материалы
  • Ссылки
  • Перепечатки и разрешения

Резюме

Здесь представлен протокол нового динамического многопараметрического функционального анализа тромбоцитов с использованием емкостного биосенсора. Этот подход, разработанный в полужесткой микросреде для повышения физиологической значимости, обеспечивает три выходных параметра, чувствительных к количеству тромбоцитов, силе стимуляции и путям активации.

Аннотация

Тромбоциты играют фундаментальную роль в свертывании крови посредством ряда регулируемых реакций, включая адгезию, распространение, гранулярную секрецию, агрегацию и цитоскелетное сокращение. Однако современные анализы ограничены частичным анализом функции тромбоцитов в нефизиологических условиях. Таким образом, необходим улучшенный анализ, отражающий динамичный и многогранный характер функции тромбоцитов в физиологических условиях. В этом контексте представлен новый подход к измерению нескольких ключевых параметров, связанных с функцией тромбоцитов, в более физиологически значимой полужесткой микросреде ex vivo по сравнению с традиционными анализами. В этом методе используется усовершенствованный электрический биосенсор, мембранный датчик емкости (MCS), который дает уникальную информацию о процессе свертывания крови с помощью трех различных показаний. Эти показания очень чувствительны к изменениям количества тромбоцитов, интенсивности стимуляции и специфических путей активации. Будучи чисто электрической сенсорной платформой, MCS демонстрирует значительный потенциал в качестве диагностического инструмента для выявления первичных нарушений гемостатической функции, оценки эффективности терапевтического лечения и содействия более широкому пониманию роли тромбоцитов в гемостазе и тромбозе.

Введение

Тромбоциты, специализированные клетки крови, играют ключевую роль в организации гемостатической реакции для остановки кровотечения после травмы и в содействии заживлению кровеносных сосудов1. Кроме того, они также служат важнейшими медиаторами в тромбозе, который является основной причиной смертности, связанной с тромбоэмболической болезнью, во всем мире 2,3,4,5,6. При повреждении сосудов тромбоциты претерпевают ряд сложных, регулируемых и многоступенчатых функциональных процессов. К ним относятся адгезия к интимальному матриксу, приток внутриклеточного кальция, вызывающий конформационные изменения тромбоцитов, активация, секреция гранул, агрегация и цитоскелетное сокращение, в конечном итоге формируя и стабилизируя гемостатические пробки для герметизации поврежденных участков и предотвращения кровотечения 7,8. Несмотря на значительные достижения в области антитромбоцитарных препаратов и терапевтических стратегий 9,10,11, риск тромбоза сохраняется. Управление антитромбоцитарной терапией сопряжено с трудностями, включая риск ятрогенного кровотечения, трудности в достижении антитромботической эффективности при сохранении гемостаза и вариабельность реакции пациента, включая лекарственную устойчивость12,13.

Несмотря на то, что молекулярные механизмы, управляющие фазами реакции тромбоцитов, хорошо задокументированы, современные методы тестирования функции тромбоцитов остаются неоптимальными. Традиционные лабораторные тесты часто не справляются, поскольку они оценивают только ограниченные аспекты активности тромбоцитов на ранних и средних стадиях, такие как адгезия, агрегация или вязкость сгустков 7,14,15,16,17,18. Такой частичный анализ может привести к недостаточной информации. Кроме того, эти тесты не обеспечивают одновременной, непрерывной и быстрой оценки нескольких важнейших функциональных элементов тромбоцитов в рамках одного анализа. Следовательно, это ограничение препятствует прогрессу как в клинической, так и в экспериментальной гематологии. Со временем было разработано множество импедиметрических или емкостных датчиков для различных биомедицинских приложений 19,20,21,22,23,24,25,26,27,28.

В данной работе мы представляем протокол оценки мультиплексной функции тромбоцитов с помощью емкостного биосенсора. Предлагаемый подход обладает привлекательной особенностью за счет чувствительного мониторинга динамических изменений в широком спектре функций тромбоцитов на клеточном уровне. В представленном подходе используется биосенсор, состоящий из двух микрочипов: одноразового верхнего силиконового чипа с образцом для плазмы, обогащенной цитатрованными тромбоцитами, и чувствительного электрода, покрытого человеческим фибронектином для облегчения адгезии тромбоцитов, а также многоразового нижнего кремниевого чипа с электродом сравнения. Непрерывное измерение динамических изменений емкости в течение всего процесса коагуляции, охватывающее адгезию тромбоцитов, активацию и постактивацию, позволяет проводить чувствительный анализ, связанный с изменениями количества тромбоцитов, уровнями активации тромбоцитов и ингибированием путей активации. Клиническая осуществимость и полезность этого метода были продемонстрированы на соответствующих образцах плазмы крови человека, что подчеркивает его потенциал для надежной оценки функции тромбоцитов в клинических условиях.

протокол

Предложение об исследовании было одобрено Отделом по изучению человека (HSD) Совета по внутреннему обзору Вашингтонского университета (UW-IRB; ID исследования: STUDY00005211). Все добровольцы, участвовавшие в исследовании, предоставили письменное информированное согласие. Подробная информация о реагентах и оборудовании, использованных в этом исследовании, приведена в Таблице материалов.

1. Этапы изготовления мембранного емкостного датчика (MCS)

ПРИМЕЧАНИЕ: Датчик MCS был изготовлен с использованием традиционных методов микропроизводства. Этот биосенсор состоял из верхней (T-) и нижней (B-) мембранной емкостной микросхемы (MCC). Вкратце этапы изготовления показаны на рисунке 1.

  1. Этапы микропроизводства для T-MCC (Рисунок 1A)
    1. Разработайте компоновку T-MCC с помощью стандартного программного обеспечения САПР для 4-дюймовой кремниевой подложки пластины.
    2. Перенос рисунка на фотошаблон из хромированного стекла с использованием стандартного процесса изготовления маски29,30.
    3. На чистую двустороннюю полированную кремниевую подложку (толщиной 400 мкм) нанести Si3N4 толщиной 500 нм, используя стандартный метод химического осаждения из газовой фазы низкого давления (LPCVD)31. Нанесение слоя фоторезиста AZ 9260 на 12 мкм при 2000 об/мин в течение 25 с с помощью ручного отжимного оборудования.
    4. Используя стандартный метод32 УФ-фотолитографии, смоделировать фоторезист, который включает в себя экспонирование фоторезиста с помощью фотомаски из хромированного стекла в УФ-выравнивателе и разработку резиста в растворе проявителя для удаления области резиста, подверженной воздействию УФ-излучения.
    5. Смоделируйте нижний слой нитрида кремния толщиной 500 нм с помощью процесса реактивного ионного травления, в результате которого кремниевая подложка обнажается.
    6. Удалите обнаженную кремниевую подложку толщиной 400 мкм с помощью стандартного процесса Bosch: Deep Reactive Ion Si Etch process33.
    7. Рассчитайте желаемое количество циклов травления для удаления 400 мкм кремния.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Это будет варьироваться в зависимости от инструмента, который используется для процесса, так как они будут влиять на скорость травления (в данном случае она составила 1,8 мкм/цикл).
    8. Чтобы предотвратить случайное травление слоя Si3N4 , прекратите сухое травление не менее чем за 10 мкм до этого (т.е. при 390 мкм). Удалите остатки кремния с помощью традиционного высокоселективного KOH при 80 °C в течение 5 минут.
    9. Последовательно наносите 20 нм слоев Cr и 150 нм Au металлического слоя с использованием процесса E-лучевого испарения34 и теневой маски для изготовления чувствительного электрода в Т-MCC.
    10. На этом этапе Т-MCC в пластине будут соединены крошечными кремниевыми держателями. Отделите Т-ЦУПы, осторожно проколов крошечные держатели.
  2. Этапы микропроизводства для B-MCC (Рисунок 1B)
    1. На чистую термически окисленную кремниевую подложку (толщиной 400 мкм) нанести металлические слои Cr/Au (20 нм, 150 нм) с помощью теневой маски, аналогично шагу 1.1.9.
    2. Используйте стандартную фотолитографию32 с выравниванием по тыльной стороне, после чего следует этап мокрого травления KOH для высвобождения B-MCC.
      ПРИМЕЧАНИЕ: T- и B-MCC имеют контактные площадки размером 2,5 x 1,5 см.

2. Биофункционализация емкостного датчика

ПРИМЕЧАНИЕ: Вкратце, этот шаг заключается в покрытии электрода T-MCC человеческим фибронектином (Fn) для облегчения прикрепления тромбоцитов к датчику.

  1. Перед нанесением биомолекулярных покрытий очистите чувствительный электрод кислородной плазмой в течение 45 с при мощности 100 Вт.
  2. Добавьте 1-додекантиол (1 мМ) в 200-градусный этанол в лунку для образца на Т-ЦУК.
  3. Поместите Т-ЦУП в емкость, наполненную сухим азотом, герметичную и обернутую парапленкой на 24-48 часов.
  4. Промойте поверхность золота деионизированной водой и этанолом 200-й крепости с последующей сушкой азотом при комнатной температуре. На этом этапе храните датчики при температуре 2-8 °C в сухой атмосфере азота до следующих этапов.
  5. Добавьте раствор Fn в фосфатно-солевой буфер (PBS, 50 мкг/мл) в лунку за 12 ч до измерения и инкубируйте при 37 °С в течение 2-8 ч.

3. Настройка емкостного датчика

ПРИМЕЧАНИЕ: На рисунке 2 представлена фотография экспериментальной установки.

  1. Используйте измеритель LCR с микропозиционерами и игольчатыми щупами для установления электрического контакта с датчиком.
  2. Используйте напечатанные на 3D-принтере пластиковые приспособления (см. Таблицу материалов) для надежного размещения Т- и В-MCC. Нижнее приспособление оснащено стопорами по оси x-y для обеспечения точного выравнивания T-MCC над B-MCC с образованием конденсатора.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Все использованные 3D-принтеры были изготовлены в Вашингтонском университете.
  3. Подайте синусоидальный сигнал (0,5 В) на частоте 100 кГц и частоте дискретизации 8 Гц.

4. Получение цитратной обогащенной тромбоцитами плазмы (c-PRP)

ПРИМЕЧАНИЕ: Все образцы крови были взяты у добровольцев, участвовавших в этом исследовании. Ни у одного из участников не было ранее известной аномалии тромбоцитов или нарушения свертываемости крови, и они не принимали никаких тромбоцитарных препаратов, включая нестероидные противовоспалительные препараты (НПВП), в течение двух недель, предшествовавших сбору образцов. Лицензированный флеботомист провел забор крови с помощью иглы 21 G для стандартных 3,2% цитратных пробирок. Первый 1 мл был отброшен, чтобы избежать контаминации тканевого фактора. Образцы перевозили в контейнере из полистирола, а все измерения проводили в течение 6 ч после забора крови.

  1. Центрифугируйте образец цельной крови при концентрации 200 x g в течение 10 минут при 20 °C для получения c-PRP.
  2. Переложите c-PRP в стерильный контейнер и проведите подсчет тромбоцитов. Для исследований ингибиторов инкубируйте c-PRP с заданной концентрацией препарата в буфере Tyrode (подробнее см. раздел «Результаты»).

5. Функциональный анализ тромбоцитов

ПРИМЕЧАНИЕ: Схема представленного функционального анализа тромбоцитов показана на рисунке 3.

  1. Соберите T- и B-MCC в приспособлениях, напечатанных на 3D-принтере.
  2. Измеряйте базовую емкость в течение 5 минут, затем добавьте 45 мкл c-PRP в лунку для образца в T-MCC.
  3. Подождите 30 минут, пока тромбоциты прилипнут к электроду с Fn-покрытием в T-MCC.
  4. Осторожно удалите 30 мкл c-PRP, не касаясь тромбоцитов, прикрепленных к мембране, и немедленно пополните с помощью буфера Tyrode. Повторите промывку не менее 5 раз с интервалом в 20 с, чтобы убедиться, что после активации на чувствительный электрод не попадут дополнительные тромбоциты или макроагрегаты.
  5. Добавьте 10 мкл раствора агониста (тромбина или АДФ) в желаемой концентрации. Подождите 80 минут на уравновешивание.

6. Данные и статистический анализ для маркеров сигнала

ПРИМЕЧАНИЕ: Емкость измеряется непрерывно, начиная с шагов 5.2-5.5.

  1. Для емкостного сигнала во время фазы адгезии (шаг 5.3) измерьте максимальное изменение емкости после 30-минутного времени уравновешивания, которое называется ΔCadh.
  2. Аналогично, для фазы активации (шаг 5.5) измерьте максимальное изменение емкости, которое называется действием Δ C, и наклон кривой между 200-300 с после активации, который называется действием S.
  3. Используйте дисперсионный анализ (ANOVA) с помощью апостериорного анализа Тьюки для сравнения результатов между группами. Используйте метод Шапиро-Уилка Goodness of Fit для анализа нормального распределения.

Результаты

Данное исследование направлено на проведение динамической оценки функции тромбоцитов. В соответствии с описанным выше протоколом готовили раствор c-PRP и затравливали тромбоциты на электрод с Fn-покрытием в T-MCC. Свободно плавающие тромбоциты вымывали на этапе промывки...

Обсуждение

В этом исследовании впервые был использован новый емкостный метод оценки функции тромбоцитов, который оценивает как адгезию, так и динамику тромбоцитов после активации в одном устройстве, что является первым зарегистрированным случаем такого подхода. Новый экспери?...

Раскрытие информации

Авторы заявляют об отсутствии конкурирующих интересов.

Благодарности

Авторы выражают свою благодарность доктору Морицу Столле и доктору Джейсону Акеру за их ценные обсуждения и техническую помощь. Они также выражают признательность Центру биологической визуализации при Университете Вашингтона за его инфраструктуру и поддержку. Эта работа получила частичное финансирование от инновационного фонда CoMotion при Университете Вашингтона (грант No 682548, D.Y.G.).

Материалы

NameCompanyCatalog NumberComments
1-DodecanethiolSigma-Aldrich, MO, U.S.A471364-100ML1 mM
200-proof ethanolSigma-Aldrich, MO, U.S.AEX0276-1
3D printerShenzhen Creality 3D Technology Co, Ltd.Ender-3 V3
3D printing materialHATCHBOX 3D, CA, U.S.A3D PLA-1KG-1.75
Adenosine 5′-diphosphateSigma Aldrich, U.S.A01905-250MG-FADP
Aspirin Sigma-Aldrich, MO, U.S.AA2093-100G
Deep Reactive Ion EtchingOmega Engineering, Inc.SPTS Rapier DRIE
Dimethyl SulfoxideSigma-Aldrich, MO, U.S.AD8418-50MLDMSO
High Vacuum Deposition SystemsCHA SEC-600
Human FibronectinSigma-Aldrich, MO, U.S.ACLS356008-1EAFn
KOHSigma-Aldrich, MO, U.S.AP1767-250G
LCR meter Keithley Instruments, Inc., OH, U.S.AKeithley EL 4980AL
LCR meter holdersSignatone Corporation, CA, U.S.ASCA-50-4
Mask Aligner SystemABM, U.S.A, Inc.ABM/6/350/NUV/DCCD/SA
Micro-positionersSignatone, CA, U.S.AS-725
needle probeSignatone Corporation, CA, U.S.ASCAT5T-412.5 μm radius
Phosphate Buffered SalineSigma-Aldrich, MO, U.S.AP4474-1LPBS, pH 7.4
Reactive Ion EtchingPlasma-Therm,U.S.ARIE Vision 320
silicon substrateWafer World IncSKU# 1766
Standard 3.2% citrate tubesTiger Medical, NJ, U.S.A.Covidien / Cardinal Health 8881340478 Monoject
ThrombinEnzyme Research Laboratories, U.S.AHT 1002a
TicagrelorSigma-Aldrich, MO, U.S.APHR2788-400MG
Tyrode’s bufferBoston Bioproducts, U.S.ABSS-375
UV photoresistAZ electronic materials, NC, U.S.A.AZ 926015um

Ссылки

  1. George, J. N. Platelets. Lancet. 355 (9214), 1531-1539 (2000).
  2. Wendelboe, A. M., Raskob, G. E. Global burden of thrombosis: Epidemiologic aspects. Circ Res. 118 (9), 1340-1347 (2016).
  3. Heit, J. A. Epidemiology of venous thromboembolism. Nat Rev Cardiol. 12 (8), 464-474 (2015).
  4. Moran, A. E., et al. The global burden of ischemic heart disease in 1990 and 2010: The global burden of disease 2010 study. Circulation. 129 (14), 1493-1501 (2014).
  5. Campbell, B. C. V., et al. Ischaemic stroke. Nat Rev Dis Primers. 5 (1), 70 (2019).
  6. Ruggeri, Z. M. Platelets in atherothrombosis. Nat Med. 8 (11), 1227-1234 (2002).
  7. Harrison, P. Platelet function analysis. Blood Rev. 19 (2), 111-123 (2005).
  8. Van Der Meijden, P. E. J., Heemskerk, J. W. M. Platelet biology and functions: New concepts and clinical perspectives. Nat Rev Cardiol. 16 (3), 166-179 (2019).
  9. Bhatt, D. L., Topol, E. J. Scientific and therapeutic advances in antiplatelet therapy. Nat Rev Drug Discov. 2 (1), 15-28 (2003).
  10. Mcfadyen, J. D., Schaff, M., Peter, K. Current and future antiplatelet therapies: Emphasis on preserving hemostasis. Nat Rev Cardiol. 15 (3), 181-191 (2018).
  11. Michelson, A. D. Advances in antiplatelet therapy. Hematology Am Soc Hematol Educ Program. 2011, 62-69 (2011).
  12. Sweeny, J. M., Gorog, D. A., Fuster, V. Antiplatelet drug 'resistance'. Part 1: Mechanisms and clinical measurements. Nat Rev Cardiol. 6 (4), 273-282 (2009).
  13. Mega, J. L., Simon, T. Pharmacology of antithrombotic drugs: An assessment of oral antiplatelet and anticoagulant treatments. Lancet. 386 (9990), 281-291 (2015).
  14. Carr, M. E. Development of platelet contractile force as a research and clinical measure of platelet function. Cell Biochem Biophys. 38 (1), 55-78 (2003).
  15. Gresele, P., Bury, L., Mezzasoma, A. M., Falcinelli, E. Platelet function assays in diagnosis: An update. Expert Rev Hematol. 12 (1), 29-46 (2019).
  16. Pakala, R., Waksman, R. Currently available methods for platelet function analysis: Advantages and disadvantages. Cardiovasc Revasc Med. 12 (5), 312-322 (2011).
  17. Paniccia, R., Priora, R., Liotta, A. A., Abbate, R. Platelet function tests: A comparative review. Vasc Health Risk Manag. 11, 133-148 (2015).
  18. Rand, M. L., Leung, R., Packham, M. A. Platelet function assays. Transfus Apher Sci. 28 (3), 307-317 (2003).
  19. Alafeef, M., Dighe, K., Moitra, P., Pan, D. Rapid, ultrasensitive, and quantitative detection of sars-cov-2 using antisense oligonucleotides directed electrochemical biosensor chip. ACS Nano. 14 (12), 17028-17045 (2020).
  20. Chowdhury, A. D., Takemura, K., Li, T. C., Suzuki, T., Park, E. Y. Electrical pulse-induced electrochemical biosensor for hepatitis e virus detection. Nat Commun. 10 (1), 3737 (2019).
  21. Park, J. H., et al. Capacitive biosensor based on vertically paired electrodes for the detection of sars-cov-2. Biosens Bioelectron. 202, 113975 (2022).
  22. Qureshi, A., Pandey, A., Chouhan, R. S., Gurbuz, Y., Niazi, J. H. Whole-cell based label-free capacitive biosensor for rapid nanosize-dependent toxicity detection. Biosens Bioelectron. 67, 100-106 (2015).
  23. Rassaei, L., Mathwig, K., Kang, S., Heering, H. A., Lemay, S. G. Integrated biodetection in a nanofluidic device. ACS Nano. 8 (8), 8278-8284 (2014).
  24. Wang, L., et al. A sensitive DNA capacitive biosensor using interdigitated electrodes. Biosens Bioelectron. 87, 646-653 (2017).
  25. Zhurauski, P., et al. Sensitive and selective affimer-functionalized interdigitated electrode-based capacitive biosensor for her4 protein tumor biomarker detection. Biosens Bioelectron. 108, 1-8 (2018).
  26. Pourang, S., et al. Assessment of fibrinolytic status in whole blood using a dielectric coagulometry microsensor. Biosens Bioelectron. 210, 114299 (2022).
  27. Sekar, P. K., et al. Simultaneous multiparameter whole blood hemostasis assessment using a carbon nanotube-paper composite capacitance sensor. Biosens Bioelectron. 197, 113786 (2022).
  28. P, K. S., et al. Comprehensive multiparameter evaluation of platelet function using a highly sensitive membrane capacitance sensor. Biosens Bioelectron. 228, 115192 (2023).
  29. Franssila, S. . Introduction to microfabrication. , (2010).
  30. Syed Rizvi, S. R. . Handbook of photomask manufacturing technology. , (2018).
  31. Yota, J., Hander, J., Saleh, A. A. A comparative study on inductively-coupled plasma high-density plasma, plasma-enhanced, and low pressure chemical vapor deposition silicon nitride films. J Vacuum Sci Technol A. 18 (2), 372-376 (2000).
  32. Thompson, L. F. An introduction to lithography. ACS Symp Series. 219, 1-13 (1983).
  33. Laermer, F., Urban, A. Challenges, developments and applications of silicon deep reactive ion etching. Microelectron Eng. 67 - 8, 349-355 (2003).
  34. Harsha, K. S. . Principles of vapor deposition of thin films. , (2005).
  35. Lea-Henry, T. N., Carland, J. E., Stocker, S. L., Sevastos, J., Roberts, D. M. Clinical pharmacokinetics in kidney disease: Fundamental principles. Clin J Am Soc Nephrol. 13 (7), 1085-1095 (2018).
  36. Offermanns, S. Activation of platelet function through g protein-coupled receptors. Circ Res. 99 (12), 1293-1304 (2006).
  37. Trejo-Velasco, B., et al. Impact of comorbidities and antiplatelet regimen on platelet reactivity levels in patients undergoing transcatheter aortic valve implantation. J Cardiovasc Pharmacol. 78 (3), 463-473 (2021).
  38. Violi, F., Pignatelli, P., Basili, S. Nutrition, supplements, and vitamins in platelet function and bleeding. Circulation. 121 (8), 1033-1044 (2010).

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на использование текста или рисунков этого JoVE статьи

Запросить разрешение

Смотреть дополнительные статьи

JoVE219

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Конфиденциальность

Условия эксплуатации

Политика

СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

РЕКОМЕНДОВАТЬ БИБЛИОТЕКЕ

НОВОСТИ JoVE

Исследования

Образование

АВТОРЫ

Библиотекарь

О JoVE

Авторские права © 2025 MyJoVE Corporation. Все права защищены