Avaliação dinâmica da função plaquetária multiparamétrica usando um biossensor capacitivo

Resumo

Um protocolo para um novo ensaio funcional de plaquetas multiparâmetro dinâmico usando um biossensor capacitivo é apresentado aqui. Essa abordagem, projetada em um microambiente semirrígido para aumentar a relevância fisiológica, fornece três parâmetros de saída sensíveis à contagem de plaquetas, forças de estimulação e vias de ativação.

Resumo

As plaquetas desempenham um papel fundamental na coagulação do sangue por meio de uma série de respostas reguladas, incluindo adesão, disseminação, secreção granular, agregação e contração do citoesqueleto. No entanto, os ensaios atuais são limitados à análise parcial da função plaquetária em condições não fisiológicas. Assim, é necessário um ensaio aprimorado que reflita a natureza dinâmica e multifacetada da função plaquetária em ambientes fisiológicos. Nesse contexto, uma nova abordagem é introduzida para medir vários parâmetros-chave relacionados à função plaquetária em um microambiente semirrígido ex vivo mais fisiologicamente relevante em comparação com os ensaios tradicionais. Este método utiliza um biossensor elétrico avançado, o sensor de capacitância de membrana (MCS), que fornece informações exclusivas sobre o processo de coagulação por meio de três leituras distintas. Essas leituras são altamente sensíveis a variações na contagem de plaquetas, intensidade de estimulação e vias de ativação específicas. Como uma plataforma de detecção puramente elétrica, o MCS demonstra um potencial significativo como ferramenta de diagnóstico para detectar distúrbios primários da função hemostática, avaliar a eficácia de tratamentos terapêuticos e avançar na compreensão mais ampla dos papéis das plaquetas na hemostasia e trombose.

Introdução

As plaquetas, células sanguíneas especializadas, são fundamentais para orquestrar a resposta hemostática para interromper o sangramento após a lesão e facilitar a cicatrização dos vasos sanguíneos^. Além disso, eles também servem como mediadores cruciais na trombose, uma das principais causas de mortes relacionadas à doença tromboembólica em todo o mundo 2,3,4,5,6. Quando ocorre uma lesão vascular, as plaquetas passam por uma série de processos funcionais complexos, regulados e em vários estágios. Estes incluem adesão à matriz intimal, um influxo de cálcio intracelular desencadeando alterações conformacionais plaquetárias, ativação, secreção de grânulos, agregação e contração do citoesqueleto, formando e estabilizando tampões hemostáticos para selar os locais danificados e prevenir sangramento ^7,8. Apesar dos avanços significativos nas drogas antiplaquetárias e estratégias terapêuticas ^9,10,11, o risco de trombose persiste. O manejo da terapia antiplaquetária apresenta desafios, incluindo o risco de sangramento iatrogênico, dificuldade em alcançar eficácia antitrombótica mantendo a hemostasia e variabilidade na capacidade de resposta do paciente, incluindo resistência aos medicamentos^12,13.

Embora os mecanismos moleculares que governam as fases de resposta plaquetária estejam bem documentados, os métodos atuais para testar a função plaquetária permanecem abaixo do ideal. Os testes laboratoriais tradicionais geralmente ficam aquém, pois avaliam apenas aspectos limitados da atividade plaquetária em estágio inicial a intermediário, como adesão, agregação ou viscosidade do coágulo 7,14,15,16,17,18. Essa análise parcial pode levar a informações insuficientes. Além disso, esses testes não oferecem avaliação simultânea, contínua e rápida de vários elementos funcionais plaquetários cruciais em um único ensaio. Consequentemente, essa limitação dificulta os avanços na hematologia clínica e experimental. Ao longo do tempo, uma infinidade de sensores impedimétricos ou capacitivos foram desenvolvidos para várias aplicações biomédicas 19,20,21,22,23,24,25,26,27,28.

Aqui, apresentamos o protocolo para uma avaliação da função plaquetária multiplexada usando um biossensor capacitivo. A abordagem proposta oferece um recurso atraente ao monitorar sensivelmente as mudanças dinâmicas em um amplo espectro de funções plaquetárias no nível celular. A abordagem apresentada utiliza um biossensor composto por dois microchips: um chip de silicone superior, que é descartável, apresentando um poço de amostra para plasma rico em plaquetas citrato e um eletrodo sensor revestido com fibronectina humana para facilitar a adesão plaquetária, juntamente com um chip de silício inferior reutilizável que abriga um eletrodo de referência. A medição contínua das mudanças dinâmicas de capacitância durante todo o processo de coagulação, abrangendo adesão, ativação e pós-ativação plaquetária, permite análises sensíveis ligadas a variações na contagem de plaquetas, níveis de ativação plaquetária e inibição das vias de ativação. A viabilidade clínica e a utilidade desse método foram demonstradas usando amostras de plasma humano pertinentes, ressaltando seu potencial para uma avaliação robusta da função plaquetária em ambientes clínicos.

Protocolo

A proposta do estudo foi aprovada pela Divisão de Seres Humanos (HSD) do Conselho de Revisão Interna da Universidade de Washington (UW-IRB; ID do estudo: STUDY00005211). Todos os voluntários que participaram do estudo assinaram o termo de consentimento livre e esclarecido. Os detalhes dos reagentes e equipamentos usados neste estudo estão listados na Tabela de Materiais.

1. Etapas de fabricação do sensor capacitivo de membrana (MCS)

NOTA: O sensor MCS foi fabricado utilizando técnicas tradicionais de microfabricação. Este biossensor era composto por um chip de capacitância de membrana superior (T-) e inferior (B-) (MCC). Resumidamente, as etapas de fabricação são mostradas na Figura 1.

1. Etapas de microfabricação para T-MCC (Figura 1A)
   1. Projete o layout do T-MCC usando o software de layout CAD padrão para um substrato de wafer de silício de 4 polegadas.
   2. Transfira o desenho para uma fotomáscara de vidro de cromo usando o processo de fabricação de máscara padrão^29,30.
   3. Em um substrato de silício polido de dupla face limpo (400 μm de espessura), deposite 500 nm de espessura de Si₃N₄ usando a técnica padrão de deposição de vapor químico de baixa pressão (LPCVD)³¹. Revestimento de rotação de 12 μm de fotorresistente AZ 9260 a 2000 rpm por 25 s usando um revestidor de rotação manual.
   4. Usando a técnica padrão de fotolitografia UV³², padronize o fotorresistente, que envolve expor o fotorresistente com a fotomáscara de vidro cromado em um alinhador UV e desenvolver a resistência em uma solução reveladora para remover a região exposta aos raios UV da resistência.
   5. Padronize a camada subjacente de nitreto de silício de 500 nm de espessura usando um processo de gravação de íons reativos, que expõe o substrato de silício.
   6. Remova o substrato de silício exposto de 400 μm de espessura usando um processo padrão da Bosch: processo Deep Reactive Ion Si Etch³³.
   7. Calcule o número desejado de ciclos de gravação para remover 400 μm de silício.
      NOTA: Isso varia de acordo com a ferramenta utilizada para o processo, pois influenciará a taxa de gravação (neste caso, foi de 1,8 μm/ciclo).
   8. Para evitar a corrosão acidental da camada Si₃N₄ , pare a corrosão seca pelo menos 10 μm antes (ou seja, a 390 μm). Remova o silício restante usando o KOH altamente seletivo tradicional a 80 ° C por 5 min.
   9. Depositar 20 nm de Cr e 150 nm de camadas metálicas de Au consecutivamente usando um processo de evaporação de feixe E³⁴ e uma máscara de sombra para fabricar o eletrodo sensor no T-MCC.
   10. Nesta fase, os T-MCCs no wafer serão conectados por minúsculos suportes de silício. Separe os T-MCCs perfurando cuidadosamente os suportes minúsculos.
2. Etapas de microfabricação para B-MCC (Figura 1B)
   1. Em um substrato de silício limpo termicamente oxidado (400 μm de espessura), deposite camadas de metal Cr/Au (20 nm, 150 nm) usando uma máscara de sombra, semelhante à etapa 1.1.9.
   2. Use fotolitografia padrão³² com alinhamento traseiro, seguido por uma etapa de gravação úmida KOH para liberar os B-MCCs.
      NOTA: O T- e o B-MCC têm almofadas de contato de 2.5 x 1.5 cm.

2. Biofuncionalização do sensor capacitivo

NOTA: Resumidamente, esta etapa é sobre o revestimento do eletrodo T-MCC com fibronectina humana (Fn) para facilitar a fixação de plaquetas no sensor.

1. Antes dos revestimentos biomoleculares, limpe o eletrodo sensor com plasma de oxigênio por 45 s a 100 W.
2. Adicione 1-Dodecanetiol (1 mM) em etanol à prova de 200 ao poço da amostra em T-MCCs.
3. Coloque os T-MCCs em um recipiente cheio de nitrogênio seco, selado e envolto em parafilme por 24-48 h.
4. Enxágue a superfície dourada com água deionizada e etanol à prova de 200, seguido de secagem com nitrogênio em temperatura ambiente. Nesta fase, armazene os sensores a 2-8 °C em uma atmosfera seca de nitrogênio até as próximas etapas.
5. Adicionar solução salina tamponada com fosfato (PBS, 50 μg/ml) ao poço 12 h antes da medição e incubar a 37 °C durante 2-8 h.

3. Configuração do sensor de capacitância

NOTA: A Figura 2 representa a fotografia da configuração experimental.

1. Use um medidor LCR com microposicionadores e sondas de agulha para fazer contato elétrico com o sensor.
2. Empregue acessórios de plástico impressos em 3D (consulte a Tabela de Materiais) para colocar com segurança o T- e o B-MCC. O acessório inferior é equipado com rolhas no eixo xy para garantir o alinhamento preciso do T-MCC sobre o B-MCC para formar um capacitor.
   NOTA: Todas as impressoras 3D utilizadas eram da Universidade de Washington.
3. Aplique um sinal senoidal (0.5 V) a 100 kHz e uma taxa de amostragem de 8 Hz.

4. Preparação de plasma rico em plaquetas citrato (c-PRP)

NOTA: Todas as amostras de sangue foram de voluntários que participaram desta pesquisa. Nenhum dos participantes tinha uma anormalidade plaquetária ou distúrbio de coagulação previamente conhecido, e eles não haviam tomado nenhum medicamento plaquetário, incluindo anti-inflamatórios não esteróides (AINEs), nas duas semanas que antecederam a coleta da amostra. Um flebotomista licenciado realizou uma coleta de sangue usando uma agulha de 21 G para tubos padrão de citrato a 3,2%. O primeiro 1 mL foi descartado para evitar contaminação do fator tecidual. As amostras foram transportadas em um recipiente de poliestireno e todas as medidas foram realizadas dentro de 6 h após a coleta de sangue.

1. Centrifugue a amostra de sangue total a 200 x g por 10 min a 20 ° C para obter c-PRP.
2. Transfira o c-PRP para um recipiente estéril e conduza a contagem de plaquetas. Para estudos de inibidores, incube o c-PRP com uma concentração predefinida do medicamento no tampão de Tyrode (consulte a seção Resultados para obter detalhes).

5. Ensaio funcional de plaquetas

NOTA: O esquema para o ensaio funcional de plaquetas apresentado é mostrado na Figura 3.

1. Monte o T- e o B-MCC nos acessórios impressos em 3D.
2. Meça a medição da capacitância da linha de base por 5 min e, em seguida, adicione 45 μL de c-PRP ao poço da amostra no T-MCC.
3. Aguarde 30 minutos para que as plaquetas adiram ao eletrodo revestido com Fn no T-MCC.
4. Remova 30 μL do c-PRP com cuidado, sem tocar nas plaquetas presas à membrana, e reabasteça imediatamente com o tampão de Tyrode. Repita a lavagem pelo menos 5 vezes com um intervalo de 20 s para garantir que nenhuma plaqueta ou macroagregado adicional caia no eletrodo sensor após a ativação.
5. Adicione 10 μL da solução agonista (trombina ou ADP) na concentração desejada. Aguarde 80 minutos de tempo de equilíbrio.

6. Dados e análise estatística para os marcadores de sinal

NOTA: A capacitância é medida continuamente a partir das etapas 5.2-5.5.

1. Para o sinal de capacitância durante a fase de adesão (etapa 5.3), meça a mudança máxima na capacitância após o tempo de equilíbrio de 30 min, que é chamado de ΔC_adh.
2. Da mesma forma, para a fase de ativação (etapa 5.5), meça a mudança máxima na capacitância, que é chamada de _ato Δ C, e a inclinação da curva entre 200-300 s após a ativação, que é chamada de _ato S.
3. Use a análise de variância (ANOVA) com o post-hoc de Tukey para comparar os resultados entre os grupos. Use a qualidade de ajuste de Shapiro-Wilk para análise de distribuição normal.

Resultados

Este estudo tem como objetivo realizar uma avaliação dinâmica da função plaquetária. Seguindo o protocolo descrito acima, a solução de c-PRP foi preparada e as plaquetas foram semeadas no eletrodo revestido com Fn em T-MCC. As plaquetas flutuantes foram lavadas pela etapa de lavagem e um agonista foi adicionado para ativar as plaquetas aderidas. Resultados detalhados e discussão podem ser encontrados em nosso relatório anterior²⁸.

Discussão

Este estudo foi pioneiro em um novo método baseado em capacitância para avaliar a função plaquetária, que avalia a adesão e a dinâmica plaquetária pós-ativação em um único dispositivo, marcando o primeiro exemplo relatado de tal abordagem. O novo protocolo experimental introduz uma técnica relativamente simples para neutralizar os impactos da formação de fibrina e dos fatores de coagulação plasmática por meio de um procedimento de wash-out. Isso resulta em medições ca...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
1-Dodecanethiol	Sigma-Aldrich, MO, U.S.A	471364-100ML	1 mM
200-proof ethanol	Sigma-Aldrich, MO, U.S.A	EX0276-1
3D printer	Shenzhen Creality 3D Technology Co, Ltd.	Ender-3 V3
3D printing material	HATCHBOX 3D, CA, U.S.A	3D PLA-1KG-1.75
Adenosine 5′-diphosphate	Sigma Aldrich, U.S.A	01905-250MG-F	ADP
Aspirin	Sigma-Aldrich, MO, U.S.A	A2093-100G
Deep Reactive Ion Etching	Omega Engineering, Inc.	SPTS Rapier DRIE
Dimethyl Sulfoxide	Sigma-Aldrich, MO, U.S.A	D8418-50ML	DMSO
High Vacuum Deposition Systems	CHA	SEC-600
Human Fibronectin	Sigma-Aldrich, MO, U.S.A	CLS356008-1EA	Fn
KOH	Sigma-Aldrich, MO, U.S.A	P1767-250G
LCR meter	Keithley Instruments, Inc., OH, U.S.A	Keithley EL 4980AL
LCR meter holders	Signatone Corporation, CA, U.S.A	SCA-50-4
Mask Aligner System	ABM, U.S.A, Inc.	ABM/6/350/NUV/DCCD/SA
Micro-positioners	Signatone, CA, U.S.A	S-725
needle probe	Signatone Corporation, CA, U.S.A	SCAT5T-4	12.5 μm radius
Phosphate Buffered Saline	Sigma-Aldrich, MO, U.S.A	P4474-1L	PBS, pH 7.4
Reactive Ion Etching	Plasma-Therm,U.S.A	RIE Vision 320
silicon substrate	Wafer World Inc	SKU# 1766
Standard 3.2% citrate tubes	Tiger Medical, NJ, U.S.A.	Covidien / Cardinal Health 8881340478 Monoject
Thrombin	Enzyme Research Laboratories, U.S.A	HT 1002a
Ticagrelor	Sigma-Aldrich, MO, U.S.A	PHR2788-400MG
Tyrode’s buffer	Boston Bioproducts, U.S.A	BSS-375
UV photoresist	AZ electronic materials, NC, U.S.A.	AZ 9260	15um