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Resumo

As complicações respiratórias são a principal causa de morte em indivíduos com lesão medular cervical (cSCI). Modelos animais de cSCI são essenciais para avaliações mecanicistas e estudos pré-clínicos. Aqui, apresentamos um método reprodutível para avaliar a recuperação funcional da atividade do músculo diafragma (DIAm) após hemissecção espinhal C2 unilateral (C2SH) em ratos.

Resumo

Após a cSCI, a ativação do DIAm pode ser afetada dependendo da extensão da lesão. O presente manuscrito descreve um modelo de hemissecção C2 unilateral (C2SH) de cSCI que interrompe a atividade eletromiográfica (EMG) do diafragma ipsilateral eupneico (iDIAm) durante a respiração em ratos. Para avaliar a recuperação do controle motor do diâmetro diamétrico, a extensão do déficit devido ao C2SH deve primeiro ser claramente estabelecida. Ao verificar uma perda inicial completa de iDIAm EMG durante a respiração, a recuperação subsequente pode ser classificada como ausente ou presente, e a extensão da recuperação pode ser estimada usando a amplitude EMG. Além disso, medindo a ausência contínua de atividade EMG iDIAm durante a respiração após o período de choque espinhal agudo após C2SH, o sucesso do C2SH inicial pode ser validado. A medição da atividade EMG do diafragma contralateral (cDIAm) pode fornecer informações sobre os efeitos compensatórios do C2SH, que também reflete a neuroplasticidade. Além disso, os registros de EMG DIAm de animais acordados podem fornecer informações fisiológicas vitais sobre o controle motor do DIAm após C2SH. Este artigo descreve um método para um modelo C2SH rigoroso, reprodutível e confiável de cSCI em ratos, que é uma excelente plataforma para estudar neuroplasticidade respiratória, atividade compensatória de cDIAm e estratégias terapêuticas e fármacos.

Introdução

Existem mais de 300.000 indivíduos com lesão medular (LM) nos Estados Unidos, aproximadamente metade dos quais tem lesões cervicais1. Essas lesões resultam em perda significativa de bem-estar e colocam uma pressão financeira sobre os indivíduos, suas famílias e o sistema de saúde. Felizmente, a maioria dos LMEs está incompleta - fornecendo o potencial para o fortalecimento das vias poupadas1. Essa neuroplasticidade pode permitir a recuperação de pelo menos algumas funções, incluindo a atividade do DIAm, que é importante para comportamentos ventilatórios e não ventilatórios. Assim, promover a neuroplasticidade é um caminho promissor de pesquisa para ajudar indivíduos com LM2.

Modelos de LM em roedores têm o potencial de contribuir substancialmente para a descoberta de tratamentos para melhorar a saúde humana. Um dos modelos clássicos de LM utilizados para estudar a neuroplasticidade é a transecção unilateral (hemissecção) da medula espinhal em C2 (C2SH), que deixa o lado contralateral intacto 3,4,5,6,7,8,9,10,11,12,13. O efeito do C2SH na produção frênica e a importância das vias contralaterais poupadas foram revelados pela primeira vez há mais de cem anos por Porter12, cujo artigo seminal lançou as bases para estudos modernos de neuroplasticidade respiratória. O modelo C2SH interrompe as entradas descendentes do grupo respiratório ventral rostral (rVRG) na medula, que contém neurônios pré-motores responsáveis por transmitir a saída da geração do ritmo respiratório14. Esses neurônios pré-motores rVRG também transmitem impulso neural excitatório para neurônios motores frênicos (Figura 1). Vários pesquisadores adotaram abordagens diferentes para o modelo C2SH 10,11,15,16, o que pode explicar parcialmente parte da variabilidade na recuperação entre os estudos. Resumidamente, as abordagens variam em termos de poupar os funículos dorsais, realizar uma hemissecção completa ou realizar uma transecção parcial lateral que não interrompa completamente as entradas descendentes do rVRG ipsilateral. Geralmente, os modelos C2SH são particularmente úteis para estudar a neuroplasticidade respiratória devido às taxas de recuperação espontânea da atividade eletromiográfica (EMG) eupneica iDIAm ao longo do tempo, que pode ser melhorada por vários fatores, incluindo sinalização neurotrófica 17,18,19,20,21. No entanto, uma perda inicial de função - definida como o silenciamento da atividade eupneica de EMG iDIAm - deve ser estabelecida antes que a recuperação possa ser claramente classificada. Essa validação da inatividade no momento da HAS C2não é feita em vários estudos 3,4,6,7,11,22,23.

As avaliações histológicas da medula espinhal excisada fornecem apenas evidências de danos à localização apropriada das vias bulboespinhais excitatórias ipsilaterais que inervam os neurônios motores frênicos na medula espinhal, mas a histologia não substitui evidências fisiológicas (por exemplo, EMG DIAm). Além disso, as avaliações histológicas são realizadas ex vivo em pontos de tempo terminais (geralmente várias semanas a meses após a lesão) e não fornecem informações em "tempo real". Alguns pesquisadores observaram que a magnitude da lesão está relacionada à quantidade de déficit funcional ou à falta dele 5,24,25,26. É importante notar que a validade de tais alegações é provavelmente altamente dependente de como a "função" é classificada (ou seja, quais são as tarefas funcionais e como elas são quantificadas), e a variabilidade entre os estudos destaca a dificuldade de produzir lesões funcionalmente idênticas entre os animais. De fato, os pesquisadores enfatizaram que a relação entre a extensão da lesão e a função locomotora muscular dos membros (quantificada pelo escore de Basso, Beattie e Bresnahan (BBB)24) não élinear27,28. Em estudos anteriores, não encontramos relação entre a extensão da HAS C2e a extensão da recuperação da atividade EMG eupneica iDIAm pós-lesão 10,29,30,31, embora outros pesquisadores tenham relatado uma relação entre a função ventilatória e a extensão da substância branca poupadora 5. Assim, no caso do modelo C2SH, uma abordagem para validação funcional da inatividade do iDIAm no momento da cirurgia e, de preferência, no início do curso do tempo dos experimentos de lesão medular crônica é benéfica e necessária.

O presente artigo ressalta o uso do DIAm EMG para confirmação em tempo real da perda inicial do DIAm EMG durante a respiração após o C2SH, bem como avaliações confirmatórias subsequentes aos 3 dias (Dia 3) após a lesão 18,21,31,32,33. Em trabalhos anteriores com o modelo C2SH, laparotomias repetidas foram realizadas para registrar EMG DIAm 10,13,30,34. No entanto, trabalhos mais recentes utilizaram eletrodos EMG crônicos, que permitem o registro de EMG em ratos anestesiados e acordados. Além disso, os eletrodos crônicos reduzem o risco de pneumotórax e não requerem laparotomias repetidas, o que pode causar inibição do DIAm35,36. Embora versões do modelo C2SH tenham sido utilizadas por muitos pesquisadores, a confirmação do silenciamento da atividade do iDIAm não foi feita no momento da cirurgia 3,4,6,7,11,22,23. Sem essa confirmação de inatividade, é difícil saber qual parte da recuperação subsequente atribuir à neuroplasticidade das vias ipsilaterais versus contralaterais, que podem ter impactos diferenciais. Esta é uma consideração importante porque o impulso neural inspiratório do rVRG para os motoneurônios frênicos é principalmente ipsilateral, com uma perda de cerca de 50% das entradas glutamatérgicas excitatórias para os neurônios motores frênicos após C2SH33. No entanto, existem entradas excitatórias inspiratórias remanescentes do rVRG contralateral que decussam abaixo do local da lesão para inervar os neurônios motores frênicos ipsilaterais e podem ser fortalecidos por meio da neuroplasticidade para promover a recuperação funcional. Ao remover a entrada excitatória ipsilateral predominante para os neurônios motores frênicos, a atividade eupneica da EMG iDIAm é perdida (pelo menos sob anestesia), enquanto a atividade do cDIAm continua e é até aumentada. A perda da atividade EMG iDIAm durante a respiração é, portanto, uma medida de um sucesso de C2SH (Figura 2).

Algum nível de atividade EMG iDIAm está presente em 1-4 dias após C2SH em animais acordados23,37. Além disso, em animais descerebrados, a atividade do iDIAm está presente dentro de minutos a horas após a hemissecção cervical superior e é suprimida pela anestesia38. Além disso, o sucesso do C2SH é validado pela confirmação da ausência de atividade EMG iDIAm durante a respiração (eupneia) em ratos anestesiados no dia 3 pós-lesão. Estudos de imagem confocal confirmaram a perda de entradas sinápticas glutamatérgicas nos neurônios motores frênicos durante esse estágio inicial da lesão37. No dia 3 pós-lesão, se houver alguma atividade eupneica residual do iDIAm EMG, isso é interpretado como evidência de remoção incompleta do impulso inspiratório descendente ipsilateral do rVRG. O presente artigo está dividido em três seções: (1) registros crônicos de EMG DIAm, (2) C2SH e (3) aquisição de dados EMG em animais acordados e anestesiados. Este protocolo descreve ummodelo C2SH rigoroso, reprodutível e confiável de cSCI em ratos, que é uma excelente plataforma para estudar a neuroplasticidade respiratória, a atividade compensatória do cDIAm e as estratégias terapêuticas e farmacêuticas.

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Protocolo

Este protocolo foi aprovado pelo Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais da Mayo Clinic (Número do Protocolo: A00003105-17-R23). Os animais do presente estudo eram uma mistura de ratos Sprague-Dawley machos e fêmeas com aproximadamente 3 meses de idade e pesando entre 200 g e 350 g. Os detalhes dos reagentes e do equipamento utilizado no estudo estão listados na Tabela de Materiais.

1. Implantação de eletrodo

  1. Preparando os eletrodos
    1. Certifique-se de que o equipamento mencionado esteja disponível: (1) Fio multifilamento de aço inoxidável, (2) bisturi com lâmina #11, (3) tesoura, 4) microscópio de dissecação, (5) régua, (6) pinça, (7) agulhas de 25 g, (8) 2 alicates (pelo menos um com zona de crimpagem).
    2. Os detalhes do processo de fabricação de eletrodos são mostrados na Figura 3. Repita este processo pelo menos duas vezes para eletrodos de registro diferencial emparelhados.
    3. Primeiro, meça e corte 18 cm do fio de aço inoxidável.
    4. Dê um nó básico a 4 cm de uma extremidade do fio, conforme mostrado na Figura 3; isso servirá como âncora quando o lado curto do fio for implantado e suturado no diâmetro.
    5. Usando um bisturi e um escopo de dissecção cirúrgica, retire cuidadosamente 2 mm de isolamento imediatamente adjacente ao nó no lado mais curto do fio. Tenha muito cuidado para não cortar fios do fio multifilamento.
      NOTA: Esta parte não isolada serve como superfície condutora do eletrodo. Geralmente, a qualidade do sinal começa a se degradar se três ou mais fios forem cortados inadvertidamente e, em caso afirmativo, o eletrodo é substituído.
    6. Em seguida, descasque ~5 mm da extremidade do lado curto do fio, que é então inserido no lúmen de uma agulha de 25 G para fazer uma ferramenta semelhante a um fio de sutura que será usada para implantar o eletrodo no DIAm.
      NOTA: Agulhas de calibre mais alto (por exemplo, até 28 G) também podem ser usadas dependendo da preferência pessoal. Devido ao diâmetro mais fino das agulhas de calibre mais alto, o risco de pneumotórax pode ser potencialmente reduzido. No entanto, também pode ser mais difícil inserir os fios multifilamentados no lúmen menor da agulha.
    7. Para conseguir isso, remova uma agulha de 25 G de sua embalagem e, usando os dois alicates, dobre cuidadosamente a agulha a ~ 1 cm da extremidade chanfrada afiada de um lado para o outro até que ela se quebre.
      NOTA: Este processo não deve ser apressado; caso contrário, as forças de cisalhamento podem fazer com que o lúmen da agulha se feche, exigindo que o processo seja repetido.
    8. Insira a extremidade descascada do fio no lúmen da agulha quebrada de 1 cm, certificando-se de que a agulha fique imediatamente adjacente à parte isolada restante do fio.
    9. Certificando-se de que não haja nenhuma parte não isolada entre a agulha e o lado mais curto restante do fio, prenda a agulha para prendê-la ao fio.
    10. Em seguida, use os dois alicates para dobrar cuidadosamente a agulha anexada para dar a ela uma curvatura semelhante à de uma agulha de sutura cirúrgica padrão.
    11. Por fim, retire ~5 mm da extremidade do lado comprido do fio (Figura 3). Depois que os eletrodos forem suturados no DIAm, o lado longo do fio será tunelado para acesso externo para permitir gravações de EMG DIAm.
    12. Repita o processo para fazer um segundo eletrodo para registros diferenciais.
  2. Colocação do eletrodo EMG do diafragma
    1. Antes da cirurgia, esterilize ou autoclave todos os equipamentos cirúrgicos, incluindo (1) máquina de cortar pêlos de pequenos animais, (2) bisturi com lâmina #11, (3) tesoura cirúrgica, (4) pinça e (5) porta-microagulha.
    2. Adquira uma gaiola limpa e forneça comida, água, roupa de cama e enriquecimento ambiental. Reserve em uma almofada de aquecimento. Esta gaiola será usada para abrigar o animal após a cirurgia.
    3. Esterilize o campo cirúrgico com desinfetante apropriado e coloque equipamentos de proteção individual (jalecos, toucas, máscara e luvas cirúrgicas). Coloque os eletrodos previamente preparados em uma piscina de álcool isopropílico 70%.
    4. Coloque uma almofada de aquecimento na área cirúrgica para manter a temperatura corporal do rato durante a anestesia e a cirurgia. Cubra a almofada de aquecimento com uma toalha cirúrgica esterilizada.
    5. Pese o rato e calcule a dosagem anestésica apropriada com base nas diretrizes institucionais de cuidados e uso de animais.
    6. Anestesiar o rato com uma injeção intramuscular de cetamina (80 mg/kg) e xilazina (10 mg/kg) ou outro anestésico apropriado (seguindo protocolos aprovados institucionalmente). Injete buprenorfina de liberação prolongada (1 mg/kg) e carprofeno (5 mg/kg) no pré-operatório. Prossiga assim que o animal não responder mais ao beliscão do dedo do pé.
    7. Use uma tesoura para raspar o rato do processo xifóide até aproximadamente a metade dos membros posteriores. Além disso, raspe as costas do rato, onde os eletrodos serão externalizados além do alcance do animal (geralmente ao redor das omoplatas). Limpe o excesso de cabelo com um pedaço de gaze.
    8. Prepare a pele para a incisão limpando-a com gaze estéril embebida em gluconato de clorohexidina (4% em peso em volume).
    9. Coloque o animal em decúbito dorsal na almofada de aquecimento esterilizada. A partir do processo xifóide, use o bisturi e uma lâmina #11 limpa para fazer uma incisão rostrocaudal de 4-5 cm. Isso deve expor as camadas musculares abdominais subjacentes.
    10. Faça outra incisão (3-4 cm) ao longo da linha média nas camadas musculares para expor o conteúdo abdominal. Tome cuidado para não cortar os órgãos abdominais.
    11. Certifique-se de que a superfície abdominal (ou seja, inferior) do DIAm esteja visível, embora o lado direito do animal seja obscurecido pelo fígado.
    12. Usando um cabo de bisturi ou outro instrumento contundente, empurre para baixo o fígado e outros órgãos para expor o lado abdominal do DIAm.
    13. Prepare o eletrodo para uso removendo-o da poça de álcool isopropílico e lavando-o com solução salina estéril. Em seguida, usando um porta-microagulha, oriente um dos eletrodos previamente preparados perpendicularmente às fibras musculares na região médio-costal do DIAm. As fibras musculares se espalham radialmente pelo DIAm.
      NOTA: O diâmetro é fino (~2 mm) e não deve ser perfurado. Em vez disso, o objetivo é incorporar a parte não isolada do fio do eletrodo (Figura 3) dentro do diâmetro eletrônico.
    14. Use o microscópio cirúrgico para inserir cuidadosamente o fio de sutura do eletrodo (extremidade da agulha) no diâmetro eletrônico. Permita que a curvatura da agulha guie o eletrodo para dentro e depois para fora da superfície abdominal do diâmetro eletrônico, garantindo que toda a parte não isolada do fio seja totalmente incorporada ao músculo.
    15. Puxe cuidadosamente a agulha até que o nó no fio se ancoragem no diâmetro eletrônico. Certifique-se de que a parte não isolada (2 mm) do fio do eletrodo esteja completamente dentro do diâmetro eletrônico, com um nó no ponto onde a agulha entrou pela primeira vez no diâmetro eletrônico.
    16. Em seguida, corte a agulha do fio do eletrodo e descarte-a em um recipiente para objetos cortantes.
    17. Com duas pinças, dê um nó no ponto em que a agulha de sutura (3-0) saiu do diâmetro diamico. Para fazer isso, amarre um laço no lado curto do fio, deslize o laço para baixo até a superfície abdominal do diâmetro e aperte cuidadosamente o laço em um nó. O eletrodo (parte não isolada) deve agora ser ancorado em seu ponto de entrada e saída.
    18. Corte o excesso do lado mais curto do fio.
    19. Siga as etapas 1.2.14-1.2.18 para suturar outro eletrodo no mesmo lado do diâmetro diamétrico, ~ 3 mm de distância do primeiro.
    20. Execute o implante do par de eletrodos no hemidiafragma oposto da mesma maneira.
    21. Em seguida, certifique-se de que o lado mais longo dos fios do eletrodo esteja todo fora da cavidade abdominal e comece a suturar (3-0) as camadas musculares para fechar o abdômen. Para cada par de eletrodos, faça um laço e ancore-o.
      NOTA: Certifique-se de que 2-3 cm de fio sejam deixados dentro da cavidade abdominal para permitir que o rato se estique sem causar tensão no diâmetro.
    22. Limpe o excesso de sangue com solução salina e depois suture (3-0) a camada muscular em um padrão contínuo para fechar o peritônio.
    23. Encapsule um cateter de 16 G da pele dorsal medial do rato até a pele abdominal aberta e puxe um par de fios de eletrodo até a parte de trás do rato.
    24. Repita o processo com um segundo cateter do outro lado e puxe o segundo par de fios do eletrodo.
    25. Suturar a pele abdominal com uma sutura 3-0 em um padrão de sutura interrompido.
    26. Em seguida, para cada par, amarre os fios do eletrodo em um nó e suture-os no lugar.
    27. Forneça ao animal uma injeção subcutânea de solução salina (~ 1 ml por 50 g de massa animal). Coloque o animal em uma gaiola limpa sobre uma almofada de aquecimento para se recuperar.
      NOTA: A laparotomia pode causar inibição da atividade do DIAm35,36. Aguarde pelo menos 72 h antes da análise quantitativa de qualquer medição EMG.

2. Hemissecção da coluna cervical

  1. Prepare a área cirúrgica estéril como antes.
  2. Antes da cirurgia, autoclave ou esterilize todo o equipamento cirúrgico. Equipamento necessário: (1) máquina de cortar pêlos de pequenos animais, (2) bisturi com lâmina #11, (3) tesoura cirúrgica, (4) pinça, (5) rongeurs, (6) afastadores, (7) faca de dissecação angular.
  3. Aproximadamente 72 h após o implante do eletrodo EMG DIAm, pesar o rato e calcular a dose anestésica apropriada com base nas diretrizes institucionais de cuidados e uso de animais.
  4. Antes de anestesiar o rato, coloque-o em uma gaiola estilo Bowman e registre o EMG DIAm bilateral conforme descrito na etapa 3.2.
  5. Anestesiar o rato com uma injeção intraperitoneal de cetamina (80 mg/kg) e xilazina (10 mg/kg) ou outro anestésico apropriado de acordo com o protocolo do Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais local. No pré-operatório, injete buprenorfina de liberação prolongada (1 mg / kg) por via subcutânea e carprofeno (5 mg / kg) por via intraperitoneal.
  6. Prossiga assim que o animal não responder mais ao beliscão do dedo do pé. Verifique a profundidade da anestesia com uma pinça aproximadamente a cada 15 minutos.
  7. Antes de iniciar a cirurgia, coloque o rato em decúbito ventral e registre a EMG no rato anestesiado, conforme descrito na etapa 3.3.
    NOTA: Certifique-se de que todas as gravações sejam realizadas com o rato na mesma posição.
  8. Raspe o cabelo do pescoço até o nível da orelha e até as escápulas e remova-o com gaze úmida.
  9. Limpe a pele com gluconato de clorohexidina (4% em peso em volume) e cubra o animal com capas cirúrgicas estéreis (exceto no dorso superior).
  10. Usando um bisturi, faça uma incisão rostro-caudal de 4 cm. Retraia a pele e corte o músculo acromiotrapézio. Em seguida, disseque o músculo romboide para expor os músculos espinhais.
    NOTA: O acromiotrapézio é o músculo trapézio médio e suas fibras musculares correm aproximadamente paralelas à coluna vertebral. O músculo romboide é exposto no plano abaixo do acromiotrapézio e suas fibras musculares correm diagonalmente.
  11. Retraia os músculos espinhais de C1 para C3.
    NOTA: Os músculos espinhais correm imediatamente adjacentes à coluna.
  12. Execute cuidadosamente uma laminectomia em C2 usando um rongeur enquanto olha através de um microscópio cirúrgico para garantir que nenhuma artéria ou nervo importante seja danificado.
  13. Corte e retraia a dura-máter em C2.
  14. Conecte os fios do eletrodo expostos das costas do rato ao amplificador durante a realização da hemissecção espinhal. Consulte a etapa 3 para obter mais detalhes.
  15. Enquanto monitora o EMG DIAm, insira a faca de dissecação angular logo abaixo do ponto onde a raiz dorsal entra na medula espinhal e corte até o ponto médio da superfície ventral da maneira mostrada na Figura 2A.
    NOTA: Se estiver usando uma almofada térmica eletrônica, pode ser necessário desligá-la durante o monitoramento do EMG para evitar ruído.
  16. Dentro de segundos após este seccionamento, certifique-se de que a atividade EMG DIAm eupneica ipsilateral à lesão cesse e um aumento compensatório na atividade EMG cDIAm seja evidente (Figura 2C).
  17. Se a atividade eupneica de EMG iDIAm persistir, faça outro corte com a faca de dissecação, conforme destacado na Figura 2C. No entanto, não corte a linha média; O corte para o lado contralateral provavelmente levará à morte do animal.
  18. Suturar os músculos e depois a pele com suturas estéreis (3-0).
  19. Para manter a hidratação, injete por via subcutânea 1 mL de soro fisiológico por 50 g de massa animal e coloque o animal em uma gaiola limpa com uma almofada de aquecimento para recuperação. Monitore o animal enquanto ele se recupera da cirurgia.
  20. Aproximadamente 72 h depois (Dia 3 Pós-C2SH), registre a atividade EMG em ratos acordados de acordo com a etapa 3.2 do protocolo. Tenha cuidado para não danificar os pontos no dorso do rato.
  21. Em seguida, anestesiar o rato mais uma vez (seguindo protocolos aprovados institucionalmente), usando uma dose mais leve de anestésico do que seria necessária para um plano cirúrgico (entre 1/3 a 1/2 de uma dose normal). Doses adicionais podem ser administradas, desde que os ratos apresentem um reflexo da córnea intacto e respondam ao beliscão do dedo do pé.
  22. Monitore a atividade EMG DIAm seguindo a etapa 3 do protocolo.
    NOTA: Coloque o rato na mesma posição usada para a avaliação inicial da atividade do iDIAm EMG.
  23. Se a atividade eupneica de EMG iDIAm (ou seja, atividade em fase com atividade inspiratória de cDIAm EMG) estiver ausente no Dia 3, conclua que o C2SH inicial foi bem-sucedido e inclua o mesmo animal para análises adicionais.

3. Aquisição e análise de dados

  1. Configurações gerais e extração de dados
    1. Defina os filtros passa-banda do préamplifier para 100 Hz (passa-alta) e 1000 Hz (passa-baixa).
      NOTA: Essas configurações de filtro eliminam artefatos de movimento e reduzem significativamente o ruído de 60 Hz e a contaminação por ECG (que tem potência de pico em ~ 75 Hz), mantendo a grande maioria do conteúdo de frequência do sinal EMG de diâmetro intramuscular. Com base na teoria de Nyquist, digitalize com uma frequência de amostragem de 2000 Hz para evitar aliasing e permitir uma resolução adequada para observar a atividade da unidade motora no EMG composto. Se estiver realizando análises especializadas de conteúdo de frequência da faixa de frequência abaixo de 100 Hz, é importante definir o préampconfigurações de filtro do amplificador para garantir que as frequências de interesse não sejam filtradas.
    2. Monitore dois canais (EMG hemidiafragma esquerdo e direito) no software de visualização em um computador e salve os dados em um formato apropriado para análises posteriores.
    3. Colete pelo menos 1-2 minutos de gravações eupneicas para ter dados suficientes para análises.
    4. Certifique-se de que os dados sejam coletados em três ou mais momentos:
      1. Antes de C2SH, estabeleça um registro eupneico basal em condições acordadas e anestesiadas.
      2. Durante a cirurgia C2SH para estabelecer o silenciamento da atividade eupneica de iDIAm EMG em condições anestesiadas.
      3. No dia 3 pós-C2SH para confirmar que a ausência de atividade eupneica iDIAm EMG persiste e estabelecer um ponto inicial da extensão do déficit em animais acordados que não é tão influenciado pelo choque espinhal 2,39 ou administração de depressores respiratórios como a buprenorfina.
    5. Analise as gravações EMG DIAm usando qualquer software que permita que os cálculos sejam realizados em sinais digitalizados (por exemplo, Matlab, Python, R). O processo básico é o seguinte:
      1. Carregue os arquivos EMG brutos. Dependendo das configurações de filtragem, pode ser necessário levar em conta um deslocamento CC no sinal.
        NOTA: Uma solução fácil é subtrair a média do sinal EMG bruto de si mesmo.
      2. Calcule a raiz quadrada média do sinal EMG com uma janela móvel de 50 ms. Isso pode ser feito movendo uma janela de cálculo de 50 ms para frente em um ponto de amostragem de cada vez até que o final do sinal seja alcançado.
        NOTA: As análises de eventos EMG DIAm individuais fornecem o maior poder estatístico e permitem o agrupamento de atividade eupneica e não eupneica. Assim, a detecção do início e do deslocamento das respirações individuais na EMG do DIAm é fundamental, conforme destacado em um relatório anterior40.
    6. Realizar a filtragem da atividade eupneica visualizando os histogramas da frequência respiratória instantânea e da duração do burst, conforme mostrado em relatório anterior41.
  2. Gravações acordadas.
    1. Realize gravações acordadas colocando ratos em uma gaiola de roedores estilo Bowman. Uma gaiola cilíndrica estilo Bowman pode acomodar ratos adultos de até 750 g.
    2. Desaparafuse as hastes de metal em um lado da gaiola estilo Bowman e gentilmente convença o rato a entrar. Aparafuse as hastes de metal de volta, prendendo o rato na gaiola cilíndrica.
      NOTA: Aclimate os ratos à gaiola por pelo menos 30 minutos antes de prosseguir com a gravação. Se possível, é melhor aclimatar os ratos à gaiola estilo Bowman por vários dias antes de qualquer medição. É uma boa prática fornecer guloseimas enquanto os ratos estão na gaiola durante esta fase de aclimatação.
    3. Para minimizar os estímulos visuais externos, use uma toalha de papel ou objeto semelhante para fazer uma barraca ao redor da frente da gaiola onde está a cabeça do rato. Além disso, minimize ruídos altos e garanta o conforto físico do rato em todos os pontos.
      NOTA: Sinais óbvios de desconforto incluem inquietação, respiração rápida e luta contra a gaiola. Se algum desses sinais for observado, pode ser necessário devolver o rato à gaiola de casa e tentar gravar quando o rato estiver mais calmo.
    4. Para ratos menores (<300 g), insira materiais de enchimento (por exemplo, toalha de papel, bolas de algodão) em espaços extras na gaiola para desencorajar o rato de girar 180 graus.
    5. Depois que o rato estiver aclimatado, conecte cuidadosamente os fios que saem do dorso do rato a um pré-amplificador, que alimenta os sinais analógicos em um conversor analógico-digital, e siga os procedimentos descritos na etapa 3.1.
  3. Gravações anestesiadas
    1. Coloque os ratos na mesma posição todas as vezes, de preferência propensos a imitar mais de perto a postura do rato acordado.
    2. Conecte os fios que saem do dorso do rato a um pré-amplificador, que alimenta os sinais analógicos em um conversor analógico-digital, e siga os procedimentos descritos na etapa 3.1.
  4. Recuperação de animais
    1. Coloque os ratos dentro de uma gaiola vazia e limpa, sem cama para recuperação.
    2. Coloque a gaiola em uma almofada de aquecimento.
    3. Monitore o rato em intervalos regulares (<15 min) durante as primeiras 3 h ou até que o rato comece a se mover. Monitore em intervalos menos regulares (30 min) até que o animal esteja acordado novamente.
    4. Depois que o rato estiver ambulatorial, coloque-o em uma gaiola limpa com cama, acesso a comida e água e enriquecimento ambiental.
    5. Continue a monitorar o rato pelo menos uma vez ao dia durante todo o período do experimento. Preste atenção especial às mudanças no peso/capacidade de alimentação, bem como à integridade dos locais de incisão e suturas.

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Resultados

A abordagem apresentada neste artigo minimiza a variabilidade interoperadora, estabelecendo critérios claros para avaliar a EMG DIAm em um modelo de rato de C2SH. Primeiro, deve-se observar a cessação da atividade EMG eupneica do iDIAm imediatamente após C2SH, conforme mostrado na Figura 2. Caso contrário, uma transecção secundária pode ser realizada até que a atividade eupneica do iDIAm desapareça. Em segundo lugar, no dia 3 pós-C2SH, a ausência ...

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Discussão

C2 hemissecção da coluna vertebral
O procedimento descrito neste artigo enfatiza avaliações da atividade EMG DIAm que servem como validação de uma lesão espinhal C2 que atravessa os funículos lateral e ventral enquanto poupa os funículos dorsais (Figura 2A). A abordagem cirúrgica proposta tem dois grandes benefícios. Primeiro, poupa os funículos dorsais, que preservam a função ambulatorial em ratos, enquanto ainda corta as entradas ipsi...

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Divulgações

Os autores não têm conflitos de interesse a declarar.

Agradecimentos

Os autores reconhecem a fonte de financiamento do NIH (NIH R01HL146114).

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Materiais

NameCompanyCatalog NumberComments
25 G NeedleCardinal Health1188825100Covidien Monoject Hypdermic Standard Needles: 25 G x 1" (0.508 mm x 2.5 cm) A
3-0 Vicryl Violet BraidedEthiconJ774D3-0 Suture
Adson-Brown ForcepsFine Science Tools11627-12Tip Shape: Straight, Tips: Shark Teeth, Tip Width: 1.4mm, Tip Dimensions: 2 x 1.4 m, Alloy / Material: Stainless Steel, Length: 12 cm
Bowman Style CageBraintree ScientificPOR-530Weight range: 250 up to 750 g; Maximum length: 9" (228 mm); Basic unit is constructed of .5" (123 mm) jeweled acrylic.
Castroviejo Needle HolderFine Science Tools12565-14Tip Shape: Straight, Tip Width: 1.5 mm, Clamping Length: 10 mm, Lock: Yes, Scissors: No, Alloy / Material: Stainless Steel, Length: 14 cm, Serrated:
Yes, Feature: Tungsten Carbide
Clip Lead 1m TP ShieldedBiopac Systems, IncLEAD110SShielded lead wires for EMG
Data Acquisition SoftwareLabChartLabChart 7.3.8Data recording, visualization, and analysis software for multi-channel recordings and real-time assessments
Data Analysis Software - Matlab 2023bMathworks, Inc.Version 23.2General purpose programming language for post hoc analysis
Dissecting KnifeFine Science Tools10056-12Cutting Edge: 4 mm, Thickness: 0.5 mm, Alloy / Material: Stainless Steel, Length: 12.5 cm, Blade Shape: Angled 30°
Dumont #3 ForcepsFine Science Tools11293-00Style: #3, Tip Shape: Straight, Tips: Standard, Tip Dimensions: 0.17 x 0.1 mm, Length: 12 cm, Alloy / Material: Dumostar
Electromyogram AmplifierBiopac Systems, IncEMG100CEMG amplifier
Friedman RongeurFine Science Tools16000-14Tip Shape: Curved, Cup Size: 2.5mm, Alloy / Material: Stainless Steel, Length: 13cm, Joint Action: Single
Friedman-Pearson RongeursFine Science Tools16021-14Alloy / Material: Stainless Steel, Length: 14cm, Joint Action: Single, Cup Size: 1mm, Tip Shape: Curved
Isolated Power Supply ModuleBiopac Systems, IncIPS100COperates 100-series amplifier modules indepdent of the Biopac Systems, Inc.'s MP series Data Acquisition System
Kelly HemostatsFine Science Tools13019-14Tips: Serrated, Tip Width: 1.5mm, Clamping Length: 22mm, Alloy / Material: Stainless Steel, Length: 14cm, Tip Shape: Curved
Knife CuretteV. MuellerVM101-4414Tip: Sharp, Tip Diameter: 2 mm
Micro Dissecting ScissorsBiomedical Research Instruments, Inc.11-2420Length: 4", Angle: Straight, Blade Length: 23 mm
Multistranded stainless steel wireCooner Wire, Inc.AS 631AWG 40; Overall diameter: 0.011 mm (with insulation), 0.008 mm (without insulation).
PowerLab 8/35ADInstrumentsPL3508Data acquisition system
Scalpel Blade #11Fine Science Tools10011-00Blade Shape: Angled, Cutting Edge: 20 mm, Thickness: 0.4 mm, Alloy / Material: Carbon Steel
Scalpel Handle #3Fine Science Tools10003-12Alloy / Material: Stainless Steel, Length: 12 cm
Sprague Dawley RatInotivOrder code: 002Sprague Dawley outbred rats (female and male)
Surgical MicroscopeOlympusSZ61Surgical microscope 
Suture Cutting ScissorsGeorge Tiemann & Co.110-1250SBAlloy / Material: Stainless Steel, Tip Shape: Straight, Tips: Sharp/Blunt, Length: 4.5"
Vannas Spring ScissorsFine Science Tools15000-08Tips: Sharp, Cutting Edge: 2.5 mm, Tip Diameter: 0.05 mm, Length: 8 cm, Alloy / Material: Stainless Steel, Serrated: No, Tip Shape: Straight
Weitlaner RetractorCodman50-5647Prongs: 2 x 3 Blunt, Length: 4.5"

Referências

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