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Method Article
La biologie du tissu adipeux intermusculaire (IMAT) est largement inexplorée en raison de l’accessibilité limitée des tissus humains. Ici, nous présentons un protocole détaillé pour l’isolement des noyaux et la préparation de banques d’IMAT humain congelé pour le séquençage de l’ARN à noyaux uniques afin d’identifier la composition cellulaire de ce dépôt adipeux unique.
Le tissu adipeux intermusculaire (IMAT) est un dépôt adipeux relativement peu étudié situé entre les fibres musculaires. La teneur en IMAT augmente avec l’âge et l’IMC et est associée à des maladies dégénératives métaboliques et musculaires ; cependant, une compréhension des propriétés biologiques de l’IMAT et de son interaction avec les fibres musculaires environnantes fait cruellement défaut. Ces dernières années, le séquençage de l’ARN unicellulaire et nucléimétrique nous a fourni des atlas spécifiques au type cellulaire de plusieurs tissus humains. Cependant, la composition cellulaire de l’IMAT humaine reste largement inexplorée en raison des défis inhérents à son accessibilité à partir de la collecte de biopsies chez l’homme. En plus de la quantité limitée de tissus collectés, le traitement de l’IMAT humain est compliqué en raison de sa proximité avec les tissus musculaires squelettiques et les fascias. La nature chargée en lipides des adipocytes le rend incompatible avec l’isolement unicellulaire. Par conséquent, le séquençage de l’ARN à noyaux uniques est optimal pour obtenir une transcriptomique de haute dimension à une résolution cellulaire unique et offre le potentiel de découvrir la biologie de ce dépôt, y compris la composition cellulaire exacte de l’IMAT. Ici, nous présentons un protocole détaillé pour l’isolement des noyaux et la préparation de banques d’IMAT humain congelé pour le séquençage de l’ARN à noyaux uniques. Ce protocole permet le profilage de milliers de noyaux à l’aide d’une approche basée sur les gouttelettes, offrant ainsi la capacité de détecter des types de cellules rares et peu abondantes.
Le tissu adipeux intermusculaire (IMAT) est un dépôt adipeux ectopique résidant entre et autour des fibres musculaires1. Comme décrit en détail dans une étude récente de Goodpaster et al., l’IMAT peut être détecté à l’aide de la tomodensitométrie (TDM) à haute résolution et de l’imagerie par résonance magnétique (IRM) (Figure 1A, B) et se trouve autour et dans les fibres musculaires de tout le corps1. La quantité d’IMAT varie considérablement d’un individu à l’autre et est influencée par l’IMC, l’âge, le sexe, la raceet la sédentarité2,3,4. De plus, le dépôt d’IMAT est couramment observé dans les conditions pathologiques associées à la dégénérescence musculaire5, et de nombreuses études ont documenté une augmentation de la masse IMAT chez les personnes atteintes d’obésité, de diabète de type 2, de syndrome métabolique et de résistance à l’insuline 6,7,8,9. Néanmoins, les propriétés cellulaires et biologiques de l’IMAT commencent à peine à être démêlées. L’accessibilité limitée et la variation des emplacements et du contenu de l’IMAT dans l’ensemble du corps ont rendu difficile la collecte d’échantillons de ce dépôt adipeux2 unique. De plus, les échantillons sont facilement « contaminés » par les muscles squelettiques (SM) lors de la collecte, ce qui rend difficile la séparation entre la contribution biologique des différents tissus (Figure 1C). À cette fin, le séquençage de l’ARN à noyau unique (snRNA-seq), qui a fait l’objet d’une attention considérable au cours de la dernière décennie, constitue une méthodologie idéale pour permettre la séparation des modèles d’expression génique dérivés de l’IMAT et du SM avec une résolution unicellulaire. De plus, l’isolement des noyaux est particulièrement utile pour le tissu adipeux en raison des grands adipocytes chargés de lipides, qui sont impossibles à dissocier en suspension unicellulaire sans compromettre l’intégrité des cellules. Enfin, cette technologie a le potentiel de découvrir de nouveaux marqueurs d’adipocytes spécifiques d’IMAT et de découvrir la composition et la présence de différentes populations de cellules progénitrices, ainsi que d’étudier la variation de la composition cellulaire dans des conditions pathologiques et normales.
Figure 1 : Images de l’IMAT. Image représentative par résonance magnétique (IRM) de l’IMAT provenant (A) d’une femme maigre d’âge moyen et (B) d’un homme d’âge moyen obèse. Rouge : tissu adipeux sous-cutané, jaune : tissu adipeux intermusculaire, vert : muscle squelettique, bleu : os. Image reproduite avec l’aimable autorisation de Heather Cornnell, Institut de recherche translationnelle AdventHealth. (C) Échantillon de tissu frais avec IMAT (entouré d’une ligne noire pointillée). Image reproduite avec l’aimable autorisation de Meghan Hopf, AdventHealth Translational Research Institute et Bryan Bergman, Université du Colorado. Cette figure a été modifiée avec la permission de Goodpaster et al.1. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Un certain nombre d’études ont été publiées dans l’industrie de l’élevage portant sur le persillage de la viande (IMAT en particulier) chez les porcs, les poulets et les bovins à l’aide de cellules uniques (sc) et de snRNA-seq10. Ces études ont permis d’identifier plusieurs sous-populations d’adipocytes et de marqueurs de cellules progénitrices potentielles d’IMAT 11,12,13 ; cependant, on ne sait pas si ces compositions cellulaires se traduisent par de l’IMAT humain. À notre connaissance, une seule étude s’est penchée sur l’hétérogénéité cellulaire du muscle humain avec infiltration graisseuse, obtenue chez des patients masculins atteints d’arthrose de la hanche, à l’aide du snRNA-seq14. Les chercheurs ont signalé une petite population d’adipocytes et plusieurs sous-populations de progéniteurs fibro-adipogéniques (PAF) au sein de la grande population de myonoyaux14. Notre étude est la première à développer une méthode pour interroger directement l’IMAT disséqué manuellement du muscle humain pour la composition cellulaire à l’aide du snRNA-seq.
Il est important de noter que les protocoles de séquençage de l’ARNsn doivent être personnalisés pour le tissu spécifique étudié, car la quantité de tissu disponible et les propriétés physiques du tissu spécifique dicteront les étapes de traitement optimales. Le rendement tissulaire pour l’IMAT est généralement faible, ne dépassant souvent pas 50 mg, même lors de la réalisation de biopsies guidées par échographie. Par conséquent, un traitement approprié de ce tissu rare est essentiel. Nous pensons que ce protocole constituera une ressource précieuse pour les chercheurs qui étudient l’IMAT humain.
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L’échantillon utilisé pour ce protocole faisait partie de l’étude SOMMA)15, qui a été approuvée par le comité d’examen institutionnel de l’IRB-Copernicus Group (WCG) de l’Ouest et a été réalisée conformément à la Déclaration d’Helsinki. Les participants ont fourni un consentement éclairé écrit pour leur participation à l’étude.
REMARQUE : Ce protocole est adapté d’un protocole précédent utilisant 100 mg de tissu adipeux sous-cutané abdominal humain sur une plateforme basée sur des nanopuits16. Le protocole actuel est optimisé pour 50 mg d’IMAT humain et la préparation de banques à l’aide d’une plate-forme basée sur des gouttelettes. Une optimisation supplémentaire de ce protocole pour l’isolement des noyaux à partir d’IMAT non humains ou d’autres dépôts adipeux pourrait être nécessaire.
1. Préparation des tampons et des réactifs (Tableau 1 et Tableau 2)
REMARQUE : Préparez des tampons frais le jour de l’expérience et ne les réutilisez pas.
Réactif | Volume (μL) | Concentration finale (mM) | |
1x | 2 fois | ||
1 M MgCl2 | 10 | 20 | 5 |
Tampon Tris de 1 m, pH 8,0 | 20 | 40 | 10 |
2 M KCl | 25 | 50 | 25 |
1,5 M de saccharose (-4°C) | 334 | 668 | 250 |
1mM TNT | 2 | 4 | 0,001 (~1 μM) |
100x inhibiteur de protéase | 20 | 40 | 1x |
Superasine 20 U/μL | 40 | 80 | 0,4 U/μL |
Eau sans nucléases | 1549 | 3098 | - |
Total Volume | 2000 | 4000 | - |
Tableau 1 : Tampon d’homogénéisation (HB). Restez sur la glace. Mélanger par vortex.
Réactif | Volume (μL) | Concentration finale (mM) | |
1x | 2 fois | ||
EDTA | 0.4 | 0.8 | 0.1 |
Inhibiteur de l’ARNase Ribolock (40U/μL) | 40 | 80 | 0,8 U/μL |
1 % BSA-PBS (-/-) | 1959.6 | 3919.2 | - |
Total Volume | 2000 | 4000 | - |
Tableau 2 : Milieu d’isolement des noyaux (NIM). Restez sur la glace. Mélanger par vortex.
2. Pulvérisation de tissus congelés (figure 2A)
3. Homogénéisation des tissus pulvérisés
4. Isolement et nettoyage des noyaux (figure 2B)
5. Coloration et comptage des noyaux (Figure 2C et Figure 3)
REMARQUE : Pour faciliter le comptage, mettez en place un protocole de « comptage des noyaux » sur un compteur de cellules automatisé, car le réglage du champ clair et des canaux DAPI peut affecter considérablement le comptage. Ajustez les canaux de manière à ce que seuls les noyaux et non les débris soient capturés. Assurez-vous que le canal de fond clair ne marque que les « objets » qui ont également une coloration DAPI.
Figure 3 : Coloration de noyaux isolés. Image du compteur cellulaire de noyaux colorés avec NucBlue/DAPI (image de gauche) et l’image en fond clair correspondante (image de droite). La présence de petites quantités de débris est évidente dans l’image en champ clair. Le compteur de cellules automatisé utilisé ici n’a pas d’option pour inclure des barres d’échelle. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
6. Paramètres de préparation et de séquençage de la bibliothèque
Figure 2 : flux de travail du protocole. Illustration schématique du flux de travail dans (A) les étapes 2 et 3, (B) l’étape 4 et (C) l’étape 5 du protocole. La figure a été créée avec BioRender.com. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
7. Traitement et analyse des données
REMARQUE : Dans ce protocole, certains des logiciels et progiciels R recommandés utilisés pour traiter les données de séquençage résultantes sont brièvement présentés, en se concentrant sur les étapes après le prétraitement initial (Tableau 3). Cette étude fournit des mesures générales de contrôle de la qualité (CQ) et un exemple d’approximation et de projection de variétés uniformes (UMAP) à la figure 4. Cependant, une description approfondie de l’analyse bioinformatique n’entre pas dans le cadre de ce protocole. Par conséquent, les lecteurs peuvent se référer à la récente revue sur les meilleures pratiques pour l’analyse de cellules uniques par Heumos et al.18.
Progiciels/progiciels R utilisés dans le flux de données | Logiciels/progiciels alternatifs | Étape de traitement |
CellRanger | STARsolo, kallisto | Découpage, alignement, mappage |
Seurat | SingleCellExperiment, Cellranger | QC, analyse et exploration de données |
DoubletFinder | scds, scdblFinder, Scrublet | Détection de doublet |
DecontX | SoupX, CellBender | Ajustement de l’ARN ambiant |
Tableau 3 : Logiciels/outils pour le flux de données
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Ce flux de travail a été conçu pour guider le traitement d’échantillons IMAT humains congelés afin d’obtenir des profils d’expression génique à une résolution de noyau unique, permettant ainsi l’identification du type de cellule. Ici, un échantillon représentatif de l’IMAT provenant d’un participant à l’étude SOMMA est présenté.
La première étape de toute analyse de données de séquençage de l’ARNsn consiste à évaluer la qualité des données afin d’identi...
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Travailler avec IMAT présente plusieurs défis inhérents. En plus de son accessibilité limitée, le rendement des échantillons est souvent très rare et la « contamination » des muscles squelettiques est presque impossible à éviter. Pour obtenir un échantillon de la meilleure qualité, il faut pénétrer dans le fascia musculaire lors de l’insertion de l’aiguille de biopsie (pour s’assurer de ne pas prélever de tissu adipeux sous-cutané) et retirer autant de tissu musculaire que possible en disséquant l...
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Les auteurs n’ont rien à divulguer.
Les auteurs tiennent à remercier Bryan Bergman, PhD, à l’Université du Colorado, pour avoir fourni l’image de la biopsie IMAT dans la figure 1C de l’étude MoTrIMAT (R01AG077956). Nous sommes reconnaissants à l’Étude sur le muscle, la mobilité et le vieillissement d’avoir fourni l’échantillon IMAT à partir duquel les données sont présentées dans la section des résultats représentatifs. Le National Institute on Aging (NIA) a financé l’étude sur le muscle, la mobilité et le vieillissement (SOMMA ; R01AG059416) et ses études annexes SOMMA AT (R01AG066474) et SOMMA Knee OA (R01AG070647). Le soutien de l’infrastructure de l’étude a été financé en partie par les centres Claude D. Pepper de l’ancienne indépendance américaine de l’Université de Pittsburgh (P30AG024827) et de l’Université de Wake Forest (P30AG021332) et les instituts de sciences cliniques et translationnelles, financés par le National Center for Advancing Translational Science, de l’Université de Wake Forest (UL1 0TR001420).
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Name | Company | Catalog Number | Comments |
0.2 µm corning syringe filters | Millipore Sigma | CLS431229 | |
1.7 mL DNA LoBind tubes | Eppendorf | 22431021 | low-bind tubes |
10% Tween 20 | Bio-Rad | 1662404 | |
100x protease inhibitor | Thermo Fisher Scientific | 78437 | |
10X Magnetic Separator | 10X Genomics | 230003 | |
10X Vortex Adapter | 10X Genomics | 330002 | |
15 mL canonical tubes | Sarstedt | 6,25,54,502 | |
2100 Bioanalyzer | Agilent | G2939BA | |
50 mL conical tubes | Sarstedt | 6,25,47,254 | |
CellRanger | Genomics | N/A | |
Chromium iX accesory kit | 10X Genomics | PN1000323 | |
Chromium iX Controller | 10X Genomics | PN1000326 | |
Chromium Next GEM Chip G Single Cell Kit | 10X Genomics | PN1000127 | |
Chromium Next GEM Single Cell 3' Gel Bead Kit v3.1 | 10X Genomics | PN1000129 | |
Chromium Next GEM Single Cell GEM Kit v3.1 | 10X Genomics | PN1000130 | |
Countess 3 Automated Cell Counter | Thermo Fisher Scientific | AMQAX2000 | Automated cell counter |
Countess cell counting chamber slides | Thermo Fisher Scientific | C10228 | |
DoubletFinder | R | N/A | |
DPBS (no calcium, no magnesium) | Thermo Fisher Scientific | 14190144 | |
DTT | Thermo Fisher Scientific | R0861 | |
Dual Index Kit TT Set A, 96 rxns | 10X Genomics | PN1000215 | |
Dynabeads MyOne SILANE | 10X Genomics | PN2000048 | |
Falcon 100 µm Cell strainer | Corning Life Science | 352360 | |
Falcon 40 µm Cell strainer | Corning Life Science | 352340 | |
Glycerin (glycerol), 50% (v/v) Aqueous Solution | Ricca Chemical Company | 3290-32 | |
KCL | Thermo Fisher Scientific | AM9640G | |
Library Construction Kit v3.1 | 10X Genomics | PN1000196 | |
MACS SmartStrainers (30µm) | Miltenyi Biotec | 130-098-458 | |
Mastercycler Nexus Gradient Thermal cycler | Eppendorf | 6331000017 | |
MgCl2 | Ambion | AM9530G | |
Mortar and pestel | Health care logistics | 14075 | |
NucBlue Live Ready Probes Reagent | Thermo Fisher Scientific | R37605 | |
Nuclease Free Water (not DEPC treated) | Thermo Fisher Scientific | AM9930 | |
Probumin Bovine Serum Albumin Fatty Acid Free, Powder | Sigma-Aldrich | 820024 | |
Qiagen Buffer EB | Qiagen | 19086 | |
Ribolock RNAse inhibitor | Thermo Fisher Scientific | EO0382 | |
Seurat | R | N/A | |
Sucrose | Sigma-Aldrich | S0389 | |
SUPERasin 20 U/µL | Thermo Fisher Scientific | AM2695 | |
ThermoMixer C | Eppendorf | 5382000015 | |
Tissue homogenizer | Glass-Col | 099C K54 | |
Tris buffer pH 8.0 | Thermo Fisher Scientific | AM9855G | |
Triton X-100 | Thermo Fisher Scientific | AC327372500 | |
UltraPure 0.5M EDTA pH 8.0 | Gibco | 15575020 |
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