ヒト筋肉間脂肪組織からの核の単離と下流の単一核RNAシーケンシング

要約

筋肉間脂肪組織(IMAT)の生物学は、ヒト組織のアクセス性が限られているため、ほとんど未踏です。ここでは、このユニークな脂肪貯蔵庫の細胞組成を特定するための単一核RNAシーケンシングのための凍結ヒトIMATの核単離とライブラリ調製のための詳細なプロトコルを紹介します。

要約

筋肉間脂肪組織(IMAT)は、筋繊維の間に位置する比較的研究されていない脂肪貯蔵庫です。IMAT含有量は、年齢とBMIとともに増加し、代謝性疾患および筋肉変性疾患に関連しています。しかし、IMATの生物学的特性と周囲の筋線維との相互作用についての理解は著しく不足しています。近年、シングルセルおよび核RNAシーケンシングにより、いくつかのヒト組織の細胞タイプ特異的なアトラスが得られました。しかし、ヒトIMATの細胞組成は、ヒトの生検収集からのアクセス可能性に固有の課題のために、ほとんど調査されていないままです。ヒトIMATは、採取される組織の量が限られていることに加え、骨格筋組織や筋膜に近いため、処理が複雑になります。脂肪細胞の脂質を多く含む性質により、脂肪細胞は単一細胞の単離と互換性がありません。したがって、単一核RNAシーケンシングは、単一細胞分解能で高次元トランスクリプトミクスを得るのに最適であり、IMATの正確な細胞組成を含むこのデポの生物学を明らかにする可能性を提供します。ここでは、単一核RNAシーケンシングのための凍結ヒトIMATの核単離とライブラリ調製のための詳細なプロトコルを紹介します。このプロトコルでは、液滴ベースのアプローチを使用して数千の核をプロファイリングできるため、希少で存在量が少ない細胞タイプを検出する能力が得られます。

概要

筋肉間脂肪組織(IMAT)は、筋線維¹の間および周囲に存在する異所性脂肪貯蔵庫です。Goodpasterらによる最近のレビューで詳細に説明されているように、IMATは、高解像度のコンピュータ断層撮影法(CT)および磁気共鳴画像法(MRI)(図1A、B)を使用して検出でき、全身の筋線維の周囲および内部に見られます¹。IMATの量は個人によって大きく異なり、BMI、年齢、性別、人種、座りがちな状況に影響されます^2,3,4。さらに、IMAT沈着は、^筋肉の変性5に関連する病的状態によく見られ、多くの研究で、肥満、2型糖尿病、メタボリックシンドローム、およびインス^{リン抵抗性6,7,8,9}の個人におけるIMAT量の増加が記録されています。それにもかかわらず、IMATの細胞....

プロトコル

このプロトコルに使用されたサンプルは、Western IRB-Copernicus Group(WCG)の治験審査委員会によって承認され^、ヘルシンキ宣言に従って実施されたStudy of Muscle Mobility, and Aging(SOMMA)¹⁵の一部でした。参加者は、研究への参加について書面によるインフォームドコンセントを提供しました。

注:このプロトコルは、ナノウェルベースのプラットフォーム¹⁶上で100mgのヒト腹部皮下脂肪組織を使用した以前のプロトコルから適応されています。現在のプロトコールは、50 mgのヒトIMATおよび液滴ベースのプラットフォームを使用したライブラリ調製に最適化されています。非ヒトIMATまたは他の脂肪デポーからの核単離のためのこのプロトコルのさらなる最適化が必要となる場合があります。

1. バッファーと試薬の調製(表1、表2)

注:実験当日にバッファーを新たに調製し、再利用しないでください。

1. 遠心分離機を4°Cに予冷します。
2. 均質化バッファーと核分離培地を調製します。
   1. 氷のバケツ2つを用意し、2 x 15 mLコニカルチ....

結果

このワークフローは、凍結ヒトIMATサンプルの処理をガイドして、単一核の分解能で遺伝子発現プロファイルを取得し、細胞タイプの同定を可能にするように設計されています。ここでは、SOMMA試験の参加者から代表的なIMATサンプルを1つ紹介します。

snRNA-seqデータの解析の最初のステップは、データの品質を評価して、データセットから削除する必要がある可能性のある.......

ディスカッション

IMATとの連携には、いくつかの固有の課題があります。その限られたアクセス性に加えて、サンプル材料の収量は非常に少ないことが多く、骨格筋の「汚染」を避けることはほとんど不可能です。最高品質のサンプルを得るためには、生検針を挿入する際に筋筋膜を貫通し(皮下脂肪組織を採取しないようにするため)、採取後すぐに顕微鏡でサンプルを解剖してできるだけ多くの筋肉組織を切?.......

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.2 µm corning syringe filters	Millipore Sigma	CLS431229
1.7 mL DNA LoBind tubes	Eppendorf	22431021	low-bind tubes
10% Tween 20	Bio-Rad	1662404
100x protease inhibitor	Thermo Fisher Scientific	78437
10X Magnetic Separator	10X Genomics	230003
10X Vortex Adapter	10X Genomics	330002
15 mL canonical tubes	Sarstedt	6,25,54,502
2100 Bioanalyzer	Agilent	G2939BA
50 mL conical tubes	Sarstedt	6,25,47,254
CellRanger	Genomics	N/A
Chromium iX accesory kit	10X Genomics	PN1000323
Chromium iX Controller	10X Genomics	PN1000326
Chromium Next GEM Chip G Single Cell Kit	10X Genomics	PN1000127
Chromium Next GEM Single Cell 3'  Kit v 3.1	10X Genomics	PN1000269
Chromium Next GEM Single Cell 3' Gel Bead Kit v3.1	10X Genomics	PN1000129
Chromium Next GEM Single Cell GEM Kit v3.1	10X Genomics	PN1000130
Countess 3 Automated Cell Counter	Thermo Fisher Scientific	AMQAX2000	Automated cell counter
Countess cell counting chamber slides	Thermo Fisher Scientific	C10228
DoubletFinder	R	N/A
DPBS (no calcium, no magnesium)	Thermo Fisher Scientific	14190144
DTT	Thermo Fisher Scientific	R0861
Dual Index Kit TT Set A, 96 rxns	10X Genomics	PN1000215
Dynabeads MyOne SILANE	10X Genomics	PN2000048
Falcon 100 µm Cell strainer	Corning Life Science	352360
Falcon 40 µm Cell strainer	Corning Life Science	352340
Glycerin (glycerol), 50% (v/v) Aqueous Solution	Ricca Chemical Company	3290-32
KCL	Thermo Fisher Scientific	AM9640G
Library Construction Kit v3.1	10X Genomics	PN1000196
MACS SmartStrainers (30µm)	Miltenyi Biotec	130-098-458
Mastercycler Nexus Gradient Thermal cycler	Eppendorf	6331000017
MgCl2	Ambion	AM9530G
Mortar and pestel	Health care logistics	14075
NucBlue Live Ready Probes Reagent	Thermo Fisher Scientific	R37605
Nuclease Free Water (not DEPC treated)	Thermo Fisher Scientific	AM9930
Probumin Bovine Serum Albumin Fatty Acid Free, Powder	Sigma-Aldrich	820024
Qiagen Buffer EB	Qiagen	19086
Ribolock RNAse inhibitor	Thermo Fisher Scientific	EO0382
Seurat	R	N/A
Sucrose	Sigma-Aldrich	S0389
SUPERasin 20 U/µL	Thermo Fisher Scientific	AM2695
ThermoMixer C	Eppendorf	5382000015
Tissue homogenizer	Glass-Col	099C K54
Tris buffer pH 8.0	Thermo Fisher Scientific	AM9855G
Triton X-100	Thermo Fisher Scientific	AC327372500
UltraPure 0.5M EDTA pH 8.0	Gibco	15575020