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  • Resumen
  • Resumen
  • Introducción
  • Protocolo
  • Resultados Representativos
  • Discusión
  • Divulgaciones
  • Agradecimientos
  • Materiales
  • Referencias
  • Reimpresiones y Permisos

Resumen

La biología del tejido adiposo intermuscular (IMAT) está en gran parte inexplorada debido a la limitada accesibilidad del tejido humano. Aquí, presentamos un protocolo detallado para el aislamiento de núcleos y la preparación de bibliotecas de IMAT humano congelado para la secuenciación de ARN de núcleos individuales para identificar la composición celular de este depósito adiposo único.

Resumen

El tejido adiposo intermuscular (IMAT) es un depósito adiposo relativamente poco estudiado situado entre las fibras musculares. El contenido de IMAT aumenta con la edad y el IMC y se asocia con enfermedades metabólicas y degenerativas musculares; sin embargo, la comprensión de las propiedades biológicas de IMAT y su interacción con las fibras musculares circundantes es muy deficiente. En los últimos años, la secuenciación de ARN de una sola célula y de núcleos nos ha proporcionado atlas específicos del tipo de célula de varios tejidos humanos. Sin embargo, la composición celular del IMAT humano sigue siendo en gran medida inexplorada debido a los desafíos inherentes a su accesibilidad a partir de la recolección de biopsias en humanos. Además de la cantidad limitada de tejido recolectado, el procesamiento del IMAT humano es complicado debido a su proximidad al tejido muscular esquelético y la fascia. La naturaleza cargada de lípidos de los adipocitos lo hace incompatible con el aislamiento de una sola célula. Por lo tanto, la secuenciación de ARN de un solo núcleo es óptima para obtener transcriptómica de alta dimensión con resolución de una sola célula y proporciona el potencial de descubrir la biología de este depósito, incluida la composición celular exacta de IMAT. Aquí, presentamos un protocolo detallado para el aislamiento de núcleos y la preparación de bibliotecas de IMAT humano congelado para la secuenciación de ARN de núcleos individuales. Este protocolo permite el perfil de miles de núcleos utilizando un enfoque basado en gotas, lo que proporciona la capacidad de detectar tipos de células raras y poco abundantes.

Introducción

El tejido adiposo intermuscular (IMAT) es un depósito adiposo ectópico que reside entre y alrededor de las fibras musculares1. Como se describe en detalle en una revisión reciente de Goodpaster et al., la IMAT se puede detectar mediante tomografía computarizada (TC) de alta resolución y resonancia magnética (RMN) (Figura 1A, B) y se encuentra alrededor y dentro de las fibras musculares en todo el cuerpo1. La cantidad de IMAT varía mucho entre individuos y está influenciada por el IMC, la edad, el sexo, la raza y el sedentarismo 2,3,4

Protocolo

La muestra utilizada para este protocolo formó parte del Estudio de Músculo, Movilidad y Envejecimiento (SOMMA)15, que fue aprobado por el Western IRB-Copernicus Group (WCG) Institutional Review Board y se llevó a cabo de acuerdo con la Declaración de Helsinki. Los participantes dieron su consentimiento informado por escrito para su participación en el estudio.

NOTA: Este protocolo es una adaptación de un protocolo anterior utilizando 100 mg de tejido adiposo subcutáneo abdominal humano en una plataforma basada en nanopocillos16. El protocolo actual está optimizado para 50 mg de IMA....

Resultados Representativos

Este flujo de trabajo fue diseñado para guiar el procesamiento de muestras humanas IMAT congeladas para obtener perfiles de expresión génica con una resolución de un solo núcleo, lo que permite la identificación del tipo de célula. Aquí se presenta una muestra representativa de IMAT de un participante en el estudio SOMMA.

El primer paso de cualquier análisis de los datos de snRNA-seq es evaluar la calidad de los datos para identificar los núcleos de mala calidad, que potencialmente d.......

Discusión

Hay varios desafíos inherentes a trabajar con IMAT. Además de su limitada accesibilidad, la producción de material de muestra suele ser muy escasa y la "contaminación" del músculo esquelético es casi imposible de evitar. Para obtener una muestra de la mejor calidad, se debe penetrar en la fascia muscular al insertar la aguja de biopsia (para asegurarse de que no se recolecta tejido adiposo subcutáneo) y eliminar la mayor cantidad posible de tejido muscular mediante la disección de la muestra bajo un microscopio i.......

Divulgaciones

Los autores no tienen nada que revelar.

Agradecimientos

Los autores desean agradecer a Bryan Bergman, PhD de la Universidad de Colorado, por proporcionar la imagen de la biopsia IMAT en la Figura 1C del estudio MoTrIMAT (R01AG077956). Agradecemos que el Estudio de la Musculatría, la Movilidad y el Envejecimiento haya facilitado la muestra IMAT de la que se muestran los datos en el apartado de resultados representativos. El Instituto Nacional sobre el Envejecimiento (NIA, por sus siglas en inglés) financió el Estudio del Músculo, la Movilidad y el Envejecimiento (SOMMA; R01AG059416) y sus estudios auxiliares SOMMA AT (R01AG066474) y SOMMA Knee OA (R01AG070647). El apoyo a la infraestructura del estudio fue financiado en par....

Materiales

NameCompanyCatalog NumberComments
0.2 µm corning syringe filters Millipore SigmaCLS431229
1.7 mL DNA LoBind tubesEppendorf22431021low-bind tubes
10% Tween 20Bio-Rad1662404
100x protease inhibitorThermo Fisher Scientific78437
10X Magnetic Separator10X Genomics230003
10X Vortex Adapter10X Genomics330002
15 mL canonical tubesSarstedt6,25,54,502
2100 Bioanalyzer AgilentG2939BA
50 mL conical tubesSarstedt6,25,47,254
CellRangerGenomicsN/A
Chromium iX accesory kit10X GenomicsPN1000323
Chromium iX Controller10X GenomicsPN1000326
Chromium Next GEM Chip G Single Cell Kit 10X GenomicsPN1000127
Chromium Next GEM Single Cell 3'  Kit v 3.110X GenomicsPN1000269
Chromium Next GEM Single Cell 3' Gel Bead Kit v3.1 10X GenomicsPN1000129
Chromium Next GEM Single Cell GEM Kit v3.110X GenomicsPN1000130
Countess 3 Automated Cell CounterThermo Fisher ScientificAMQAX2000Automated cell counter
Countess cell counting chamber slidesThermo Fisher ScientificC10228
DoubletFinderR N/A
DPBS (no calcium, no magnesium)Thermo Fisher Scientific14190144
DTTThermo Fisher ScientificR0861
Dual Index Kit TT Set A, 96 rxns10X GenomicsPN1000215
Dynabeads MyOne SILANE 10X GenomicsPN2000048
Falcon 100 µm Cell strainerCorning Life Science352360
Falcon 40 µm Cell strainerCorning Life Science352340
Glycerin (glycerol), 50% (v/v) Aqueous SolutionRicca Chemical Company3290-32
KCLThermo Fisher ScientificAM9640G
Library Construction Kit v3.110X GenomicsPN1000196
MACS SmartStrainers (30µm)Miltenyi Biotec130-098-458
Mastercycler Nexus Gradient Thermal cyclerEppendorf6331000017
MgCl2AmbionAM9530G
Mortar and pestelHealth care logistics 14075
NucBlue Live Ready Probes ReagentThermo Fisher ScientificR37605
Nuclease Free Water (not DEPC treated)Thermo Fisher ScientificAM9930
Probumin Bovine Serum Albumin Fatty Acid Free, PowderSigma-Aldrich820024
Qiagen Buffer EBQiagen19086
Ribolock RNAse inhibitorThermo Fisher ScientificEO0382
SeuratR N/A
SucroseSigma-AldrichS0389
SUPERasin 20 U/µLThermo Fisher ScientificAM2695
ThermoMixer CEppendorf 5382000015
Tissue homogenizerGlass-Col099C K54
Tris buffer pH 8.0Thermo Fisher ScientificAM9855G
Triton X-100Thermo Fisher ScientificAC327372500
UltraPure 0.5M EDTA pH 8.0Gibco15575020

Referencias

  1. Goodpaster, B. H., Bergman, B. C., Brennan, A. M., Sparks, L. M. Intermuscular adipose tissue in metabolic disease. Nat Rev Endocrinol. 19 (5), 285-298 (2023).
  2. Sparks, L. M., Goodpaster, B. H., Bergman, B. C.

Reimpresiones y Permisos

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Palabras clave Tejido adiposo intermuscular IMATsecuenciaci n de ARN de n cleo nicoadipocitom sculo esquel ticocomposici n de tejidosaccesibilidad de tejidoscarga de l pidosaislamiento de n cleostejido congeladosecuenciaci n basada en gotasan lisis espec fico de tipo celular

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