Valutazione del recupero funzionale dell'attività del diaframma eupneico dopo emisezione unilaterale del midollo spinale cervicale nei ratti

Riepilogo

Le complicanze respiratorie sono la principale causa di morte nei soggetti con lesione del midollo spinale cervicale (cSCI). I modelli animali di cSCI sono essenziali per le valutazioni meccanicistiche e gli studi preclinici. Qui, introduciamo un metodo riproducibile per valutare il recupero funzionale dell'attività del muscolo diaframma (DIAm) dopo emisezione spinale C₂ unilaterale (C₂SH) nei ratti.

Abstract

Dopo la cSCI, l'attivazione del DIAm può essere influenzata a seconda dell'entità della lesione. Il presente manoscritto descrive un modello unilaterale di emisezione C₂ (C₂SH) di cSCI che interrompe l'attività elettromiografica (EMG) del diaframma omolaterale eupnico (iDIAm) durante la respirazione nei ratti. Per valutare il recupero del controllo motorio della DIAm, è necessario innanzitutto stabilire chiaramente l'entità del deficit dovuto al C₂SH. Verificando una perdita iniziale completa di iDIAm EMG durante la respirazione, il recupero successivo può essere classificato come assente o presente e l'entità del recupero può essere stimata utilizzando l'ampiezza dell'EMG. Inoltre, misurando la continua assenza di attività EMG iDIAm durante la respirazione dopo il periodo di shock spinale acuto successivo a C₂SH, il successo del C₂SH iniziale può essere convalidato. La misurazione dell'attività EMG del diaframma controlaterale (cDIAm) può fornire informazioni sugli effetti compensatori del C₂SH, che riflette anche la neuroplasticità. Inoltre, le registrazioni EMG DIAm di animali svegli possono fornire informazioni fisiologiche vitali sul controllo motorio del DIAm dopo C₂SH. Questo articolo descrive un metodo per un modello C₂SH rigoroso, riproducibile e affidabile di cSCI nei ratti, che è un'eccellente piattaforma per lo studio della neuroplasticità respiratoria, dell'attività compensatoria del cDIAm e delle strategie terapeutiche e farmaceutiche.

Introduzione

Ci sono più di 300.000 individui con lesione del midollo spinale (SCI) negli Stati Uniti, circa la metà dei quali ha lesioni cervicali¹. Queste lesioni provocano una significativa perdita di benessere e mettono a dura prova gli individui, le loro famiglie e il sistema sanitario. Fortunatamente, la maggior parte delle lesioni del midollo spinale sono incomplete, fornendo il potenziale per il rafforzamento dei percorsi risparmiati¹. Questa neuroplasticità può consentire il recupero di almeno alcune funzioni, inclusa l'attività DIAm, che è importante per i comportamenti ventilatori e non ventilatori. Pertanto, la promozione della neuroplasticità è una strada promettente di ricerca per aiutare le persone con lesione^{midollare 2}.

I modelli di roditori di lesione midollare hanno il potenziale per contribuire in modo sostanziale alla scoperta di trattamenti per migliorare la salute umana. Uno dei modelli classici di LM utilizzati per studiare la neuroplasticità è una transezione unilaterale (emisezione) del midollo spinale a C₂ (C₂SH), che lascia intatto il lato controlaterale ^{3,4,5,6,7,8,9,10,11,12,13}. L'effetto del C₂SH sulla produzione frenica e l'importanza di risparmiare le vie controlaterali sono state rivelate per la prima volta oltre cento anni fa da Porter¹², il cui articolo seminale ha gettato le basi per gli studi moderni sulla neuroplasticità respiratoria. Il modello C₂SH interrompe gli input discendenti dal gruppo respiratorio ventrale rostrale (rVRG) nel midollo, che contiene i neuroni premotori responsabili della trasmissione dell'output della generazione del ritmo respiratorio¹⁴. Questi neuroni premotori rVRG trasmettono anche l'impulso neurale eccitatorio ai motoneuroni frenici (Figura 1). Diversi ricercatori hanno adottato approcci diversi al modello C₂SH 10,11,15,16, il che può in parte spiegare parte della variabilità nel recupero tra gli studi. In breve, gli approcci variano in termini di risparmio dei funicoli dorsali, esecuzione di un'emisezione completa o esecuzione di una transezione parziale laterale che non interrompa completamente gli input discendenti dall'rVRG omolaterale. In generale, i modelli C₂SH sono particolarmente utili per lo studio della neuroplasticità respiratoria a causa dei tassi di recupero spontaneo dell'attività elettromiografica (EMG) dell'iDIAm eupneica nel tempo, che può essere migliorata da diversi fattori, tra cui la segnalazione neurotrofica 17,18,19,20,21. Tuttavia, una perdita iniziale di funzione, definita come il silenziamento dell'attività eupneica iDIAm EMG, deve essere stabilita prima che il recupero possa essere chiaramente classificato. Questa convalida dell'inattività al momento del C₂SH non viene effettuata in diversi studi 3,4,6,7,11,22,23.

Le valutazioni istologiche del midollo spinale asportato forniscono solo l'evidenza di un danno alla posizione appropriata delle vie bulbospinali eccitatorie omolaterali che innervano i motoneuroni frenici nel midollo spinale, ma l'istologia non sostituisce l'evidenza fisiologica (ad esempio, DIAm EMG). Inoltre, le valutazioni istologiche vengono eseguite in ex vivo in momenti terminali (spesso da diverse settimane a mesi dopo l'infortunio) e non forniscono informazioni "in tempo reale". Alcuni ricercatori hanno notato che l'entità della lesione è correlata alla quantità di deficit funzionale o alla sua mancanza 5,24,25,26. È importante notare che la validità di tali affermazioni dipende probabilmente fortemente da come viene classificata la "funzione" (cioè, quali sono i compiti funzionali e come vengono quantificati), e la variabilità tra gli studi evidenzia la difficoltà di produrre lesioni funzionalmente identiche tra gli animali. In effetti, i ricercatori hanno sottolineato che la relazione tra l'entità della lesione e la funzione locomotoria dei muscoli degli arti (quantificata dal punteggio di Basso, Beattie e Bresnahan (BBB)²⁴) non è lineare^27,28. In studi precedenti, non abbiamo trovato alcuna relazione tra l'entità del C₂SH e l'entità del recupero dell'attività EMG eupneica iDIAm post-lesione 10,29,30,31, sebbene altri ricercatori abbiano riportato una relazione tra la funzione ventilatoria e l'entità della sostanza bianca che risparmia ⁵. Pertanto, nel caso del modello C₂SH, un approccio per la convalida funzionale dell'inattività di iDIAm al momento dell'intervento chirurgico e preferibilmente all'inizio del decorso temporale degli esperimenti di lesione cronica del midollo spinale è sia vantaggioso che necessario.

Il presente articolo sottolinea l'uso di DIAm EMG per la conferma in tempo reale della perdita iniziale di DIAm EMG durante la respirazione dopo il C₂SH, nonché per successive valutazioni di conferma a 3 giorni (Giorno 3) dopo l'infortunio 18,21,31,32,33. In precedenti lavori con il modello C₂SH, sono state eseguite laparotomie ripetute per registrare DIAm EMG 10,13,30,34. Tuttavia, lavori più recenti hanno utilizzato elettrodi EMG cronici, che consentono la registrazione dell'EMG in ratti anestetizzati e svegli. Inoltre, gli elettrodi cronici riducono il rischio di pneumotorace e non richiedono laparotomie ripetute, che possono causare l'inibizione del DIAm ^35,36. Sebbene le versioni del modello C₂SH siano state utilizzate da molti ricercatori, la conferma del silenziamento dell'attività di iDIAm non è stata fatta al momento dell'intervento^chirurgico 3,4,6,7,11,22,23. Senza una tale conferma di inattività, è difficile sapere quale parte del successivo recupero attribuire alla neuroplasticità delle vie omolaterali rispetto a quelle controlaterali, che possono avere impatti differenziali. Questa è una considerazione importante perché l'unità neurale inspiratoria dall'rVRG ai motoneuroni frenici è principalmente omolaterale, con una perdita di circa il 50% degli input glutammatergici eccitatori ai motoneuroni frenici dopo C₂SH³³. Tuttavia, ci sono rimanenti input eccitatori inspiratori dall'rVRG controlaterale che decussano al di sotto del sito della lesione per innervare i motoneuroni frenici omolaterali e possono essere rafforzati attraverso la neuroplasticità per promuovere il recupero funzionale. Rimuovendo l'input eccitatorio omolaterale predominante ai motoneuroni frenici, l'attività eupneica dell'iDIAm EMG viene persa (almeno sotto anestesia), mentre l'attività del cDIAm continua e viene persino migliorata. La perdita di attività dell'iDIAm EMG durante la respirazione è quindi una misura del successo di un C₂SH (Figura 2).

Un certo livello di attività EMG iDIAm è presente già 1-4 giorni dopo C₂SH negli animali svegli^23,37. Inoltre, negli animali decerebrati, l'attività di iDIAm è presente da pochi minuti a ore dopo l'emisezione cervicale superiore ed è soppressa dall'anestesia³⁸. Inoltre, il successo del C₂SH è convalidato dalla conferma dell'assenza di attività EMG iDIAm durante la respirazione (eupnea) nei ratti anestetizzati il giorno 3 dopo l'infortunio. Studi di imaging confocale hanno confermato la perdita di input sinaptici glutammatergici sui motoneuroni frenici durante questa fase iniziale della lesione³⁷. Al 3° giorno dopo l'infortunio, se c'è una qualsiasi attività EMG eupneica residua, questa viene interpretata come prova di rimozione incompleta dell'unità inspiratoria discendente omolaterale dall'rVRG. Il presente articolo è diviso in tre sezioni: (1) registrazioni croniche di DIAm EMG, (2) C₂SH e (3) acquisizione di dati EMG in animali svegli e anestetizzati. Questo protocollo descrive un modello C₂SH rigoroso, riproducibile e affidabile di cSCI nei ratti, che è un'eccellente piattaforma per lo studio della neuroplasticità respiratoria, dell'attività compensatoria del cDIAm e delle strategie terapeutiche e farmaceutiche.

Protocollo

Questo protocollo è stato approvato dal Comitato istituzionale per la cura e l'uso degli animali della Mayo Clinic (numero di protocollo: A00003105-17-R23). Gli animali nel presente studio erano un mix di ratti Sprague-Dawley maschi e femmine di circa 3 mesi di età e di peso compreso tra 200 g e 350 g. I dettagli dei reagenti e delle attrezzature utilizzate nello studio sono elencati nella tabella dei materiali.

1. Impianto di elettrodi

1. Preparazione degli elettrodi
   1. Assicurarsi che l'attrezzatura menzionata sia disponibile: (1) filo di acciaio inossidabile multifilare, (2) bisturi con lama #11, (3) forbici, 4) microscopio da dissezione, (5) righello, (6) pinze, (7) aghi da 25 g, (8) 2 pinze (almeno una con una zona di crimpatura).
   2. I dettagli del processo di produzione degli elettrodi sono mostrati nella Figura 3. Ripetere questa procedura almeno due volte per gli elettrodi di registrazione differenziale accoppiati.
   3. Per prima cosa, misura e taglia 18 cm di filo di acciaio inossidabile.
   4. Fare un nodo base a rovescio a 4 cm da un'estremità del filo, come mostrato nella Figura 3; questo servirà come ancoraggio quando il lato corto del filo viene impiantato e suturato nel DIAm.
   5. Utilizzando un bisturi e un cannocchiale da dissezione chirurgica, rimuovere accuratamente 2 mm di isolamento immediatamente adiacenti al nodo sul lato più corto del filo. Prestare molta attenzione a non tagliare i fili del filo multifilare.
      NOTA: Questa parte non isolata funge da superficie conduttiva dell'elettrodo. In genere, la qualità del segnale inizia a degradarsi se tre o più fili vengono tagliati inavvertitamente e, in tal caso, l'elettrodo viene sostituito.
   6. Successivamente, spellare ~5 mm dall'estremità del lato corto del filo, che viene poi inserito nel lume di un ago da 25 G per creare uno strumento simile a un filo di sutura che verrà utilizzato per impiantare l'elettrodo nel DIAm.
      NOTA: A seconda delle preferenze personali, possono essere utilizzati anche aghi di calibro superiore (ad es. fino a 28 G). A causa del diametro più sottile degli aghi di calibro superiore, il rischio di pneumotorace può potenzialmente essere ridotto. Tuttavia, potrebbe anche essere più difficile inserire i fili multifilari nel lume più piccolo dell'ago.
   7. Per fare ciò, rimuovi un ago da 25 G dalla sua confezione e, usando entrambe le pinze, piega con cura l'ago a ~1 cm dall'estremità affilata smussata da un lato all'altro fino a quando non si rompe.
      NOTA: Questo processo non deve essere affrettato; In caso contrario, le forze di taglio possono causare la chiusura del lume dell'ago, richiedendo la ripetizione del processo.
   8. Inserire l'estremità spelata del filo nel lume dell'ago rotto da 1 cm, assicurandosi che l'ago poggi immediatamente adiacente alla parte isolata rimanente del filo.
   9. Assicurandosi che non vi sia alcuna parte non isolata tra l'ago e il lato più corto rimanente del filo, crimpare l'ago per collegarlo al filo.
   10. Quindi, usa le due pinze per piegare con cura l'ago attaccato per dargli una curvatura simile a quella di un ago da sutura chirurgico standard.
   11. Infine, spelare ~5 mm dall'estremità del lato lungo del filo (Figura 3). Dopo che gli elettrodi sono stati suturati nel DIAm, il lato lungo del filo verrà tunnellizzato per l'accesso esterno per consentire le registrazioni EMG DIAm.
   12. Ripetere il processo per creare un secondo elettrodo per le registrazioni differenziali.
2. Posizionamento dell'elettrodo EMG a membrana
   1. Prima dell'intervento chirurgico, sterilizzare o sterilizzare in autoclave tutte le apparecchiature chirurgiche, tra cui (1) tagliacapelli per piccoli animali, (2) bisturi con lama #11, (3) forbici chirurgiche, (4) pinze e (5) porta micro-aghi.
   2. Acquisisci una gabbia pulita e fornisci cibo, acqua, lettiera e arricchimento ambientale. Mettere da parte su un termoforo. Questa gabbia servirà per alloggiare l'animale dopo l'intervento chirurgico.
   3. Sterilizzare il campo operatorio con disinfettante idoneo e indossare dispositivi di protezione individuale (camici, cuffie, mascherina e guanti chirurgici). Mettere gli elettrodi precedentemente preparati in una pozza di alcol isopropilico al 70%.
   4. Posizionare un termoforo nell'area chirurgica per mantenere la temperatura corporea del ratto durante l'anestesia e l'intervento chirurgico. Coprire il termoforo con un asciugamano chirurgico sterilizzato.
   5. Pesare il ratto e calcolare il dosaggio appropriato dell'anestetico in base alle linee guida istituzionali per la cura e l'uso degli animali.
   6. Anestetizzare il ratto con un'iniezione intramuscolare degli arti posteriori di ketamina (80 mg/kg) e xilazina (10 mg/kg) o altro anestetico appropriato (seguendo protocolli istituzionalmente approvati). Iniettare buprenorfina a rilascio prolungato (1 mg/kg) e carprofene (5 mg/kg) prima dell'intervento. Procedi quando l'animale non risponde più al pizzicamento delle dita.
   7. Usa le tosatrici per radere il ratto dal processo xifoideo a circa metà strada fino agli arti posteriori. Inoltre, radere la parte posteriore del ratto dove gli elettrodi saranno esternalizzati oltre la portata dell'animale (di solito intorno alle scapole). Pulisci i peli in eccesso con un pezzo di garza.
   8. Preparare la pelle per l'incisione pulendola con una garza sterile imbevuta di clorexidina gluconato (4% peso/volume).
   9. Posizionare l'animale in posizione supina sul termoforo sterilizzato. Partendo dal processo xifoideo, utilizzare il bisturi e una lama #11 pulita per praticare un'incisione rostrocaudale di 4-5 cm. Questo dovrebbe esporre gli strati muscolari addominali sottostanti.
   10. Praticare un'altra incisione (3-4 cm) lungo la linea mediana negli strati muscolari per esporre il contenuto addominale. Fare attenzione a non tagliare gli organi addominali.
   11. Assicurarsi che la superficie addominale (cioè inferiore) del DIAm sia visibile, anche se il lato destro dell'animale sarà oscurato dal fegato.
   12. Usando il manico di un bisturi o un altro strumento contundente, spingere verso il basso il fegato e altri organi per esporre il lato addominale del DIAm.
   13. Preparare l'elettrodo per l'uso rimuovendolo dalla pozza di alcol isopropilico e lavandolo con soluzione fisiologica sterile. Quindi, utilizzando un supporto per micro-aghi, orientare uno degli elettrodi precedentemente preparati perpendicolarmente alle fibre muscolari nella regione medio-costale del DIAm. Le fibre muscolari si diffondono radialmente attraverso il DIAm.
       NOTA: Il diametro è sottile (~2 mm) e non deve essere forato. Piuttosto, l'obiettivo è quello di incorporare la parte non isolata del filo dell'elettrodo (Figura 3) all'interno del DIAm.
   14. Utilizzare il microscopio operatorio per inserire con cautela il filo di sutura dell'elettrodo (estremità dell'ago) nel DIAm. Lasciare che la curvatura dell'ago guidi l'elettrodo all'interno e poi all'esterno della superficie addominale del DIAm, assicurandosi che l'intera parte non isolata del filo sia completamente incorporata nel muscolo.
   15. Tirare con cautela l'ago fino a quando il nodo del filo si ancora nel DIAm. Assicurarsi che la parte non isolata (2 mm) del filo dell'elettrodo sia completamente all'interno del DIAm, con un nodo nel punto in cui l'ago è entrato per la prima volta nel DIAm.
   16. Quindi, tagliare l'ago dal filo dell'elettrodo e smaltirlo in un contenitore per oggetti taglienti.
   17. Usando due pinze, fare un nodo nel punto in cui l'ago di sutura (3-0) è uscito dal DIAm. Per fare ciò, legare un anello nel lato corto del filo, far scorrere l'anello verso il basso sulla superficie addominale del DIAm e stringere accuratamente l'anello in un nodo. L'elettrodo (parte non isolata) dovrebbe ora essere ancorato sia al punto di ingresso che a quello di uscita.
   18. Tagliare la parte in eccesso del lato più corto del filo.
   19. Seguire i passaggi 1.2.14-1.2.18 per suturare un altro elettrodo sullo stesso lato del DIAm, a ~3 mm di distanza dal primo.
   20. Eseguire l'impianto di coppie di elettrodi nell'emidiaframma opposto nello stesso modo.
   21. Quindi, assicurati che il lato più lungo dei fili degli elettrodi sia tutto al di fuori della cavità addominale e inizia a suturare (3-0) gli strati muscolari per chiudere l'addome. Per ogni coppia di elettrodi, fare un anello e ancorarlo.
       NOTA: Assicurarsi che rimangano 2-3 cm di filo all'interno della cavità addominale per consentire al ratto di allungarsi senza causare tensione sul DIAm.
   22. Pulire il sangue in eccesso con soluzione fisiologica e quindi suturare (3-0) lo strato muscolare in uno schema continuo per chiudere il peritoneo.
   23. Scavare un catetere da 16 G dalla pelle dorsale mediale del ratto fino alla pelle addominale aperta e tirare un paio di fili di elettrodi attraverso la parte posteriore del ratto.
   24. Ripetere il processo con un secondo catetere sull'altro lato e far passare la seconda coppia di fili dell'elettrodo.
   25. Sutura la pelle addominale con una sutura 3-0 in uno schema di sutura interrotto.
   26. Quindi, per ogni coppia, legare i fili degli elettrodi in un nodo e suturarli in posizione.
   27. Somministrare all'animale un'iniezione di soluzione salina sottocutanea (~1 ml per 50 g di massa animale). Metti l'animale in una gabbia pulita sopra un termoforo per riprenderlo.
       NOTA: La laparotomia può causare l'inibizione dell'attività DIAm^35,36. Attendere almeno 72 ore prima dell'analisi quantitativa di qualsiasi misurazione EMG.

2. Emisezione spinale cervicale

1. Preparare l'area chirurgica sterile come prima.
2. Prima dell'intervento chirurgico, sterilizzare in autoclave o tutte le apparecchiature chirurgiche. Attrezzatura richiesta: (1) tagliacapelli per piccoli animali, (2) bisturi con lama #11, (3) forbici chirurgiche, (4) pinze, (5) rongeur, (6) divaricatori, (7) coltello da dissezione angolato.
3. Circa 72 ore dopo l'impianto dell'elettrodo DIAm EMG, pesare il ratto e calcolare il dosaggio appropriato dell'anestetico in base alle linee guida istituzionali per la cura e l'uso degli animali.
4. Prima di anestetizzare il ratto, posizionare il ratto in una gabbia in stile Bowman e registrare l'EMG DIAm bilaterale come descritto nel passaggio 3.2.
5. Anestetizzare il ratto con un'iniezione intraperitoneale di ketamina (80 mg/kg) e xilazina (10 mg/kg) o altro anestetico appropriato secondo il protocollo del comitato istituzionale locale per la cura e l'uso degli animali. Prima dell'intervento, iniettare buprenorfina a rilascio prolungato (1 mg/kg) per via sottocutanea e carprofene (5 mg/kg) per via intraperitoneale.
6. Procedi quando l'animale non risponde più al pizzicamento delle dita. Controllare la profondità dell'anestesia con un pizzico di dita dei piedi ogni 15 minuti circa.
7. Prima di iniziare l'intervento chirurgico, posizionare il ratto in posizione prona e registrare l'EMG nel ratto anestetizzato come descritto al punto 3.3.
   NOTA: Assicurarsi che tutte le registrazioni vengano eseguite con il ratto nella stessa posizione.
8. Radere i peli dal collo all'incirca all'altezza delle orecchie e scendere fino alle scapole e rimuoverli con una garza bagnata.
9. Pulire la pelle con clorexidina gluconato (4% peso/volume) e coprire l'animale con coperture chirurgiche sterili (ad eccezione della parte superiore del dorso).
10. Con l'aiuto di un bisturi praticare un'incisione rostro-caudale di 4 cm. Ritrarre la pelle e tagliare il muscolo acromiotrapezio. Quindi sezionare il muscolo romboidale per esporre i muscoli spinali.
    NOTA: L'acromiotrapezio è il muscolo trapezio medio e le sue fibre muscolari corrono approssimativamente parallele alla colonna vertebrale. Il muscolo romboidale è esposto nel piano sotto l'acromiotrapezio e le sue fibre muscolari corrono in diagonale.
11. Ritrarre i muscoli spinali da C₁ a C₃.
    NOTA: I muscoli spinali corrono immediatamente adiacenti alla colonna vertebrale.
12. Eseguire con cura una laminectomia a C₂ utilizzando un rongeur mentre si guarda attraverso un microscopio operatorio per assicurarsi che non vengano danneggiate le arterie o i nervi principali.
13. Tagliare e ritrarre la dura madre a C_2.
14. Collegare i fili degli elettrodi esposti dalla schiena del ratto all'amplificatore durante l'esecuzione dell'emisezione spinale. Fare riferimento al passaggio 3 per maggiori dettagli.
15. Durante il monitoraggio della DIAm EMG, inserire il coltello da dissezione angolato appena sotto il punto in cui la radice dorsale entra nel midollo spinale e si seziona fino al punto medio della superficie ventrale nel modo mostrato nella Figura 2A.
    NOTA: Se si utilizza un termoforo elettronico, potrebbe essere necessario spegnerlo durante il monitoraggio dell'EMG per evitare rumore.
16. Entro pochi secondi da questa sezione, assicurarsi che l'attività eupnica DIAm EMG omolaterale alla lesione cessi e che sia evidente un aumento compensatorio dell'attività cDIAm EMG (Figura 2C).
17. Se l'attività eupneica dell'EMG iDIAm persiste, eseguire un altro taglio con la lama da dissezione, come evidenziato nella Figura 2C. Tuttavia, non tagliare la linea mediana; Il taglio sul lato controlaterale molto probabilmente porterà alla morte dell'animale.
18. Sutura i muscoli e poi la pelle con suture sterili (3-0).
19. Per mantenere l'idratazione, iniettare per via sottocutanea 1 ml di soluzione salina per 50 g di massa animale e porre l'animale in una gabbia pulita con un termoforo per il recupero. Monitorare l'animale mentre si riprende dall'intervento chirurgico.
20. Circa 72 ore dopo (Giorno 3 Post-C₂SH), registrare l'attività EMG nei ratti svegli secondo il passaggio 3.2 del protocollo. Fare attenzione a non danneggiare i punti sul dorso del ratto.
21. Successivamente, anestetizzare nuovamente il ratto (seguendo i protocolli istituzionalmente approvati), utilizzando una dose di anestetico più leggera di quella che sarebbe necessaria per un piano chirurgico (tra 1/3 e 1/2 di una dose normale). Dosi aggiuntive possono essere somministrate a condizione che i ratti mostrino un riflesso corneale intatto e rispondano al pizzicamento delle dita.
22. Monitorare l'attività DIAm EMG seguendo il passaggio 3 del protocollo.
    NOTA: Posizionare il ratto nella stessa posizione utilizzata per la valutazione iniziale dell'attività EMG di iDIAm.
23. Se l'attività eupneica dell'iDIAm EMG (cioè l'attività in fase con l'attività inspiratoria del cDIAm EMG) è assente il giorno 3, concludere che il C₂SH iniziale ha avuto successo e includere lo stesso animale per ulteriori analisi.

3. Acquisizione e analisi dei dati

1. Impostazioni generali ed estrazione dei dati
   1. Impostare i filtri passa-banda del preamplificatore a 100 Hz (passa-alto) e 1000 Hz (passa-basso).
      NOTA: Queste impostazioni del filtro eliminano gli artefatti di movimento e riducono notevolmente il rumore a 60 Hz e la contaminazione ECG (che ha una potenza di picco a ~75 Hz) pur mantenendo la stragrande maggioranza del contenuto di frequenza del segnale DIAm EMG intramuscolare. Basato sulla teoria di Nyquist, digitalizzare con una frequenza di campionamento di 2000 Hz per evitare l'aliasing e consentire una risoluzione adeguata per notare l'attività dell'unità motoria nell'EMG composto. Se si eseguono analisi specializzate del contenuto di frequenza della gamma di frequenza inferiore a 100 Hz, è importante impostare le impostazioni del filtro del preamplificatore per garantire che le frequenze di interesse non vengano filtrate.
   2. Monitora due canali (EMG dell'emidiaframma sinistro e destro) nel software di visualizzazione su un computer e salva i dati in un formato appropriato per ulteriori analisi.
   3. Raccogli almeno 1-2 minuti di registrazioni euneiche per avere dati sufficienti per le analisi.
   4. Assicurarsi che i dati vengano raccolti in tre o più punti temporali:
      1. Prima di C₂SH, stabilire una registrazione eupnica di base in condizioni di veglia e anestetizzate.
      2. Durante l'intervento chirurgico C₂SH per stabilire il silenziamento dell'attività EMG eupneica iDIAm in condizioni anestetizzate.
      3. Al giorno 3 post-C₂SH per confermare che l'assenza di attività EMG eupneica iDIAm persiste e stabilire un punto iniziale dell'entità del deficit negli animali svegli che non è influenzato dallo shock spinale ^2,39 o dalla somministrazione di depressivi respiratori come la buprenorfina.
   5. Analizza le registrazioni DIAm EMG utilizzando qualsiasi software che consenta di eseguire calcoli su segnali digitalizzati (ad esempio, Matlab, Python, R). Il processo di base è il seguente:
      1. Carica i file EMG grezzi. A seconda delle impostazioni di filtraggio, potrebbe essere necessario tenere conto di un offset CC nel segnale.
         NOTA: Una soluzione semplice consiste nel sottrarre la media del segnale EMG grezzo da se stesso.
      2. Calcola la radice quadrata media del segnale EMG con una finestra mobile di 50 ms. Questo può essere fatto spostando una finestra di calcolo di 50 ms in avanti di un punto di campionamento alla volta fino a raggiungere la fine del segnale.
         NOTA: Le analisi dei singoli eventi DIAm EMG forniscono la massima potenza statistica e consentono il clustering dell'attività eupneica e non eupneaica. Pertanto, il rilevamento dell'insorgenza e dell'offset dei singoli respiri nell'EMG DIAm è fondamentale, come evidenziato in un precedente rapporto⁴⁰.
   6. Eseguire il filtraggio dell'attività eupneica visualizzando gli istogrammi della frequenza respiratoria istantanea e della durata del burst, come mostrato in un precedente report⁴¹.
2. Registrazioni da sveglio.
   1. Esegui registrazioni da sveglio mettendo i ratti in una gabbia per roditori in stile Bowman. Una gabbia cilindrica in stile Bowman può ospitare ratti adulti fino a 750 g.
   2. Svita le aste di metallo su un lato della gabbia in stile Bowman e convinci delicatamente il topo a entrare. Riavvitare le aste di metallo, intrappolando il topo nella gabbia cilindrica.
      NOTA: Acclimatare i ratti alla gabbia per almeno 30 minuti prima di procedere con la registrazione. Se possibile, è meglio acclimatare i ratti alla gabbia in stile Bowman per più giorni prima di qualsiasi misurazione. È buona norma fornire bocconcini mentre i ratti sono nella gabbia durante questa fase di acclimatazione.
   3. Per ridurre al minimo gli stimoli visivi esterni, usa un tovagliolo di carta o un oggetto simile per creare una tenda attorno alla parte anteriore della gabbia dove si trova la testa del topo. Inoltre, riduci al minimo i rumori forti e garantisci il comfort fisico del ratto in tutti i punti.
      NOTA: I segni evidenti di disagio includono irrequietezza, respirazione rapida e lotta contro la gabbia. Se si osserva uno di questi segni, potrebbe essere necessario riportare il ratto nella gabbia domestica e tentare di registrare quando il ratto è più calmo.
   4. Per i ratti più piccoli (<300 g), inserire materiali di riempimento (ad es. tovagliolo di carta, batuffoli di cotone) negli spazi extra della gabbia per scoraggiare il ratto dal girare di 180 gradi.
   5. Dopo che il ratto si è acclimatato, collegare con cura i fili che escono dal dorso del ratto a un preamplificatore, che alimenta i segnali analogici in un convertitore analogico-digitale, e seguire le procedure descritte al punto 3.1.
3. Registrazioni anestetizzate
   1. Metti i ratti nella stessa posizione ogni volta, preferibilmente incline a imitare più da vicino la postura del ratto sveglio.
   2. Collegare i fili che escono dal dorso di ratto a un preamplificatore, che alimenta i segnali analogici in un convertitore analogico-digitale, e seguire le procedure descritte al punto 3.1.
4. Recupero degli animali
   1. Metti i ratti all'interno di una gabbia per topi vuota e pulita, senza lettiera per il recupero.
   2. Posiziona la gabbia su un termoforo.
   3. Monitorare il ratto a intervalli regolari (<15 minuti) per le prime 3 ore o fino a quando il ratto inizia a muoversi. Monitorare a intervalli meno regolari (30 minuti) fino a quando l'animale non si sveglia di nuovo.
   4. Dopo che il ratto è deambulante, mettilo in una gabbia pulita con lettiera, accesso a cibo e acqua e arricchimento ambientale.
   5. Continuare a monitorare il ratto almeno una volta al giorno per tutto il tempo dell'esperimento. Prestare particolare attenzione alle variazioni di peso/capacità di alimentazione, nonché all'integrità dei siti di incisione e delle suture.

Risultati

L'approccio presentato in questo articolo riduce al minimo la variabilità interoperatore stabilendo criteri chiari per la valutazione dell'EMG DIAm in un modello di ratto di C₂SH. In primo luogo, deve essere osservata la cessazione dell'attività EMG eupneica iDIAm immediatamente dopo C₂SH, come mostrato nella Figura 2. In caso contrario, è possibile eseguire una transezione secondaria fino alla scomparsa dell'attività eupneica dell'iDIAm. In secondo luogo, il giorno...

Discussione

C₂ emisezione spinale
La procedura descritta in questo articolo enfatizza le valutazioni dell'attività DIAm EMG che fungono da convalida di una lesione spinale C₂ che seziona i funicoli laterali e ventrali risparmiando i funicoli dorsali (Figura 2A). L'approccio chirurgico proposto ha due vantaggi principali. In primo luogo, risparmia i funiculi dorsali, che preservano la funzione deambulatoria nei ratti, pur continuando a recidere gli input omolate...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
25 G Needle	Cardinal Health	1188825100	Covidien Monoject Hypdermic Standard Needles: 25 G x 1" (0.508 mm x 2.5 cm) A
3-0 Vicryl Violet Braided	Ethicon	J774D	3-0 Suture
Adson-Brown Forceps	Fine Science Tools	11627-12	Tip Shape: Straight, Tips: Shark Teeth, Tip Width: 1.4mm, Tip Dimensions: 2 x 1.4 m, Alloy / Material: Stainless Steel, Length: 12 cm
Bowman Style Cage	Braintree Scientific	POR-530	Weight range: 250 up to 750 g; Maximum length: 9" (228 mm); Basic unit is constructed of .5" (123 mm) jeweled acrylic.
Castroviejo Needle Holder	Fine Science Tools	12565-14	Tip Shape: Straight, Tip Width: 1.5 mm, Clamping Length: 10 mm, Lock: Yes, Scissors: No, Alloy / Material: Stainless Steel, Length: 14 cm, Serrated: Yes, Feature: Tungsten Carbide
Clip Lead 1m TP Shielded	Biopac Systems, Inc	LEAD110S	Shielded lead wires for EMG
Data Acquisition Software	LabChart	LabChart 7.3.8	Data recording, visualization, and analysis software for multi-channel recordings and real-time assessments
Data Analysis Software - Matlab 2023b	Mathworks, Inc.	Version 23.2	General purpose programming language for post hoc analysis
Dissecting Knife	Fine Science Tools	10056-12	Cutting Edge: 4 mm, Thickness: 0.5 mm, Alloy / Material: Stainless Steel, Length: 12.5 cm, Blade Shape: Angled 30°
Dumont #3 Forceps	Fine Science Tools	11293-00	Style: #3, Tip Shape: Straight, Tips: Standard, Tip Dimensions: 0.17 x 0.1 mm, Length: 12 cm, Alloy / Material: Dumostar
Electromyogram Amplifier	Biopac Systems, Inc	EMG100C	EMG amplifier
Friedman Rongeur	Fine Science Tools	16000-14	Tip Shape: Curved, Cup Size: 2.5mm, Alloy / Material: Stainless Steel, Length: 13cm, Joint Action: Single
Friedman-Pearson Rongeurs	Fine Science Tools	16021-14	Alloy / Material: Stainless Steel, Length: 14cm, Joint Action: Single, Cup Size: 1mm, Tip Shape: Curved
Isolated Power Supply Module	Biopac Systems, Inc	IPS100C	Operates 100-series amplifier modules indepdent of the Biopac Systems, Inc.'s MP series Data Acquisition System
Kelly Hemostats	Fine Science Tools	13019-14	Tips: Serrated, Tip Width: 1.5mm, Clamping Length: 22mm, Alloy / Material: Stainless Steel, Length: 14cm, Tip Shape: Curved
Knife Curette	V. Mueller	VM101-4414	Tip: Sharp, Tip Diameter: 2 mm
Micro Dissecting Scissors	Biomedical Research Instruments, Inc.	11-2420	Length: 4", Angle: Straight, Blade Length: 23 mm
Multistranded stainless steel wire	Cooner Wire, Inc.	AS 631	AWG 40; Overall diameter: 0.011 mm (with insulation), 0.008 mm (without insulation).
PowerLab 8/35	ADInstruments	PL3508	Data acquisition system
Scalpel Blade #11	Fine Science Tools	10011-00	Blade Shape: Angled, Cutting Edge: 20 mm, Thickness: 0.4 mm, Alloy / Material: Carbon Steel
Scalpel Handle #3	Fine Science Tools	10003-12	Alloy / Material: Stainless Steel, Length: 12 cm
Sprague Dawley Rat	Inotiv	Order code: 002	Sprague Dawley outbred rats (female and male)
Surgical Microscope	Olympus	SZ61	Surgical microscope
Suture Cutting Scissors	George Tiemann & Co.	110-1250SB	Alloy / Material: Stainless Steel, Tip Shape: Straight, Tips: Sharp/Blunt, Length: 4.5"
Vannas Spring Scissors	Fine Science Tools	15000-08	Tips: Sharp, Cutting Edge: 2.5 mm, Tip Diameter: 0.05 mm, Length: 8 cm, Alloy / Material: Stainless Steel, Serrated: No, Tip Shape: Straight
Weitlaner Retractor	Codman	50-5647	Prongs: 2 x 3 Blunt, Length: 4.5"