Capacitive Biosensor를 사용한 Dynamic Multiparameter Platelet Function Assessment (동적 다중 파라미터 혈소판 기능 평가)

요약

정전식 바이오센서를 사용한 새로운 동적 다중 매개변수 혈소판 기능 분석을 위한 프로토콜이 여기에 제시되어 있습니다. 생리학적 관련성을 높이기 위해 반강성 미시환경 내에서 설계된 이 접근법은 혈소판 수, 자극 강도 및 활성화 경로에 민감한 세 가지 출력 매개변수를 제공합니다.

초록

혈소판은 유착, 확산, 과립 분비, 응집 및 세포골격 수축을 포함한 일련의 조절 반응을 통해 혈액 응고에 근본적인 역할을 합니다. 그러나 현재의 분석은 비생리학적 조건에서 혈소판 기능의 부분적 분석에 국한되어 있습니다. 따라서 생리학적 환경에서 혈소판 기능의 역동적이고 다면적인 특성을 반영하는 개선된 분석이 필요합니다. 이러한 맥락에서, 기존 분석법과 비교하여 생리학적으로 더 관련성이 높은 생체 외 반강성 미세환경에서 혈소판 기능과 관련된 몇 가지 주요 매개변수를 측정하기 위한 새로운 접근 방식이 도입되었습니다. 이 방법은 고급 전기 바이오센서인 MCS(Membrane Capacitance Sensor)를 활용하며, 이 센서는 세 가지 판독을 통해 응고 과정에 대한 고유한 통찰력을 제공합니다. 이러한 판독값은 혈소판 수, 자극 강도 및 특정 활성화 경로의 변화에 매우 민감합니다. 순수 전기 감지 플랫폼인 MCS는 원발성 지혈 기능 장애를 감지하고, 치료 효과의 효과를 평가하고, 지혈 및 혈전증에서 혈소판의 역할에 대한 광범위한 이해를 촉진하기 위한 진단 도구로서 상당한 잠재력을 보여줍니다.

서문

특수 혈액 세포인 혈소판은 부상 후 출혈을 멈추기 위해 지혈 반응을 조정하고 혈관의 치유를 촉진하는 데 중추적인 역할을 합니다¹. 또한, 그들은 또한 전 세계적으로 혈전색전증 질환 관련 사망의 주요 원인인 혈전증의 중요한 매개체 역할을 합니다 ^2,3,4,5,6. 혈관 손상이 발생하면 혈소판은 일련의 복잡하고 조절된 다단계 기능 과정을 거칩니다. 여기에는 내막 기질에 대한 접착, 세포 내 칼슘의 유입으로 혈소판 구조적 변화, 활성화, 과립 분비, 응집 및 세포골격 수축이 포함되며, 궁극적으로 손상된 부위를 밀봉하고 출혈을 방지하기 위해 지혈 플러그를 형성하고 안정화하는 것이 포함됩니다 ^7,8. 항혈소판제와 치료 전략의 상당한 발전에도 불구하고 ^9,10,11, 혈전증 위험은 지속되고 있다. 항혈소판제 요법 관리는 의인성 출혈의 위험, 지혈을 유지하면서 항혈전제 효능을 달성하기 어려움, 약물 내성을 포함한 환자 반응성의 가변성 등의 문제를 제시합니다^12,13.

혈소판 반응 단계를 관장하는 분자 메커니즘은 잘 문서화되어 있지만, 혈소판 기능을 검사하는 현재의 방법은 여전히 차선책입니다. 기존의 실험실 기반 검사는 접착력, 응집력 또는 응고 점도와 같은 초기에서 중기 단계의 혈소판 활성의 제한된 측면만 평가하기 때문에 종종 부족합니다 7,14,15,16,17,18. 이러한 부분적인 분석으로 인해 정보가 불충분해질 수 있습니다. 또한 이러한 검사는 단일 분석 내에서 여러 중요한 혈소판 기능 요소에 대한 동시적이고 지속적이며 신속한 평가를 제공하지 않습니다. 결과적으로, 이러한 한계는 임상 및 실험 혈액학의 발전을 저해합니다. 시간이 지남에 따라 다양한 생체 의학 응용 분야를 위해 수많은 임피던스 또는 정전 용량 센서가 개발되었습니다 19,20,21,22,23,24,25,26,27,28.

여기에서는 용량성 바이오센서를 사용한 다중 혈소판 기능 평가를 위한 프로토콜을 제시합니다. 제안된 접근 방식은 세포 수준에서 광범위한 혈소판 기능의 동적 변화를 민감하게 모니터링함으로써 매력적인 기능을 제공합니다. 제시된 접근 방식은 두 개의 마이크로칩으로 구성된 바이오센서를 활용합니다: 구연산 혈소판이 풍부한 혈장을 위한 샘플 웰을 특징으로 하는 일회용인 상단 실리콘 칩과 혈소판 접착을 용이하게 하기 위해 인간 피브로넥틴으로 코팅된 감지 전극, 기준 전극을 수용하는 재사용 가능한 하단 실리콘 칩. 혈소판 부착, 활성화 및 활성화 후를 포함하는 전체 응고 과정 동안 동적 커패시턴스 변화를 지속적으로 측정하면 혈소판 수의 변화, 혈소판 활성화 수준 및 활성화 경로의 억제와 관련된 민감한 분석이 가능합니다. 이 방법의 임상적 타당성과 유용성은 관련 인간 혈장 샘플을 사용하여 입증되었으며, 임상 환경에서 강력한 혈소판 기능 평가의 잠재력을 강조했습니다.

프로토콜

연구 제안은 워싱턴 대학교 내부 검토 위원회(UW-IRB; 연구 ID: STUDY00005211). 연구에 참여한 모든 자원 피험자는 서면 동의서를 제공했습니다. 이 연구에 사용된 시약 및 장비의 세부 정보는 재료 표에 나열되어 있습니다.

1. 멤브레인 정전식 센서(MCS)의 제작 단계

알림: MCS 센서는 기존의 미세 가공 기술을 사용하여 제작되었습니다. 이 바이오센서는 상단(T-) 및 하단(B-) 멤브레인 커패시턴스 칩(MCC)으로 구성되었습니다. 간단히 말해서 제작 단계는 그림 1에 나와 있습니다.

1. T-MCC의 미세 가공 단계(그림 1A)
   1. 4인치 실리콘 웨이퍼 기판용 표준 CAD 레이아웃 소프트웨어를 사용하여 T-MCC의 레이아웃을 설계합니다.
   2. 표준 마스크 제작 공정^29,30을 사용하여 디자인을 크롬 유리 포토마스크로 전송합니다.
   3. 깨끗한 양면 광택 실리콘 기판 (400μm 두께)에 표준 저압 화학 기상 증착 (LPCVD) 기술³¹을 사용하여 500nm 두께의 Si₃N₄ 를 증착한다. 수동 스핀 코터를 사용하여 2000rpm에서 25초 동안 AZ 9260 포토레지스트 12μm를 스핀 코팅합니다.
   4. 표준 UV 포토리소그래피 기술⁽³²)을 사용하여, UV 정렬기에서 크롬 유리 포토마스크로 포토레지스트를 노출시키는 것을 포함하는 포토레지스트를 패턴화하고, 레지스트의 UV-노출된 영역을 제거하기 위해 현상액에서 레지스트를 현상한다.
   5. 실리콘 기판을 노출시키는 반응성 이온 에칭 공정을 사용하여 아래에 있는 500nm 두께의 실리콘 질화물 층을 패턴화합니다.
   6. 표준 Bosch 공정인 Deep Reactive Ion Si Etch 공정³³을 사용하여 노출된 400μm 두께의 실리콘 기판을 제거합니다.
   7. 400μm의 실리콘을 제거하기 위해 원하는 에칭 주기 수를 계산합니다.
      참고: 이는 에칭 속도에 영향을 미치기 때문에 공정에 사용되는 도구에 따라 달라집니다(이 경우 1.8μm/cycle).
   8. 실수로_Si3N4층을 에칭하는 것을 방지하기 위해 드라이 에칭을 최소 10μm 전(즉, 390μm)에서 중지하십시오. 5 분 동안 80 °C에 전통적인 높게 선택적인 KOH를 사용하여 남아 있는 실리콘을 제거하십시오.
   9. E-beam evaporation process³⁴ 와 shadow mask를 사용하여 20nm의 Cr과 150nm의 Au 금속층을 연속적으로 증착하여 T-MCC에 감지 전극을 제작합니다.
   10. 이 단계에서 웨이퍼의 T-MCC는 작은 실리콘 홀더로 연결됩니다. 작은 홀더에 조심스럽게 구멍을 뚫어 T-MCC를 분리합니다.
2. B-MCC를 위한 미세 가공 단계(그림 1B)
   1. 열적으로 산화된 깨끗한 실리콘 기판(400μm 두께)에 1.1.9단계와 유사하게 섀도우 마스크를 사용하여 Cr/Au(20nm, 150nm) 금속층을 증착합니다.
   2. 후면 정렬이 가능한 표준 포토리소그래피³² 를 사용한 다음 KOH 습식 에칭 단계를 수행하여 B-MCC를 분리합니다.
      참고: T- 및 B-MCC에는 2.5 x 1.5cm 접촉 패드가 있습니다.

2. 정전 용량 센서의 생체 기능화

참고: 간단히 말해서 이 단계는 T-MCC 전극을 Human Fibronectin(Fn)으로 코팅하여 센서에 혈소판이 쉽게 부착될 수 있도록 하는 것입니다.

1. 생체 분자 코팅을 하기 전에 100W에서 45초 동안 산소 플라즈마로 감지 전극을 청소합니다.
2. 200-proof 에탄올의 1-Dodecanethiol(1mM)을 T-MCC의 샘플 웰에 추가합니다.
3. 건조 질소로 채워진 용기에 T-MCC를 넣고 밀봉하고 파라필름으로 24-48시간 동안 감쌉니다.
4. 금 표면을 탈이온수와 200프루프 에탄올로 헹구고 실온에서 질소 건조를 수행합니다. 이 s에서tage, 다음 단계까지 센서를 건조한 질소 분위기에서 2-8 °C로 보관하십시오.
5. 측정 12시간 전에 인산염 완충 식염수(PBS, 50μg/mL)에 Fn 용액을 넣고 37°C에서 2-8시간 동안 배양합니다.

3. 커패시턴스 센서 설정

참고: 그림 2 는 실험 설정의 사진을 나타냅니다.

1. 마이크로 포지셔너와 니들 프로브가 있는 LCR 미터를 사용하여 센서와 전기적 접촉을 합니다.
2. 3D 프린팅 플라스틱 설비( 재료 표 참조)를 사용하여 T-MCC 및 B-MCC를 안전하게 배치합니다. 하단 고정 장치에는 x-y 축에 스토퍼가 장착되어 있어 B-MCC 위에 T-MCC를 정밀하게 정렬하여 커패시터를 형성할 수 있습니다.
   참고: 사용된 모든 3D 프린터는 워싱턴 대학교에서 제공한 것입니다.
3. 100kHz 및 8Hz 샘플링 속도에서 정현파 신호(0.5V)를 적용합니다.

4. 구연산 혈소판 풍부 혈장(c-PRP)의 제조

참고: 모든 혈액 샘플은 이 연구에 참여한 지원자의 혈액 샘플입니다. 참가자 중 누구도 이전에 알려진 혈소판 이상이나 응고 장애가 없었으며, 검체 채취 전 2주 동안 비스테로이드성 항염증제(NSAID)를 포함한 혈소판 약물을 복용한 적이 없었습니다. 면허가 있는 정맥 의사가 21G 바늘을 사용하여 표준 3.2% 구연산 튜브에 채혈을 실시했습니다. 처음 1mL는 조직 인자 오염을 방지하기 위해 폐기되었습니다. 샘플은 폴리스티렌 용기에 넣어 운반되었으며 모든 측정은 채혈 후 6시간 이내에 수행되었습니다.

1. 전혈 검체를 200 x g 에서 20°C에서 10분 동안 원심분리하여 C-PRP를 얻습니다.
2. c-PRP를 멸균 용기에 옮기고 혈소판 계수를 실시합니다. 억제제 연구의 경우, Tyrode의 완충액에 사전 정의된 농도의 약물로 c-PRP를 배양합니다(자세한 내용은 결과 섹션 참조).

5. 혈소판 기능 분석

참고: 제시된 혈소판 기능 분석에 대한 개략도는 그림 3에 나와 있습니다.

1. T-MCC 및 B-MCC를 3D 프린팅 설비에 조립합니다.
2. 기준선 커패시턴스 측정을 5분 동안 측정한 다음 T-MCC의 샘플 웰에 45μL의 c-PRP를 추가합니다.
3. 혈소판이 T-MCC의 Fn 코팅 전극에 부착될 때까지 30분 동안 기다립니다.
4. 멤브레인에 부착된 혈소판을 건드리지 않도록 30μL의 c-PRP를 조심스럽게 제거하고 즉시 Tyrode의 완충액을 보충합니다. 활성화 후 추가 혈소판 또는 거대 응집체가 감지 전극에 떨어지지 않도록 20초 간격으로 최소 5회 세척을 반복합니다.
5. 10μL의 작용제 용액(트롬빈 또는 ADP)을 원하는 농도로 추가합니다. 80분의 평형 시간을 허용합니다.

6. 신호 마커에 대한 데이터 및 통계 분석

알림: 커패시턴스는 5.2-5.5 단계에서 연속적으로 측정됩니다.

1. 접착 단계(단계 5.3) 동안의 커패시턴스 신호의 경우, 30분 평형 시간 후 커패시턴스의 최대 변화를 측정하며, 이를 ΔC_adh라고 합니다.
2. 유사하게, 활성화 단계 (단계 5.5)의 경우, ΔC_act라고하는 커패시턴스의 최대 변화와 S_act라고하는 활성화 후 200-300 초 사이의 곡선 기울기를 측정합니다.
3. 분산 분석(ANOVA)을 Tukey의 사후 혹과 함께 사용하여 그룹 간의 결과를 비교합니다. 정규 분포 분석을 위해 Shapiro-Wilk 적합도를 사용합니다.

결과

본 연구는 혈소판 기능에 대한 동적 평가를 수행하는 것을 목표로 한다. 상기한 프로토콜에 따라 c-PRP 용액을 제조하고, T-MCC의 Fn 코팅 전극에 혈소판을 파종하였다. 자유 부유 혈소판은 세척 단계에 의해 씻겨 나갔고, 부착된 혈소판을 활성화하기 위해 작용제를 첨가했습니다. 자세한 결과와 논의는 이전 보고서²⁸에서 확인할 수 있습니다.

토론

이 연구는 혈소판 기능을 평가하기 위한 새로운 커패시턴스 기반 방법을 개척했으며, 이는 단일 장치 내에서 접착 및 활성화 후 혈소판 역학을 모두 평가하여 이러한 접근 방식의 첫 번째 보고 사례를 표시합니다. 이 새로운 실험 프로토콜은 세척 절차를 통해 피브린 형성 및 혈장 응고 인자의 영향을 상쇄하기 위해 비교적 간단한 기술을 도입합니다. 그 결과 혈소판 기능...

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
1-Dodecanethiol	Sigma-Aldrich, MO, U.S.A	471364-100ML	1 mM
200-proof ethanol	Sigma-Aldrich, MO, U.S.A	EX0276-1
3D printer	Shenzhen Creality 3D Technology Co, Ltd.	Ender-3 V3
3D printing material	HATCHBOX 3D, CA, U.S.A	3D PLA-1KG-1.75
Adenosine 5′-diphosphate	Sigma Aldrich, U.S.A	01905-250MG-F	ADP
Aspirin	Sigma-Aldrich, MO, U.S.A	A2093-100G
Deep Reactive Ion Etching	Omega Engineering, Inc.	SPTS Rapier DRIE
Dimethyl Sulfoxide	Sigma-Aldrich, MO, U.S.A	D8418-50ML	DMSO
High Vacuum Deposition Systems	CHA	SEC-600
Human Fibronectin	Sigma-Aldrich, MO, U.S.A	CLS356008-1EA	Fn
KOH	Sigma-Aldrich, MO, U.S.A	P1767-250G
LCR meter	Keithley Instruments, Inc., OH, U.S.A	Keithley EL 4980AL
LCR meter holders	Signatone Corporation, CA, U.S.A	SCA-50-4
Mask Aligner System	ABM, U.S.A, Inc.	ABM/6/350/NUV/DCCD/SA
Micro-positioners	Signatone, CA, U.S.A	S-725
needle probe	Signatone Corporation, CA, U.S.A	SCAT5T-4	12.5 μm radius
Phosphate Buffered Saline	Sigma-Aldrich, MO, U.S.A	P4474-1L	PBS, pH 7.4
Reactive Ion Etching	Plasma-Therm,U.S.A	RIE Vision 320
silicon substrate	Wafer World Inc	SKU# 1766
Standard 3.2% citrate tubes	Tiger Medical, NJ, U.S.A.	Covidien / Cardinal Health 8881340478 Monoject
Thrombin	Enzyme Research Laboratories, U.S.A	HT 1002a
Ticagrelor	Sigma-Aldrich, MO, U.S.A	PHR2788-400MG
Tyrode’s buffer	Boston Bioproducts, U.S.A	BSS-375
UV photoresist	AZ electronic materials, NC, U.S.A.	AZ 9260	15um