Evaluación de la recuperación funcional de la actividad del diafragma eupneico después de la hemisección unilateral de la médula espinal cervical en ratas

Resumen

Las complicaciones respiratorias son la principal causa de muerte en individuos con lesión de la médula espinal cervical (SCI). Los modelos animales de cLME son esenciales para las evaluaciones mecánicas y los estudios preclínicos. Aquí, presentamos un método reproducible para evaluar la recuperación funcional de la actividad del músculo diafragma (DIAm) después de la hemisección espinal unilateral C₂ (C₂SH) en ratas.

Resumen

Después de la lesión de la médula espinal, la activación del DIAm puede verse afectada dependiendo de la extensión de la lesión. El presente manuscrito describe un modelo de hemisección_C2 unilateral (C₂SH) de SCI que interrumpe la actividad electromiográfica (EMG) del diafragma ipsilateral eupneico (iDIAm) durante la respiración en ratas. Para evaluar la recuperación del control motor DIAm, primero se debe establecer claramente el grado de déficit debido a C₂SH. Al verificar una pérdida inicial completa de iDIAm EMG durante la respiración, la recuperación posterior se puede clasificar como ausente o presente, y el grado de recuperación se puede estimar utilizando la amplitud de EMG. Además, al medir la ausencia continuada de actividad EMG de iDIAm durante la respiración después del período de shock espinal agudo después de_C2SH, se puede validar el éxito de la C₂SH inicial. La medición de la actividad EMG del diafragma contralateral (cDIAm) puede proporcionar información sobre los efectos compensatorios de C₂SH, que también refleja la neuroplasticidad. Además, los registros de DIAm EMG de animales despiertos pueden proporcionar información fisiológica vital sobre el control motor del DIAm después de C₂SH. Este artículo describe un método para un modelo de_C2SH riguroso, reproducible y fiable de cSCI en ratas, que es una excelente plataforma para estudiar la neuroplasticidad respiratoria, la actividad compensatoria de cDIAm y las estrategias terapéuticas y farmacéuticas.

Introducción

Hay más de 300,000 personas con lesión de la médula espinal (SCI) en los Estados Unidos, aproximadamente la mitad de las cuales^{tienen lesiones} cervicales. Estas lesiones resultan en una pérdida significativa de bienestar y ejercen una presión financiera sobre las personas, sus familias y el sistema de atención médica. Afortunadamente, la mayoría de las lesiones de la médula espinal son^incompletas, lo que ofrece la posibilidad de fortalecer las vías preservadas. Esta neuroplasticidad puede permitir la recuperación de al menos algunas funciones, incluida la actividad DIAm, que es importante para los comportamientos ventilatorios y no ventilatorios. Por lo tanto, la promoción de la neuroplasticidad es una vía prometedora de investigación para ayudar a las personas con LME².

Los modelos de LME en roedores tienen el potencial de contribuir sustancialmente al descubrimiento de tratamientos para mejorar la salud humana. Uno de los modelos clásicos de LM utilizados para estudiar la neuroplasticidad es la transección unilateral (hemisección) de la médula espinal en_C2 (C₂SH), que deja intacto el lado contralateral 3,4,5,6,7,8,9,10,11,12,13. El efecto de_C2SH sobre la producción frénica y la importancia de las vías contralaterales preservadas fue revelado por primera vez hace más de cien años por Porter¹², cuyo artículo seminal sentó las bases para los estudios modernos de la neuroplasticidad respiratoria. El modelo_C2SH interrumpe las entradas descendentes del grupo respiratorio ventral rostral (rVRG) en la médula, que contiene las neuronas premotoras responsables de transmitir la salida de la generación del ritmo respiratorio¹⁴. Estas neuronas premotoras rVRG también transmiten el impulso neuronal excitatorio a las neuronas motoras frénicas (Figura 1). Varios investigadores han adoptado diferentes enfoques para el modelo C₂SH 10,11,15,16, lo que puede explicar en parte parte la variabilidad en la recuperación entre los estudios. Brevemente, los abordajes varían en términos de preservar los funículos dorsales, realizar una hemisección completa o realizar una transección parcial lateral que no interrumpa completamente las entradas descendentes de la rVRG ipsilateral. En general, los modelos de C₂SH son particularmente útiles para estudiar la neuroplasticidad respiratoria debido a las tasas de recuperación espontánea de la actividad electromiográfica (EMG) eupneica iDIAm a lo largo del tiempo, que puede mejorarse mediante varios factores, incluida la señalización neurotrófica 17,18,19,20,21. Sin embargo, primero se debe establecer una pérdida inicial de la función, definida como el silenciamiento de la actividad EMG eupneica de iDIAm, antes de que la recuperación pueda clasificarse claramente. Esta validación de la inactividad en el momento de la C₂SH no se realiza en varios estudios ^{3,4,6,7,11,22,23}.

Las evaluaciones histológicas de la médula espinal extirpada solo proporcionan evidencia de daño en la ubicación apropiada de las vías bulboespinales excitadoras ipsilaterales que inervan las neuronas motoras frénicas en la médula espinal, pero la histología no sustituye la evidencia fisiológica (p. ej., DIAm EMG). Además, las evaluaciones histológicas se realizan ex vivo en puntosterminales (a menudo varias semanas o meses después de la lesión) y no proporcionan información "en tiempo real". Algunos investigadores han observado que la magnitud de la lesión se relaciona con la cantidad de déficit funcional o falta del mismo 5,24,25,26. Es importante tener en cuenta que la validez de tales afirmaciones probablemente depende en gran medida de cómo se clasifique la "función" (es decir, cuáles son las tareas funcionales y cómo se cuantifican), y la variabilidad entre los estudios pone de manifiesto la dificultad de producir lesiones funcionalmente idénticas en todos los animales. De hecho, los investigadores han enfatizado que la relación entre el grado de lesión y la función locomotora de los músculos de las extremidades (cuantificada por la puntuación de Basso, Beattie y Bresnahan (BBB)²⁴) no es lineal^27,28. En estudios previos, no hemos encontrado relación entre la extensión de la C₂SH y el grado de recuperación de la actividad EMG eupneica iDIAm después de la lesión 10,29,30,31, aunque otros investigadores han reportado una relación entre la función ventilatoria y el grado de preservación de la sustancia blanca ⁵. Por lo tanto, en el caso del modelo C₂SH, es beneficioso y necesario un enfoque para la validación funcional de la inactividad de iDIAm en el momento de la cirugía y, preferiblemente, en el curso temprano del curso del tiempo de los experimentos de lesión crónica de la médula espinal.

El presente artículo destaca el uso de DIAm EMG para la confirmación en tiempo real de la pérdida inicial de DIAm EMG durante la respiración después de la C₂SH, así como las evaluaciones confirmatorias posteriores a los 3 días (Día 3) después de la lesión 18,21,31,32,33. En trabajos anteriores con el modelo C₂SH, se realizaron laparotomías repetidas para registrar DIAm EMG 10,13,30,34. Sin embargo, trabajos más recientes han utilizado electrodos de EMG crónicos, que permiten el registro de EMG en ratas anestesiadas y despiertas. Además, los electrodos crónicos reducen el riesgo de neumotórax y no requieren laparotomías repetidas, lo que puede causar inhibición del DIAm^35,36. A pesar de que las versiones del modelo C₂SH han sido utilizadas por muchos investigadores, la confirmación del silenciamiento de la actividad de iDIAm no se realizó en el momento de la cirugía 3,4,6,7,11,22,23. Sin tal confirmación de la inactividad, es difícil saber qué parte de la recuperación posterior atribuir a la neuroplasticidad de las vías ipsilaterales frente a las contralaterales, que pueden tener impactos diferenciales. Esta es una consideración importante porque el impulso neuronal inspiratorio de la rVRG a las motoneuronas frénicas es principalmente ipsilateral, con una pérdida de aproximadamente el 50% de las entradas glutamatérgicas excitatorias a las neuronas motoras frénicas después de C₂SH³³. Sin embargo, quedan entradas excitadoras inspiratorias de la rVRG contralateral que decusan por debajo del sitio de la lesión para inervar las neuronas motoras frénicas ipsilaterales y pueden fortalecerse a través de la neuroplasticidad para promover la recuperación funcional. Al eliminar la entrada excitatoria ipsilateral predominante a las neuronas motoras frénicas, se pierde la actividad EMG eupneica iDIAm (al menos bajo anestesia), mientras que la actividad del cDIAm continúa e incluso se incrementa. La pérdida de la actividad EMG de iDIAm durante la respiración es, por lo tanto, una medida de un C₂SH exitoso (Figura 2).

Algún nivel de actividad de iDIAm EMG está presente tan pronto como 1-4 días después de C₂SH en animales despiertos^23,37. Además, en animales descerebrados, la actividad de iDIAm está presente minutos u horas después de la hemisección cervical superior y es suprimida por la anestesia³⁸. Además, el éxito del C₂SH se valida al confirmar la ausencia de actividad de iDIAm EMG durante la respiración (eupnea) en ratas anestesiadas el día 3 después de la lesión. Los estudios de imagen confocal confirmaron la pérdida de entradas sinápticas glutamatérgicas en las neuronas motoras frénicas durante esta etapa inicial de la lesión³⁷. En el día 3 después de la lesión, si hay alguna actividad eupneica residual de iDIAm EMG, esto se interpreta como evidencia de eliminación incompleta del impulso inspiratorio descendente ipsilateral de la rVRG. El presente artículo se divide en tres secciones: (1) registros crónicos de EMG DIAm, (2) C₂SH y (3) adquisición de datos de EMG en animales despiertos y anestesiados. Este protocolo describe un modelo de_C2SH riguroso, reproducible y fiable de cSCI en ratas, que es una excelente plataforma para estudiar la neuroplasticidad respiratoria, la actividad compensatoria de cDIAm y las estrategias terapéuticas y farmacéuticas.

Protocolo

Este protocolo fue aprobado por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales de Mayo Clinic (Número de protocolo: A00003105-17-R23). Los animales del presente estudio fueron una mezcla de ratas Sprague-Dawley macho y hembra de aproximadamente 3 meses de edad y con un peso de entre 200 g y 350 g. Los detalles de los reactivos y el equipo utilizado en el estudio se enumeran en la Tabla de Materiales.

1. Implantación de electrodos

1. Preparación de los electrodos
   1. Asegúrese de que el equipo mencionado esté disponible: (1) alambre de acero inoxidable multifilamento, (2) bisturí con hoja # 11, (3) tijeras, 4) microscopio de disección, (5) regla, (6) pinzas, (7) agujas de 25 g, (8) 2 alicates (al menos uno con zona de engarzado).
   2. Los detalles del proceso para fabricar electrodos se muestran en la Figura 3. Repita este proceso al menos dos veces para los electrodos de registro diferencial emparejados.
   3. Primero, mida y corte 18 cm del alambre de acero inoxidable.
   4. Haga un nudo simple básico a 4 cm de un extremo del alambre, como se muestra en la Figura 3; esto servirá como anclaje cuando el lado corto del alambre se implante y se suture en el DIAm.
   5. Con un bisturí y un endoscopio quirúrgico para disección, pele con cuidado 2 mm de aislamiento inmediatamente adyacente al nudo en el lado más corto del alambre. Tenga mucho cuidado de no cortar las hebras del alambre multihilado.
      NOTA: Esta parte no aislada sirve como superficie conductora del electrodo. Generalmente, la calidad de la señal comienza a degradarse si tres o más hebras se cortan inadvertidamente y, de ser así, se reemplaza el electrodo.
   6. A continuación, pegue ~ 5 mm del extremo del lado corto del alambre, que luego se inserta en el lumen de una aguja de 25 G para hacer una herramienta similar a un hilo de sutura que se utilizará para implantar el electrodo en el DIAm.
      NOTA: También se pueden usar agujas de calibre más alto (por ejemplo, hasta 28 G) según las preferencias personales. Debido al diámetro más delgado de las agujas de mayor calibre, el riesgo de neumotórax puede reducirse. Sin embargo, también puede ser más difícil insertar los cables multihebrados en el lumen más pequeño de la aguja.
   7. Para lograr esto, retire una aguja de 25 G de su empaque y, con ambos alicates, doble con cuidado la aguja a ~ 1 cm del extremo biselado afilado de lado a lado hasta que se rompa.
      NOTA: Este proceso no debe apresurarse; De lo contrario, las fuerzas de cizallamiento pueden hacer que el lumen de la aguja se cierre, lo que requiere que se repita el proceso.
   8. Inserte el extremo pelado del alambre en el lumen de la aguja de 1 cm rota, asegurándose de que la aguja quede inmediatamente adyacente a la parte aislada restante del alambre.
   9. Asegurándose de que no haya ninguna parte sin aislar entre la aguja y el lado más corto restante del alambre, engarce la aguja para unirla al alambre.
   10. A continuación, utilice los dos alicates para doblar con cuidado la aguja adjunta y darle una curvatura similar a la de una aguja de sutura quirúrgica estándar.
   11. Finalmente, pele ~ 5 mm del extremo del lado largo del cable (Figura 3). Después de que los electrodos se suturan en el DIAm, el lado largo del cable se tunelizará para el acceso externo y permitir registros de EMG DIAm.
   12. Repita el proceso para hacer un segundo electrodo para registros diferenciales.
2. Colocación del electrodo EMG de diafragma
   1. Antes de la cirugía, esterilice o autoclave todo el equipo quirúrgico, incluyendo (1) cortapelos para animales pequeños, (2) bisturí con cuchilla #11, (3) tijeras quirúrgicas, (4) pinzas y (5) soporte para microagujas.
   2. Adquiera una jaula limpia y proporcione comida, agua, ropa de cama y enriquecimiento ambiental. Deje a un lado sobre una almohadilla térmica. Esta jaula se utilizará para albergar al animal después de la cirugía.
   3. Esterilizar el campo quirúrgico con desinfectante adecuado y colocarse equipo de protección personal (batas, gorros, mascarilla y guantes quirúrgicos). Coloque los electrodos previamente preparados en una piscina de alcohol isopropílico al 70%.
   4. Coloque una almohadilla térmica en el área quirúrgica para mantener la temperatura corporal de la rata durante la anestesia y la cirugía. Cubra la almohadilla térmica con una toalla quirúrgica esterilizada.
   5. Pesar a la rata y calcular la dosis adecuada de anestésico según las pautas institucionales de cuidado y uso de animales.
   6. Anestesiar a la rata con una inyección intramuscular de ketamina (80 mg/kg) y xilacina (10 mg/kg) en las extremidades traseras u otro anestésico apropiado (siguiendo los protocolos aprobados institucionalmente). Inyectar buprenorfina de liberación prolongada (1 mg/kg) y carprofeno (5 mg/kg) antes de la operación. Proceda una vez que el animal ya no responda al pellizco de los dedos de los pies.
   7. Use tijeras para afeitar a la rata desde el proceso xifoides hasta aproximadamente la mitad de las extremidades traseras. Además, afeita la espalda de la rata, donde los electrodos se externalizarán más allá del alcance del animal (generalmente alrededor de los omóplatos). Limpia el exceso de vello con un trozo de gasa.
   8. Prepare la piel para la incisión limpiándola con una gasa estéril humedecida humedecida en gluconato de clorohexidina (4% en peso por volumen).
   9. Coloque al animal en posición supina sobre la almohadilla térmica esterilizada. A partir del proceso xifoides, utilice el bisturí y una cuchilla limpia #11 para hacer una incisión rostrocaudal de 4-5 cm. Esto debería exponer las capas musculares abdominales subyacentes.
   10. Haga otra incisión (3-4 cm) a lo largo de la línea media en las capas musculares para exponer el contenido abdominal. Tenga cuidado de no cortar los órganos abdominales.
   11. Asegúrese de que la superficie abdominal (es decir, inferior) del DIAm sea visible, aunque el lado derecho del animal quedará oscurecido por el hígado.
   12. Con el mango de un bisturí u otro instrumento contundente, empuje hacia abajo el hígado y otros órganos para exponer el lado abdominal del DIAm.
   13. Prepare el electrodo para su uso retirándolo del charco de alcohol isopropílico y lavándolo con solución salina estéril. A continuación, con un soporte de microagujas, oriente uno de los electrodos previamente preparados perpendicularmente a las fibras musculares de la región costal media del DIAm. Las fibras musculares se extienden radialmente por el DIAm.
       NOTA: El diámetro es delgado (~2 mm) y no debe perforarse. Más bien, el objetivo es incrustar la parte no aislada del cable del electrodo (Figura 3) dentro del DIAm.
   14. Utilice el microscopio quirúrgico para insertar cuidadosamente el alambre de sutura del electrodo (extremo de la aguja) en el DIAm. Permita que la curvatura de la aguja guíe el electrodo hacia adentro y luego hacia afuera de la superficie abdominal del DIAm, asegurándose de que toda la parte no aislada del alambre se incruste completamente en el músculo.
   15. Tire con cuidado de la aguja hasta que el nudo del alambre se ancle en el DIAm. Asegúrese de que la parte no aislada (2 mm) del alambre del electrodo esté completamente dentro del DIAm, con un nudo en el punto donde la aguja entró por primera vez en el DIAm.
   16. A continuación, corte la aguja del alambre del electrodo y deséchela en un recipiente para objetos punzantes.
   17. Con dos pinzas, haga un nudo en el punto donde la aguja de sutura (3-0) salió del DIAm. Para hacer esto, ate un lazo en el lado corto del alambre, deslice el lazo hacia abajo hasta la superficie abdominal del DIAm y apriete cuidadosamente el lazo en un nudo. El electrodo (parte no aislada) ahora debe estar anclado tanto en su punto de entrada como en el de salida.
   18. Corta la parte sobrante del lado más corto del alambre.
   19. Siga los pasos 1.2.14-1.2.18 para suturar en otro electrodo en el mismo lado del DIAm, a ~3 mm del primero.
   20. Realice la implantación del par de electrodos en el hemidiafragma opuesto de la misma manera.
   21. A continuación, asegúrese de que el lado más largo de los cables de los electrodos esté fuera de la cavidad abdominal y comience a suturar (3-0) las capas musculares para cerrar el abdomen. Para cada par de electrodos, haga un lazo y fíjelo.
       NOTA: Asegúrese de que queden 2-3 cm de alambre dentro de la cavidad abdominal para permitir que la rata se estire sin causar tensión en el DIAm.
   22. Limpiar el exceso de sangre con solución salina y luego suturar (3-0) la capa muscular en un patrón continuo para cerrar el peritoneo.
   23. Tuneje un catéter de 16 G desde la piel dorsal medial de la rata a través de la piel abdominal abierta y tire de un par de cables de electrodos hasta la parte posterior de la rata.
   24. Repita el proceso con un segundo catéter en el otro lado y tire del segundo par de cables de electrodos.
   25. Suturar la piel abdominal con una sutura 3-0 en un patrón de sutura interrumpido.
   26. A continuación, para cada par, ate los cables de los electrodos en un nudo y suérelos en su lugar.
   27. Proporcionar al animal una inyección subcutánea de solución salina (~1 ml por 50 g de masa animal). Coloque al animal en una jaula limpia sobre una almohadilla térmica para que se recupere.
       NOTA: La laparotomía puede causar inhibición de la actividad de DIAm^35,36. Espere al menos 72 horas antes del análisis cuantitativo de cualquier medición de EMG.

2. Hemisección espinal cervical

1. Prepare el área quirúrgica estéril como antes.
2. Antes de la cirugía, esterilizar en autoclave o esterilizar todo el equipo quirúrgico. Equipo requerido: (1) cortapelos de animales pequeños, (2) bisturí con cuchilla # 11, (3) tijeras quirúrgicas, (4) fórceps, (5) rongeurs, (6) retractores, (7) cuchillo de disección en ángulo.
3. Aproximadamente 72 h después de la implantación del electrodo DIAm EMG, pesar la rata y calcular la dosis anestésica adecuada según las pautas institucionales de cuidado y uso de animales.
4. Antes de anestesiar a la rata, colóquela en una jaula estilo Bowman y registre la EMG DIAm bilateral como se describe en el paso 3.2.
5. Anestesiar a la rata con una inyección intraperitoneal de ketamina (80 mg/kg) y xilacina (10 mg/kg) u otro anestésico apropiado según el protocolo del Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales local. Preoperatoriamente: inyectar buprenorfina de liberación prolongada (1 mg/kg) por vía subcutánea y carprofeno (5 mg/kg) por vía intraperitoneal.
6. Proceda una vez que el animal ya no responda al pellizco de los dedos de los pies. Verifique la profundidad de la anestesia con un pellizco en el dedo del pie aproximadamente cada 15 minutos.
7. Antes de comenzar la cirugía, coloque a la rata en posición prona y registre el EMG en la rata anestesiada como se describe en el paso 3.3.
   NOTA: Asegúrese de que todas las grabaciones se realicen con la rata en la misma posición.
8. Afeita el vello desde el cuello hasta el nivel de las orejas hasta las escápulas y retíralo con una gasa húmeda.
9. Limpiar la piel con gluconato de clorohexidina (4% en peso) y cubrir al animal con fundas quirúrgicas estériles (excepto el dorso superior).
10. Con ayuda de un bisturí, realice una incisión rostro-caudal de 4 cm. Retrae la piel y corta el músculo acromiotrapecio. A continuación, diseccionar el músculo romboidal para exponer los músculos espinales.
    NOTA: El acromiotropecio es el músculo trapecio medio, y sus fibras musculares corren aproximadamente paralelas a la columna vertebral. El músculo romboidal está expuesto en el plano por debajo del acromiotrapecio y sus fibras musculares corren en diagonal.
11. Retrae los músculos de la columna vertebral de C₁ a C₃.
    NOTA: Los músculos de la columna vertebral corren inmediatamente adyacentes a la columna vertebral.
12. Realice cuidadosamente una laminectomía en C₂ con un rongeur mientras observa a través de un microscopio quirúrgico para asegurarse de que no se dañen las arterias o nervios principales.
13. Corte y retraiga la duramadre en C_2.
14. Conecte los cables de los electrodos expuestos desde la espalda de la rata hasta el amplificador mientras realiza la hemisección espinal. Consulte el paso 3 para obtener más detalles.
15. Mientras monitorea DIAm EMG, inserte el bisturí de disección en ángulo justo debajo del punto donde la raíz dorsal ingresa a la médula espinal y corte todo el camino hasta el punto medio de la superficie ventral de la manera que se muestra en la Figura 2A.
    NOTA: Si utiliza una almohadilla térmica electrónica, puede ser necesario apagarla mientras monitorea el EMG para evitar ruido.
16. A los pocos segundos de este seccionamiento, asegúrese de que la actividad eupneica de DIAm EMG ipsilateral a la lesión cese y de que se evidencie un aumento compensatorio de la actividad de cDIAm EMG (Figura 2C).
17. Si persiste la actividad EMG eupneica de iDIAm, realice otro corte con el cuchillo de disección, como se destaca en la Figura 2C. Sin embargo, no corte a través de la línea media; Lo más probable es que el corte hacia el lado contralateral provoque la muerte del animal.
18. Suturar los músculos y luego la piel con suturas estériles (3-0).
19. Para mantener la hidratación, inyecte por vía subcutánea 1 mL de solución salina por cada 50 g de masa animal y coloque al animal en una jaula limpia con una almohadilla térmica para su recuperación. Monitoree al animal a medida que se recupera de la cirugía.
20. Aproximadamente 72 h más tarde (Día 3 Post-C₂SH), registre la actividad de EMG en ratas despiertas según el paso 3.2 del protocolo. Ten cuidado de no dañar los puntos en el dorso de la rata.
21. A continuación, anestesiar a la rata una vez más (siguiendo los protocolos aprobados institucionalmente), utilizando una dosis más ligera de anestésico que la que se requeriría para un avión quirúrgico (entre 1/3 y 1/2 de una dosis normal). Se pueden administrar dosis adicionales siempre y cuando las ratas muestren un reflejo corneal intacto y respondan al pinzamiento de los dedos del pie.
22. Monitoree la actividad de DIAm EMG siguiendo el paso 3 del protocolo.
    NOTA: Coloque la rata en la misma posición que la utilizada para la evaluación inicial de la actividad de iDIAm EMG.
23. Si la actividad EMG eupneica de iDIAm (es decir, actividad en fase con la actividad inspiratoria de cDIAm EMG) está ausente en el día 3, concluya que el C₂SH inicial fue exitoso e incluya al mismo animal para análisis posteriores.

3. Adquisición y análisis de datos

1. Configuración general y extracción de datos
   1. Ajuste los filtros de paso de banda del preamplificador a 100 Hz (paso alto) y 1000 Hz (paso bajo).
      NOTA: Estas configuraciones de filtro eliminan los artefactos de movimiento y reducen notablemente el ruido de 60 Hz y la contaminación del ECG (que tiene una potencia máxima de ~ 75 Hz) mientras conservan la gran mayoría del contenido de frecuencia de la señal EMG DIAm intramuscular. Basado en la teoría de Nyquist, digitalice con una frecuencia de muestreo de 2000 Hz para evitar el aliasing y permitir una resolución adecuada para notar la actividad de la unidad motora en el EMG compuesto. Si se realizan análisis especializados del contenido de frecuencia del rango de frecuencia inferior a 100 Hz, es importante establecer la configuración del filtro del preamplificador para garantizar que las frecuencias de interés no se filtren.
   2. Monitorice dos canales (EMG hemidiafragma izquierdo y derecho) en un software de visualización en un ordenador y guarde los datos en un formato adecuado para análisis posteriores.
   3. Recoja al menos 1-2 minutos de grabaciones eupneicas para tener suficientes datos para los análisis.
   4. Asegúrese de que los datos se recopilan en tres o más puntos temporales:
      1. Antes de_C2SH, establecer un registro eupneico basal en condiciones de vigilia y anestesia.
      2. Durante la cirugía_C2SH para establecer el silenciamiento de la actividad EMG eupneica iDIAm en condiciones anestesiadas.
      3. En el día 3_post-C2SH para confirmar que la ausencia de actividad eupneica de iDIAm EMG persiste y establecer un punto inicial de la extensión del déficit en animales despiertos que no esté tan influenciado por el shock espinal ^2,39 o la administración de depresores respiratorios como la buprenorfina.
   5. Analice las grabaciones DIAm EMG utilizando cualquier software que permita realizar cálculos sobre señales digitalizadas (por ejemplo, Matlab, Python, R). El proceso básico es el siguiente:
      1. Cargue los archivos EMG sin procesar. Dependiendo de la configuración de filtrado, puede ser necesario tener en cuenta un desplazamiento de CC en la señal.
         NOTA: Una solución fácil es restar la media de la señal EMG bruta de sí misma.
      2. Calcule la raíz cuadrada media de la señal EMG con una ventana móvil de 50 ms. Esto se puede hacer moviendo una ventana de cálculo de 50 ms hacia adelante un punto de muestra a la vez hasta que se alcanza el final de la señal.
         NOTA: Los análisis de eventos EMG DIAm individuales proporcionan la mayor potencia estadística y permiten agrupar la actividad eupneica y no eupneica. Por lo tanto, la detección del inicio y la compensación de las respiraciones individuales en el DIAm EMG es primordial, como se destacó en un informe anterior⁴⁰.
   6. Realizar el filtrado de la actividad eupneica mediante la visualización de los histogramas de la frecuencia respiratoria instantánea y la duración de la ráfaga, como se muestra en un informe anterior⁴¹.
2. Grabaciones de Despierto.
   1. Realice grabaciones despiertos colocando ratas en una jaula de roedores estilo Bowman. Una jaula cilíndrica estilo Bowman puede acomodar ratas adultas de hasta 750 g.
   2. Desatornilla las varillas de metal en un lado de la jaula estilo Bowman y persuade suavemente a la rata para que entre. Vuelve a atornillar las varillas de metal, atrapando a la rata en la jaula cilíndrica.
      NOTA: Aclimate a las ratas a la jaula durante al menos 30 minutos antes de continuar con la grabación. Si es posible, es mejor aclimatar a las ratas a la jaula estilo Bowman durante varios días antes de cualquier medición. Es una buena práctica proporcionar golosinas mientras las ratas están en la jaula durante esta fase de aclimatación.
   3. Para minimizar los estímulos visuales externos, usa una toalla de papel u objeto similar para hacer una carpa alrededor de la parte delantera de la jaula donde está la cabeza de la rata. Además, minimice los ruidos fuertes y garantice la comodidad física de la rata en todos los puntos.
      NOTA: Los signos obvios de malestar incluyen inquietud, respiración rápida y lucha contra la jaula. Si se observa alguno de estos signos, puede ser necesario devolver a la rata a la jaula doméstica e intentar grabarla cuando esté más tranquila.
   4. Para ratas más pequeñas (<300 g), inserte materiales de relleno (por ejemplo, toallas de papel, bolas de algodón) en espacios adicionales de la jaula para evitar que la rata gire 180 grados.
   5. Después de que la rata se haya aclimatado, conecte cuidadosamente los cables que salen del dorso de la rata a un preamplificador, que alimenta las señales analógicas a un convertidor de analógico a digital, y siga los procedimientos descritos en el paso 3.1.
3. Grabaciones anestesiadas
   1. Coloque a las ratas en la misma posición cada vez, preferiblemente propensas a imitar más de cerca la postura de la rata despierta.
   2. Conecte los cables que salen del dorso de rata a un preamplificador, que alimenta las señales analógicas a un convertidor de analógico a digital, y siga los procedimientos descritos en el paso 3.1.
4. Recuperación de animales
   1. Coloque a las ratas dentro de una jaula de ratas vacía y limpia sin ropa de cama para su recuperación.
   2. Coloque la jaula sobre una almohadilla térmica.
   3. Monitoree a la rata a intervalos regulares (<15 min) durante las primeras 3 h o hasta que la rata comience a moverse. Vigile a intervalos menos regulares (30 min) hasta que el animal vuelva a estar despierto.
   4. Después de que la rata sea ambulatoria, colóquela en una jaula limpia con ropa de cama, acceso a comida y agua, y enriquecimiento ambiental.
   5. Continúe monitoreando a la rata al menos una vez al día durante el transcurso del experimento. Preste especial atención a los cambios en el peso/capacidad para alimentarse, así como a la integridad de los sitios de incisión y las suturas.

Resultados

El enfoque presentado en este artículo minimiza la variabilidad entre operadores mediante el establecimiento de criterios claros para evaluar DIAm EMG en un modelo de rata de C₂SH. En primer lugar, se debe observar el cese de la actividad EMG eupneica de iDIAm inmediatamente después de C₂SH, como se muestra en la Figura 2. De lo contrario, se puede realizar una transección secundaria hasta que desaparezca la actividad eupneica de iDIAm. En segundo lugar, en el día 3...

Discusión

Hemisección espinal C₂
El procedimiento descrito en este artículo hace hincapié en las evaluaciones de la actividad de DIAm EMG que sirven como validación de una lesión espinal C₂ que atraviesa los funículos lateral y ventral sin afectar los funículos dorsales (Figura 2A). El abordaje quirúrgico propuesto tiene dos beneficios principales. En primer lugar, preserva los funículos dorsales, que preservan la función ambulatoria en las ratas, al...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
25 G Needle	Cardinal Health	1188825100	Covidien Monoject Hypdermic Standard Needles: 25 G x 1" (0.508 mm x 2.5 cm) A
3-0 Vicryl Violet Braided	Ethicon	J774D	3-0 Suture
Adson-Brown Forceps	Fine Science Tools	11627-12	Tip Shape: Straight, Tips: Shark Teeth, Tip Width: 1.4mm, Tip Dimensions: 2 x 1.4 m, Alloy / Material: Stainless Steel, Length: 12 cm
Bowman Style Cage	Braintree Scientific	POR-530	Weight range: 250 up to 750 g; Maximum length: 9" (228 mm); Basic unit is constructed of .5" (123 mm) jeweled acrylic.
Castroviejo Needle Holder	Fine Science Tools	12565-14	Tip Shape: Straight, Tip Width: 1.5 mm, Clamping Length: 10 mm, Lock: Yes, Scissors: No, Alloy / Material: Stainless Steel, Length: 14 cm, Serrated: Yes, Feature: Tungsten Carbide
Clip Lead 1m TP Shielded	Biopac Systems, Inc	LEAD110S	Shielded lead wires for EMG
Data Acquisition Software	LabChart	LabChart 7.3.8	Data recording, visualization, and analysis software for multi-channel recordings and real-time assessments
Data Analysis Software - Matlab 2023b	Mathworks, Inc.	Version 23.2	General purpose programming language for post hoc analysis
Dissecting Knife	Fine Science Tools	10056-12	Cutting Edge: 4 mm, Thickness: 0.5 mm, Alloy / Material: Stainless Steel, Length: 12.5 cm, Blade Shape: Angled 30°
Dumont #3 Forceps	Fine Science Tools	11293-00	Style: #3, Tip Shape: Straight, Tips: Standard, Tip Dimensions: 0.17 x 0.1 mm, Length: 12 cm, Alloy / Material: Dumostar
Electromyogram Amplifier	Biopac Systems, Inc	EMG100C	EMG amplifier
Friedman Rongeur	Fine Science Tools	16000-14	Tip Shape: Curved, Cup Size: 2.5mm, Alloy / Material: Stainless Steel, Length: 13cm, Joint Action: Single
Friedman-Pearson Rongeurs	Fine Science Tools	16021-14	Alloy / Material: Stainless Steel, Length: 14cm, Joint Action: Single, Cup Size: 1mm, Tip Shape: Curved
Isolated Power Supply Module	Biopac Systems, Inc	IPS100C	Operates 100-series amplifier modules indepdent of the Biopac Systems, Inc.'s MP series Data Acquisition System
Kelly Hemostats	Fine Science Tools	13019-14	Tips: Serrated, Tip Width: 1.5mm, Clamping Length: 22mm, Alloy / Material: Stainless Steel, Length: 14cm, Tip Shape: Curved
Knife Curette	V. Mueller	VM101-4414	Tip: Sharp, Tip Diameter: 2 mm
Micro Dissecting Scissors	Biomedical Research Instruments, Inc.	11-2420	Length: 4", Angle: Straight, Blade Length: 23 mm
Multistranded stainless steel wire	Cooner Wire, Inc.	AS 631	AWG 40; Overall diameter: 0.011 mm (with insulation), 0.008 mm (without insulation).
PowerLab 8/35	ADInstruments	PL3508	Data acquisition system
Scalpel Blade #11	Fine Science Tools	10011-00	Blade Shape: Angled, Cutting Edge: 20 mm, Thickness: 0.4 mm, Alloy / Material: Carbon Steel
Scalpel Handle #3	Fine Science Tools	10003-12	Alloy / Material: Stainless Steel, Length: 12 cm
Sprague Dawley Rat	Inotiv	Order code: 002	Sprague Dawley outbred rats (female and male)
Surgical Microscope	Olympus	SZ61	Surgical microscope
Suture Cutting Scissors	George Tiemann & Co.	110-1250SB	Alloy / Material: Stainless Steel, Tip Shape: Straight, Tips: Sharp/Blunt, Length: 4.5"
Vannas Spring Scissors	Fine Science Tools	15000-08	Tips: Sharp, Cutting Edge: 2.5 mm, Tip Diameter: 0.05 mm, Length: 8 cm, Alloy / Material: Stainless Steel, Serrated: No, Tip Shape: Straight
Weitlaner Retractor	Codman	50-5647	Prongs: 2 x 3 Blunt, Length: 4.5"