Isolamento di nuclei dal tessuto adiposo intermuscolare umano e sequenziamento dell'RNA a singolo nucleo a valle

Riepilogo

La biologia del tessuto adiposo intermuscolare (IMAT) è in gran parte inesplorata a causa della limitata accessibilità del tessuto umano. Qui, presentiamo un protocollo dettagliato per l'isolamento dei nuclei e la preparazione della libreria di IMAT umano congelato per il sequenziamento di RNA a singoli nuclei per identificare la composizione cellulare di questo deposito adiposo unico.

Abstract

Il tessuto adiposo intermuscolare (IMAT) è un deposito adiposo relativamente poco studiato situato tra le fibre muscolari. Il contenuto di IMAT aumenta con l'età e l'IMC ed è associato a malattie metaboliche e muscolo-degenerative; tuttavia, una comprensione delle proprietà biologiche dell'IMAT e della sua interazione con le fibre muscolari circostanti è gravemente carente. Negli ultimi anni, il sequenziamento dell'RNA di singole cellule e nuclei ci ha fornito atlanti specifici per tipo di cellula di diversi tessuti umani. Tuttavia, la composizione cellulare dell'IMAT umano rimane in gran parte inesplorata a causa delle sfide intrinseche della sua accessibilità dalla raccolta della biopsia nell'uomo. Oltre alla quantità limitata di tessuto raccolto, l'elaborazione dell'IMAT umano è complicata a causa della sua vicinanza al tessuto muscolare scheletrico e alla fascia. La natura lipidica degli adipociti lo rende incompatibile con l'isolamento a singola cellula. Pertanto, il sequenziamento dell'RNA a singolo nucleo è ottimale per ottenere trascrittomica ad alta dimensionalità con risoluzione di singola cellula e fornisce il potenziale per scoprire la biologia di questo deposito, inclusa l'esatta composizione cellulare di IMAT. Qui, presentiamo un protocollo dettagliato per l'isolamento dei nuclei e la preparazione della libreria di IMAT umano congelato per il sequenziamento di RNA a singoli nuclei. Questo protocollo consente la profilazione di migliaia di nuclei utilizzando un approccio basato su goccioline, fornendo così la capacità di rilevare tipi di cellule rare e poco abbondanti.

Introduzione

Il tessuto adiposo intermuscolare (IMAT) è un deposito adiposo ectopico che risiede tra e intorno alle fibre muscolari¹. Come descritto in dettaglio in una recente revisione di Goodpaster et al., l'IMAT può essere rilevato utilizzando la tomografia computerizzata (TC) ad alta risoluzione e la risonanza magnetica (MRI) (Figura 1A, B) e si trova intorno e all'interno delle fibre muscolari in tutto il corpo¹. La quantità di IMAT varia notevolmente da individuo a individuo ed è influenzata da BMI, età, sesso, razza e sedentarietà ^2,3,4

Protocollo

Il campione utilizzato per questo protocollo faceva parte dello Studio sui muscoli, la mobilità e l'invecchiamento (SOMMA)^15, che è stato approvato dal Western IRB-Copernicus Group (WCG) Institutional Review Board ed è stato condotto in conformità con la Dichiarazione di Helsinki. I partecipanti hanno fornito il consenso informato scritto per la loro partecipazione allo studio.

NOTA : Questo protocollo è adattato da un protocollo precedente che utilizza 100 mg di tessuto adiposo sottocutaneo addominale umano su una piattaforma basata su nanopozzetti¹⁶. L'attuale protocollo è ottimiz....

Discussione

La collaborazione con IMAT presenta diverse sfide intrinseche. Oltre alla sua limitata accessibilità, la resa del materiale campione è spesso molto scarsa e la "contaminazione" del muscolo scheletrico è quasi impossibile da evitare. Per ottenere il campione della migliore qualità, è necessario penetrare la fascia muscolare quando si inserisce l'ago da biopsia (per assicurarsi di non raccogliere tessuto adiposo sottocutaneo) e rimuovere quanto più tessuto muscolare possibile sezionando il campione al microscopio sub.......

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.2 µm corning syringe filters	Millipore Sigma	CLS431229
1.7 mL DNA LoBind tubes	Eppendorf	22431021	low-bind tubes
10% Tween 20	Bio-Rad	1662404
100x protease inhibitor	Thermo Fisher Scientific	78437
10X Magnetic Separator	10X Genomics	230003
10X Vortex Adapter	10X Genomics	330002
15 mL canonical tubes	Sarstedt	6,25,54,502
2100 Bioanalyzer	Agilent	G2939BA
50 mL conical tubes	Sarstedt	6,25,47,254
CellRanger	Genomics	N/A
Chromium iX accesory kit	10X Genomics	PN1000323
Chromium iX Controller	10X Genomics	PN1000326
Chromium Next GEM Chip G Single Cell Kit	10X Genomics	PN1000127
Chromium Next GEM Single Cell 3'  Kit v 3.1	10X Genomics	PN1000269
Chromium Next GEM Single Cell 3' Gel Bead Kit v3.1	10X Genomics	PN1000129
Chromium Next GEM Single Cell GEM Kit v3.1	10X Genomics	PN1000130
Countess 3 Automated Cell Counter	Thermo Fisher Scientific	AMQAX2000	Automated cell counter
Countess cell counting chamber slides	Thermo Fisher Scientific	C10228
DoubletFinder	R	N/A
DPBS (no calcium, no magnesium)	Thermo Fisher Scientific	14190144
DTT	Thermo Fisher Scientific	R0861
Dual Index Kit TT Set A, 96 rxns	10X Genomics	PN1000215
Dynabeads MyOne SILANE	10X Genomics	PN2000048
Falcon 100 µm Cell strainer	Corning Life Science	352360
Falcon 40 µm Cell strainer	Corning Life Science	352340
Glycerin (glycerol), 50% (v/v) Aqueous Solution	Ricca Chemical Company	3290-32
KCL	Thermo Fisher Scientific	AM9640G
Library Construction Kit v3.1	10X Genomics	PN1000196
MACS SmartStrainers (30µm)	Miltenyi Biotec	130-098-458
Mastercycler Nexus Gradient Thermal cycler	Eppendorf	6331000017
MgCl2	Ambion	AM9530G
Mortar and pestel	Health care logistics	14075
NucBlue Live Ready Probes Reagent	Thermo Fisher Scientific	R37605
Nuclease Free Water (not DEPC treated)	Thermo Fisher Scientific	AM9930
Probumin Bovine Serum Albumin Fatty Acid Free, Powder	Sigma-Aldrich	820024
Qiagen Buffer EB	Qiagen	19086
Ribolock RNAse inhibitor	Thermo Fisher Scientific	EO0382
Seurat	R	N/A
Sucrose	Sigma-Aldrich	S0389
SUPERasin 20 U/µL	Thermo Fisher Scientific	AM2695
ThermoMixer C	Eppendorf	5382000015
Tissue homogenizer	Glass-Col	099C K54
Tris buffer pH 8.0	Thermo Fisher Scientific	AM9855G
Triton X-100	Thermo Fisher Scientific	AC327372500
UltraPure 0.5M EDTA pH 8.0	Gibco	15575020