JoVE Logo
著者
お問い合わせ

サインイン

このコンテンツを視聴するには、JoVE 購読が必要です。 サインイン又は無料トライアルを申し込む。

この記事について

  • 要約
  • 要約
  • 概要
  • プロトコル
  • 結果
  • ディスカッション
  • 開示事項
  • 謝辞
  • 資料
  • 参考文献
  • 転載および許可

要約

ここでは、静電容量式バイオセンサーを用いた新しい動的マルチパラメータ血小板機能アッセイのプロトコールを紹介します。このアプローチは、生理学的関連性を高めるために半硬質の微小環境内で設計されており、血小板数、刺激強度、および活性化経路に敏感な3つの出力パラメータを提供します。

要約

血小板は、接着、拡散、顆粒分泌、凝集、細胞骨格収縮などの一連の調節応答を通じて、血液凝固に基本的な役割を果たします。しかし、現在のアッセイは、非生理学的条件下での血小板機能の部分的な分析に限定されています。したがって、生理学的環境における血小板機能の動的で多面的な性質を反映した改良されたアッセイが必要です。これに関連して、従来のアッセイと比較して、より生理学的に関連性のあるex vivo半硬性微小環境で血小板機能に関連するいくつかの重要なパラメーターを測定するための新しいアプローチが導入されています。この方法では、高度な電気バイオセンサーである膜静電容量センサー(MCS)を利用し、3つの異なる読み出しを通じて凝固プロセスに関する独自の洞察を提供します。これらの測定値は、血小板数、刺激強度、および特定の活性化経路の変動に非常に敏感です。純粋な電気センシングプラットフォームとして、MCSは、一次止血機能障害を検出し、治療効果を評価し、止血と血栓症における血小板の役割についての幅広い理解を進めるための診断ツールとして大きな可能性を示しています。

概要

特殊な血液細胞である血小板は、損傷後の出血を止めるための止血反応を調整し、血管の治癒を促進する上で極めて重要です1。さらに、それらはまた、血栓塞栓症の世界的な死亡の主な原因である血栓症の重要なメディエーターとして機能します2,3,4,5,6。血管損傷が発生すると、血小板は一連の複雑で制御された多段階の機能プロセスを経ます。これらには、内膜マトリックスへの接着、細胞内カルシウムの流入が血小板のコンフォメーション変化を引き起こすこと、活性化、顆粒分泌、凝集、および細胞骨格の収縮が含まれ、最終的には止血栓を形成して安定化し、損傷部位を密閉し、出血を防ぎます7,8。抗血小板薬と治療戦略9,10,11の著しい進歩にもかかわらず、血栓症のリスクは依然として続いている。抗血小板療法の管理には、医原性出血のリスク、止血を維持しながら抗血栓効果を達成することの難しさ、薬剤耐性を含む患者の反応性のばらつきなどの課題があります12,13。

血小板応答期を支配する分子メカニズムは十分に文書化されていますが、血小板機能を試験するための現在の方法は依然として最適ではありません。従来の実験室ベースの検査は、接着、凝集、または血栓粘度7,14,15,16,17,18など、初期から中期の血小板活性の限られた側面のみを評価するため、不十分であることがよくあります。この部分的な分析は、不十分な情報につながる可能性があります。さらに、これらのテストでは、1つのアッセイ内で複数の重要な血小板機能要素を同時に、連続的に、迅速に評価することはできません。その結果、この制限は、臨床血液学と実験血液学の両方の進歩を妨げます。時間の経過とともに、さまざまな生物医学的アプリケーション19、20、21、22、23、24、25、26、27、28のために、多数のインピーダンスセンサーまたは静電容量センサーが開発されてきました。

ここでは、静電容量式バイオセンサーを用いたマルチプレックス血小板機能評価のプロトコールを紹介します。提案されたアプローチは、細胞レベルで広範囲の血小板機能の動的変化を敏感に監視することにより、魅力的な機能を提供します。提示されたアプローチは、2つのマイクロチップで構成されるバイオセンサーを利用しています:使い捨てで、引用された多血小板血漿用のサンプルウェルと、血小板の接着を容易にするためにヒトフィブロネクチンでコーティングされたセンシング電極、および参照電極を収容する再利用可能な下部シリコンチップ。血小板の接着、活性化、活性化後を含む凝固プロセス全体における動的静電容量の変化を連続的に測定することで、血小板数、血小板活性化レベル、活性化経路の阻害の変動に関連する高感度な分析が可能になります。この方法の臨床的実現可能性と有用性は、適切なヒト血漿サンプルを使用して示され、臨床現場での堅牢な血小板機能評価の可能性を強調しています。

プロトコル

この研究提案は、ワシントン大学内部審査委員会(UW-IRB;スタディID:STUDY00005211)。研究に参加したすべてのボランティア被験者は、書面によるインフォームドコンセントを提供しました。本試験で使用した試薬および装置の詳細は、 材料表に記載されています。

1. メンブレン静電容量センサー(MCS)の作製手順

注:MCSセンサーは、従来の微細加工技術を利用して製造されました。このバイオセンサーは、上部(T-)と下部(B-)の膜静電容量チップ(MCC)で構成されていました。簡単に説明すると、製造手順を 図1に示します。

  1. T-MCCの微細加工ステップ(図1A)
    1. T-MCCのレイアウト設計は、4インチシリコンウェーハ基板の標準CADレイアウトソフトウェアで行います。
    2. 標準的なマスク製造プロセス29,30を使用して、デザインをクロムガラスフォトマスクに転写します。
    3. 清浄な両面研磨シリコン基板(厚さ400μm)上に、標準的な低圧化学気相成長法(LPCVD)技術31を用いて、厚さ500nmのSi3N4を堆積させる。AZ 9260フォトレジスト12 μmを2000 rpmで25秒間スピンコートします。
    4. 標準的なUVフォトリソグラフィー技術32を使用して、フォトレジストをパターン化し、UVアライナー内のクロムガラスフォトマスクでフォトレジストを露光し、レジストのUV露光領域を除去するための現像液でレジストを開発する。
    5. 厚さ500 nmの窒化ケイ素層を反応性イオンエッチングプロセスでパターニングし、シリコン基板を露出させます。
    6. 露出した厚さ400μmのシリコン基板を、標準的なBoschプロセスであるDeep Reactive Ion Si Etch Process33を使用して除去します。
    7. 400 μmのシリコンを除去するために必要なエッチングサイクル数を計算します。
      注:これは、エッチング速度に影響を与えるため、プロセスに使用するツールによって異なります(この場合は1.8μm/サイクルでした)。
    8. Si3N4 層を誤ってエッチングしないように、少なくとも10 μm前(つまり390 μm)でドライエッチングを停止します。従来の高選択的KOHを使用して、80°Cで5分間、残りのシリコンを除去します。
    9. Eビーム蒸着プロセス34 とシャドーマスクを用いて、20 nmのCrと150 nmのAu金属層を連続して堆積させ、T-MCCにセンシング電極を作製する。
    10. この段階で、ウェーハ内のT-MCCは小さなシリコンホルダーで接続されます。T-MCCを分離するには、小さなホルダーに慎重に穴を開けます。
  2. B-MCCの微細加工ステップ(図1B)
    1. クリーンな熱酸化シリコン基板(厚さ400μm)上に、ステップ1.1.9と同様に、シャドウマスクを使用してCr/Au(20nm、150nm)金属層を堆積させます。
    2. 標準のフォトリソグラフィー32 を裏面の位置合わせで使用し、その後、KOHウェットエッチングステップを使用してB-MCCを解放します。
      注意: T-およびB-MCCには2.5 x 1.5 cmのコンタクトパッドがあります。

2. 静電容量センサーの生体機能化

注:簡単に言えば、この手順は、T-MCC電極をヒトフィブロネクチン(Fn)でコーティングして、センサーへの血小板の取り付けを容易にすることです。

  1. 生体分子コーティングの前に、センシング電極を酸素プラズマで100Wで45秒間洗浄します。
  2. 200プルーフエタノール中の1-ドデカンチオール(1 mM)をT-MCC上のサンプルウェルに加えます。
  3. T-MCCを乾燥窒素で満たされた容器に入れ、密封し、パラフィルムで包んで24〜48時間待ちます。
  4. 金の表面を脱イオン水と200プルーフエタノールですすぎ、室温で窒素乾燥させます。この段階では、次のステップまで、センサーを乾燥窒素雰囲気で2〜8°Cに保管します。
  5. 測定の12時間前にリン酸緩衝生理食塩水(PBS、50 μg/mL)中のFn溶液をウェルに加え、37°Cで2〜8時間インキュベートします。

3. 静電容量センサーのセットアップ

注: 図2 は、実験装置の写真を示しています。

  1. マイクロポジショナーとニードルプローブを備えたLCRメーターを使用して、センサーと電気的に接触させます。
  2. 3Dプリントされたプラスチック製の固定具( 材料の表を参照)を使用して、T-MCCとB-MCCをしっかりと配置します。下部の固定具には、T-MCCとB-MCCの正確な位置合わせを確保してコンデンサを形成するために、x-y軸にストッパーが装備されています。
    注:使用されたすべての3Dプリンターはワシントン大学のものでした。
  3. 100 kHz で正弦波信号 (0.5 V) を 8 Hz のサンプリング レートで印加します。

4. クエン酸多血小板血漿(c-PRP)の調製

注:すべての血液サンプルは、この研究に参加したボランティアからのものでした。参加者のいずれも、以前に知られている血小板異常または凝固障害を患っておらず、サンプル採取までの2週間に非ステロイド性抗炎症薬(NSAIDs)を含む血小板薬を服用していなかった。認可された瀉血医は、21 G の針を使用して標準的な 3.2% クエン酸チューブに採血を行いました。最初の1 mLは、組織因子の汚染を避けるために廃棄しました。サンプルはポリスチレン容器に入れて輸送し、すべての測定は採血から6時間以内に行いました。

  1. 全血サンプルを200 x g で20°Cで10分間遠心分離し、c-PRPを取得します。
  2. c-PRPを滅菌容器に移し、血小板数を測定します。阻害剤研究では、c-PRPをTyrodeの緩衝液中の薬物の事前定義された濃度でインキュベートします(詳細については、「結果」セクションを参照)。

5. 血小板機能アッセイ

注:提示された血小板機能アッセイの概略図を 図3に示します。

  1. T-MCCとB-MCCを3Dプリントされたフィクスチャに組み立てます。
  2. ベースラインキャパシタンス測定を5分間測定し、その後、T-MCCのサンプルウェルに45μLのc-PRPを加えます。
  3. 血小板がT-MCCのFn被覆電極に付着するまで30分待ちます。
  4. メンブレンに付着した血小板に触れないようにc-PRP30μLを慎重に取り出し、すぐにTyrodeのバッファーを補充してください。20秒間隔で少なくとも5回洗浄を繰り返して、活性化後に追加の血小板やマクロ凝集体がセンシング電極に着地しないようにします。
  5. アゴニスト溶液(トロンビンまたはADP)10 μLを所望の濃度で添加します。80分の平衡化時間を確保します。

6. シグナルマーカーのデータ・統計解析

注意: 静電容量は、ステップ5.2〜5.5から連続して測定されます。

  1. 接着フェーズ(ステップ5.3)の静電容量信号については、30分間の平衡化時間後の静電容量の最大変化( ΔCadhと呼ばれます)を測定します。
  2. 同様に、アクティベーションフェーズ(ステップ5.5)では、静電容量の最大変化(ΔCアクトと呼ばれる)と、アクティベーション後の200〜300秒の間の曲線の傾き(Sアクトと呼ばれる)を測定します。
  3. テューキーの事後分析で分散分析(ANOVA)を使用して、グループ間の結果を比較します。正規分布分析には、Shapiro-Wilk 適合度を使用します。

結果

この研究は、血小板機能の動的評価を行うことを目的としています。上記のプロトコルに従って、c-PRP溶液を調製し、血小板をT-MCCのFn被覆電極に播種した。フリーフローティング血小板を洗浄ステップで洗い流し、付着した血小板を活性化するためにアゴニストを添加しました。詳細な結果と議論は、前回のレポート28で見つけることができます。<...

ディスカッション

この研究は、単一のデバイス内での接着と活性化後の血小板動態の両方を評価する、血小板機能を評価するための新しい静電容量ベースの方法を開拓し、そのようなアプローチの最初の報告された例を示しています。この新しい実験プロトコルは、ウォッシュアウト手順を通じてフィブリン形成と血漿凝固因子の影響を打ち消す比較的簡単な技術を導入しています。...

開示事項

著者は、競合する利益を宣言しません。

謝辞

著者らは、貴重な議論と技術支援を提供してくださったMoritz Stolla博士とJason Acker博士に感謝の意を表します。また、ワシントン大学のBiology Imaging Facilityのインフラストラクチャとサポートも評価しています。この研究は、ワシントン大学のCoMotion Innovation Fund(Grant No. 682548, D.Y.G.)から一部資金提供を受けました。

資料

NameCompanyCatalog NumberComments
1-DodecanethiolSigma-Aldrich, MO, U.S.A471364-100ML1 mM
200-proof ethanolSigma-Aldrich, MO, U.S.AEX0276-1
3D printerShenzhen Creality 3D Technology Co, Ltd.Ender-3 V3
3D printing materialHATCHBOX 3D, CA, U.S.A3D PLA-1KG-1.75
Adenosine 5′-diphosphateSigma Aldrich, U.S.A01905-250MG-FADP
Aspirin Sigma-Aldrich, MO, U.S.AA2093-100G
Deep Reactive Ion EtchingOmega Engineering, Inc.SPTS Rapier DRIE
Dimethyl SulfoxideSigma-Aldrich, MO, U.S.AD8418-50MLDMSO
High Vacuum Deposition SystemsCHA SEC-600
Human FibronectinSigma-Aldrich, MO, U.S.ACLS356008-1EAFn
KOHSigma-Aldrich, MO, U.S.AP1767-250G
LCR meter Keithley Instruments, Inc., OH, U.S.AKeithley EL 4980AL
LCR meter holdersSignatone Corporation, CA, U.S.ASCA-50-4
Mask Aligner SystemABM, U.S.A, Inc.ABM/6/350/NUV/DCCD/SA
Micro-positionersSignatone, CA, U.S.AS-725
needle probeSignatone Corporation, CA, U.S.ASCAT5T-412.5 μm radius
Phosphate Buffered SalineSigma-Aldrich, MO, U.S.AP4474-1LPBS, pH 7.4
Reactive Ion EtchingPlasma-Therm,U.S.ARIE Vision 320
silicon substrateWafer World IncSKU# 1766
Standard 3.2% citrate tubesTiger Medical, NJ, U.S.A.Covidien / Cardinal Health 8881340478 Monoject
ThrombinEnzyme Research Laboratories, U.S.AHT 1002a
TicagrelorSigma-Aldrich, MO, U.S.APHR2788-400MG
Tyrode’s bufferBoston Bioproducts, U.S.ABSS-375
UV photoresistAZ electronic materials, NC, U.S.A.AZ 926015um

参考文献

  1. George, J. N. Platelets. Lancet. 355 (9214), 1531-1539 (2000).
  2. Wendelboe, A. M., Raskob, G. E. Global burden of thrombosis: Epidemiologic aspects. Circ Res. 118 (9), 1340-1347 (2016).
  3. Heit, J. A. Epidemiology of venous thromboembolism. Nat Rev Cardiol. 12 (8), 464-474 (2015).
  4. Moran, A. E., et al. The global burden of ischemic heart disease in 1990 and 2010: The global burden of disease 2010 study. Circulation. 129 (14), 1493-1501 (2014).
  5. Campbell, B. C. V., et al. Ischaemic stroke. Nat Rev Dis Primers. 5 (1), 70 (2019).
  6. Ruggeri, Z. M. Platelets in atherothrombosis. Nat Med. 8 (11), 1227-1234 (2002).
  7. Harrison, P. Platelet function analysis. Blood Rev. 19 (2), 111-123 (2005).
  8. Van Der Meijden, P. E. J., Heemskerk, J. W. M. Platelet biology and functions: New concepts and clinical perspectives. Nat Rev Cardiol. 16 (3), 166-179 (2019).
  9. Bhatt, D. L., Topol, E. J. Scientific and therapeutic advances in antiplatelet therapy. Nat Rev Drug Discov. 2 (1), 15-28 (2003).
  10. Mcfadyen, J. D., Schaff, M., Peter, K. Current and future antiplatelet therapies: Emphasis on preserving hemostasis. Nat Rev Cardiol. 15 (3), 181-191 (2018).
  11. Michelson, A. D. Advances in antiplatelet therapy. Hematology Am Soc Hematol Educ Program. 2011, 62-69 (2011).
  12. Sweeny, J. M., Gorog, D. A., Fuster, V. Antiplatelet drug 'resistance'. Part 1: Mechanisms and clinical measurements. Nat Rev Cardiol. 6 (4), 273-282 (2009).
  13. Mega, J. L., Simon, T. Pharmacology of antithrombotic drugs: An assessment of oral antiplatelet and anticoagulant treatments. Lancet. 386 (9990), 281-291 (2015).
  14. Carr, M. E. Development of platelet contractile force as a research and clinical measure of platelet function. Cell Biochem Biophys. 38 (1), 55-78 (2003).
  15. Gresele, P., Bury, L., Mezzasoma, A. M., Falcinelli, E. Platelet function assays in diagnosis: An update. Expert Rev Hematol. 12 (1), 29-46 (2019).
  16. Pakala, R., Waksman, R. Currently available methods for platelet function analysis: Advantages and disadvantages. Cardiovasc Revasc Med. 12 (5), 312-322 (2011).
  17. Paniccia, R., Priora, R., Liotta, A. A., Abbate, R. Platelet function tests: A comparative review. Vasc Health Risk Manag. 11, 133-148 (2015).
  18. Rand, M. L., Leung, R., Packham, M. A. Platelet function assays. Transfus Apher Sci. 28 (3), 307-317 (2003).
  19. Alafeef, M., Dighe, K., Moitra, P., Pan, D. Rapid, ultrasensitive, and quantitative detection of sars-cov-2 using antisense oligonucleotides directed electrochemical biosensor chip. ACS Nano. 14 (12), 17028-17045 (2020).
  20. Chowdhury, A. D., Takemura, K., Li, T. C., Suzuki, T., Park, E. Y. Electrical pulse-induced electrochemical biosensor for hepatitis e virus detection. Nat Commun. 10 (1), 3737 (2019).
  21. Park, J. H., et al. Capacitive biosensor based on vertically paired electrodes for the detection of sars-cov-2. Biosens Bioelectron. 202, 113975 (2022).
  22. Qureshi, A., Pandey, A., Chouhan, R. S., Gurbuz, Y., Niazi, J. H. Whole-cell based label-free capacitive biosensor for rapid nanosize-dependent toxicity detection. Biosens Bioelectron. 67, 100-106 (2015).
  23. Rassaei, L., Mathwig, K., Kang, S., Heering, H. A., Lemay, S. G. Integrated biodetection in a nanofluidic device. ACS Nano. 8 (8), 8278-8284 (2014).
  24. Wang, L., et al. A sensitive DNA capacitive biosensor using interdigitated electrodes. Biosens Bioelectron. 87, 646-653 (2017).
  25. Zhurauski, P., et al. Sensitive and selective affimer-functionalized interdigitated electrode-based capacitive biosensor for her4 protein tumor biomarker detection. Biosens Bioelectron. 108, 1-8 (2018).
  26. Pourang, S., et al. Assessment of fibrinolytic status in whole blood using a dielectric coagulometry microsensor. Biosens Bioelectron. 210, 114299 (2022).
  27. Sekar, P. K., et al. Simultaneous multiparameter whole blood hemostasis assessment using a carbon nanotube-paper composite capacitance sensor. Biosens Bioelectron. 197, 113786 (2022).
  28. P, K. S., et al. Comprehensive multiparameter evaluation of platelet function using a highly sensitive membrane capacitance sensor. Biosens Bioelectron. 228, 115192 (2023).
  29. Franssila, S. . Introduction to microfabrication. , (2010).
  30. Syed Rizvi, S. R. . Handbook of photomask manufacturing technology. , (2018).
  31. Yota, J., Hander, J., Saleh, A. A. A comparative study on inductively-coupled plasma high-density plasma, plasma-enhanced, and low pressure chemical vapor deposition silicon nitride films. J Vacuum Sci Technol A. 18 (2), 372-376 (2000).
  32. Thompson, L. F. An introduction to lithography. ACS Symp Series. 219, 1-13 (1983).
  33. Laermer, F., Urban, A. Challenges, developments and applications of silicon deep reactive ion etching. Microelectron Eng. 67 - 8, 349-355 (2003).
  34. Harsha, K. S. . Principles of vapor deposition of thin films. , (2005).
  35. Lea-Henry, T. N., Carland, J. E., Stocker, S. L., Sevastos, J., Roberts, D. M. Clinical pharmacokinetics in kidney disease: Fundamental principles. Clin J Am Soc Nephrol. 13 (7), 1085-1095 (2018).
  36. Offermanns, S. Activation of platelet function through g protein-coupled receptors. Circ Res. 99 (12), 1293-1304 (2006).
  37. Trejo-Velasco, B., et al. Impact of comorbidities and antiplatelet regimen on platelet reactivity levels in patients undergoing transcatheter aortic valve implantation. J Cardiovasc Pharmacol. 78 (3), 463-473 (2021).
  38. Violi, F., Pignatelli, P., Basili, S. Nutrition, supplements, and vitamins in platelet function and bleeding. Circulation. 121 (8), 1033-1044 (2010).

転載および許可

このJoVE論文のテキスト又は図を再利用するための許可を申請します

許可を申請

さらに記事を探す

JoVE 219

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

個人情報保護方針

利用規約

一般データ保護規則

お問い合わせ

図書館への推薦

JoVE ニュースレター

研究

教育

著者

図書館員

JoVEについて

Copyright © 2023 MyJoVE Corporation. All rights reserved