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Résumé

Les complications respiratoires sont la principale cause de décès chez les personnes atteintes d’une lésion de la moelle épinière cervicale (SCI). Les modèles animaux de SCIc sont essentiels pour les évaluations mécanistes et les études précliniques. Ici, nous introduisons une méthode reproductible pour évaluer la récupération fonctionnelle de l’activité du muscle du diaphragme (DIAm) après une hémisection spinale unilatérale C2 (C2SH) chez le rat.

Résumé

Après une LMEC, l’activation du DIAm peut être affectée en fonction de l’étendue de la lésion. Le présent manuscrit décrit un modèle unilatéral d’hémisection C2 (C2SH) de cSCI qui perturbe l’activité électromyographique (EMG) du diaphragme ipsilatéral eupnéique (iDIAm) pendant la respiration chez le rat. Pour évaluer la récupération de la commande motrice DIAm, il faut d’abord établir clairement l’ampleur du déficit dû au C2SH. En vérifiant une perte initiale complète d’EMG iDIAm pendant la respiration, la récupération ultérieure peut être classée comme absente ou présente, et l’étendue de la récupération peut être estimée à l’aide de l’amplitude de l’EMG. De plus, en mesurant l’absence continue d’activité EMG iDIAm pendant la respiration après la période de choc rachidien aigu après C2SH, le succès de l’activité initiale C2SH peut être validé. La mesure de l’activité EMG du diaphragme controlatéral (cDIAm) peut fournir des informations sur les effets compensatoires du C2SH, ce qui reflète également la neuroplasticité. De plus, les enregistrements EMG DIAm d’animaux éveillés peuvent fournir des informations physiologiques vitales sur le contrôle moteur des DIAm après C2SH. Cet article décrit une méthode pour un modèleC2SH rigoureux, reproductible et fiable de cSCI chez le rat, qui constitue une excellente plate-forme pour étudier la neuroplasticité respiratoire, l’activité compensatoire de cDIAm et les stratégies thérapeutiques et pharmaceutiques.

Introduction

Il y a plus de 300 000 personnes atteintes de lésions de la moelle épinière (LME) aux États-Unis, dont environ la moitié ont des lésions cervicales1. Ces blessures entraînent une perte importante de bien-être et exercent une pression financière sur les individus, leurs familles et le système de santé. Heureusement, la majorité des lésions médullaires sont incomplètes, ce qui permet de renforcer les voies épargnées1. Cette neuroplasticité peut permettre la récupération d’au moins une partie de la fonction, y compris l’activité DIAm, qui est importante pour les comportements ventilatoires et non ventilatoires. Ainsi, la promotion de la neuroplasticité est une piste de recherche prometteuse pour aider les personnes atteintes de LME2.

Les modèles de LME chez les rongeurs ont le potentiel de contribuer de manière substantielle à la découverte de traitements visant à améliorer la santé humaine. L’un des modèles classiques de LME utilisés pour étudier la neuroplasticité est une transsection unilatérale (hémisection) de la moelle épinière en C2 (C2SH), qui laisse le côté controlatéral intact 3,4,5,6,7,8,9,10,11,12,13. L’effet du C2SH sur le débit phrénique et l’importance des voies controlatérales épargnées ont été révélés pour la première fois il y a plus de cent ans par Porter12, dont l’article fondateur a jeté les bases des études modernes sur la neuroplasticité respiratoire. Le modèle C2SH interrompt les entrées descendantes du groupe respiratoire ventral rostral (rVRG) dans la moelle, qui contient les neurones prémoteurs responsables de la transmission de la production du rythme respiratoire14. Ces neurones prémoteurs rVRG transmettent également l’entraînement neuronal excitateur aux motoneurones phréniques (Figure 1). Plusieurs chercheurs ont adopté des approches différentes du modèle C2SH 10,11,15,16, ce qui peut expliquer en partie la variabilité de la récupération d’une étude à l’autre. En bref, les approches varient en termes d’épargne des funicules dorsaux, d’exécution d’une hémisection complète ou d’exécution d’une section partielle latérale qui n’interrompt pas complètement les entrées descendantes du rVRG ipsilatéral. En général, les modèles C2SH sont particulièrement utiles pour étudier la neuroplasticité respiratoire en raison des taux de récupération spontanée de l’activité électromyographique (EMG) eupnéique iDIAm au fil du temps, qui peuvent être améliorés par plusieurs facteurs, dont la signalisation neurotrophique 17,18,19,20,21. Cependant, une perte de fonction initiale, définie comme l’inhibition de l’activité eupnéique de l’EMG iDIAm, doit d’abord être établie avant que la récupération puisse être clairement classifiée. Cette validation de l’inactivité au moment deC2SH n’est pas faite dans plusieurs études 3,4,6,7,11,22,23.

Les évaluations histologiques de la moelle épinière excisée ne fournissent que des signes de dommages à l’emplacement approprié des voies bulbospinales excitatrices ipsilatérales innervant les motoneurones phréniques dans la moelle épinière, mais l’histologie ne remplace pas les preuves physiologiques (par exemple, DIAm EMG). De plus, les évaluations histologiques sont effectuées in ex vivo à des moments terminaux (souvent plusieurs semaines à quelques mois après la blessure) et ne fournissent pasd’informations en temps réel. Certains chercheurs ont noté que l’ampleur de la lésion est liée à la quantité de déficit fonctionnel ou à l’absence de déficit fonctionnel 5,24,25,26. Il est important de noter que la validité de telles affirmations dépend probablement fortement de la façon dont la « fonction » est classifiée (c’est-à-dire ce que sont les tâches fonctionnelles et comment elles sont quantifiées), et la variabilité entre les études met en évidence la difficulté de produire des lésions fonctionnellement identiques chez les animaux. En effet, les chercheurs ont souligné que la relation entre l’étendue de la blessure et la fonction locomotrice des muscles des membres (quantifiée par le score de Basso, Beattie et Bresnahan (BBB)24) n’est pas linéaire27,28. Dans des études antérieures, nous n’avons trouvé aucune relation entre l’étendue du C2SH et l’étendue de la récupération de l’activité EMG eupnéique iDIAm après une lésion 10,29,30,31, bien que d’autres chercheurs aient rapporté une relation entre la fonction ventilatoire et l’étendue de la substance blanche épargnant 5. Ainsi, dans le cas du modèle C2SH, une approche de validation fonctionnelle de l’inactivité iDIAm au moment de l’intervention et de préférence au début des expériences de lésions chroniques de la moelle épinière est à la fois bénéfique et nécessaire.

Le présent article souligne l’utilisation de l’EMG DIAm pour la confirmation en temps réel de la perte initiale d’EMG DIAm pendant la respiration après le C2SH ainsi que pour les évaluations de confirmation ultérieures 3 jours (jour 3) après la lésion 18,21,31,32,33. Dans des travaux antérieurs avec le modèle C2SH, des laparotomies répétées ont été effectuées pour enregistrer DIAm EMG 10,13,30,34. Cependant, des travaux plus récents ont utilisé des électrodes EMG chroniques, qui permettent d’enregistrer l’EMG chez des rats anesthésiés et éveillés. De plus, les électrodes chroniques réduisent le risque de pneumothorax et ne nécessitent pas de laparotomies répétées, ce qui peut entraîner une inhibition du DIAm35,36. Bien que des versions du modèle C2SH aient été utilisées par de nombreux chercheurs, la confirmation de l’inactivation de l’activité iDIAm n’a pas été faite au moment de la chirurgie 3,4,6,7,11,22,23. En l’absence d’une telle confirmation de l’inactivité, il est difficile de savoir quelle partie de la récupération ultérieure attribuer à la neuroplasticité des voies ipsilatérales par rapport aux voies controlatérales, qui peuvent avoir des impacts différentiels. Il s’agit d’une considération importante car l’entraînement neuronal inspiratoire du rVRG vers les motoneurones phréniques est principalement ipsilatéral, avec une perte d’environ 50% des entrées glutamatergiques excitatrices vers les motoneurones phréniques après C2SH33. Cependant, il reste des entrées excitatrices inspiratoires du rVRG controlatéral qui décussent sous le site de la lésion pour innerver les motoneurones phréniques ipsilatéraux et peuvent être renforcées par la neuroplasticité pour favoriser la récupération fonctionnelle. En supprimant l’entrée excitatrice ipsilatérale prédominante dans les motoneurones phréniques, l’activité EMG eupnéique iDIAm est perdue (au moins sous anesthésie), tandis que l’activité de la cDIAm se poursuit et est même améliorée. La perte d’activité EMG iDIAm pendant la respiration est donc une mesure de la réussite d’un C2SH (Figure 2).

Un certain niveau d’activité EMG iDIAm est présent dès 1 à 4 jours après C2SH chezles animaux éveillés23,37. De plus, chez les animaux décérébrés, l’activité iDIAm est présente dans les minutes à quelques heures qui suivent l’hémisection cervicale supérieure et est supprimée par l’anesthésie38. De plus, le succès du C2SH est validé en confirmant l’absence d’activité EMG iDIAm pendant la respiration (eupnée) chez les rats anesthésiés le 3e jour après la blessure. Des études d’imagerie confocale ont confirmé la perte d’entrées synaptiques glutamatergiques sur les motoneurones phréniques au cours de cette phase initiale de la lésion37. Au jour 3 après la blessure, s’il y a une activité résiduelle de l’EMG eupnéic iDIAm, cela est interprété comme une preuve d’élimination incomplète de l’entraînement inspiratoire descendant ipsilatéral du rVRG. Le présent article est divisé en trois sections : (1) enregistrements EMG DIAm chroniques, (2) C2SH et (3) acquisition de données EMG chez les animaux éveillés et anesthésiés. Ce protocole décrit un modèleC2SH rigoureux, reproductible et fiable de cSCI chez le rat, qui constitue une excellente plate-forme pour l’étude de la neuroplasticité respiratoire, de l’activité compensatoire de cDIAm, des stratégies thérapeutiques et pharmaceutiques.

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Protocole

Ce protocole a été approuvé par le Comité institutionnel de soins et d’utilisation des animaux de la Mayo Clinic (numéro de protocole : A00003105-17-R23). Les animaux de la présente étude étaient un mélange de rats Sprague-Dawley mâles et femelles âgés d’environ 3 mois et pesant entre 200 g et 350 g. Les détails des réactifs et de l’équipement utilisés dans l’étude sont énumérés dans la table des matériaux.

1. Implantation d’électrodes

  1. Préparation des électrodes
    1. Assurez-vous que l’équipement mentionné est disponible : (1) fil d’acier inoxydable multibrin, (2) scalpel avec lame #11, (3) ciseaux, 4) microscope de dissection, (5) règle, (6) pinces, (7) aiguilles de 25 g, (8) 2 pinces (au moins une avec une zone de sertissage).
    2. Les détails du processus de fabrication des électrodes sont illustrés à la figure 3. Répétez ce processus au moins deux fois pour les électrodes d’enregistrement différentielles appariées.
    3. Tout d’abord, mesurez et coupez 18 cm du fil d’acier inoxydable.
    4. Faites un nœud simple de base à 4 cm d’une extrémité du fil, comme illustré à la figure 3 ; cela servira d’ancrage lorsque le côté court du fil sera implanté et suturé dans le DIAm.
    5. À l’aide d’un scalpel et d’un endoscope de dissection chirurgicale, dénudez soigneusement 2 mm d’isolant immédiatement adjacent au nœud sur le côté le plus court du fil. Faites très attention à ne pas couper les brins du fil multibrin.
      REMARQUE : Cette partie non isolée sert de surface conductrice de l’électrode. En général, la qualité du signal commence à se dégrader si trois brins ou plus sont coupés par inadvertance, et si c’est le cas, l’électrode est remplacée.
    6. Ensuite, dénudez une bande de ~5 mm de l’extrémité du côté court du fil, qui est ensuite inséré dans la lumière d’une aiguille de 25 G pour fabriquer un outil semblable à un fil de suture qui sera utilisé pour implanter l’électrode dans le DIAm.
      REMARQUE : Des aiguilles de calibre supérieur (par exemple, jusqu’à 28 G) peuvent également être utilisées selon les préférences personnelles. En raison du diamètre plus mince des aiguilles de calibre supérieur, le risque de pneumothorax peut potentiellement être réduit. Cependant, il peut également être plus difficile d’insérer les fils multibrins dans la plus petite lumière de l’aiguille.
    7. Pour ce faire, retirez une aiguille de 25 G de son emballage et, à l’aide des deux pinces, pliez soigneusement l’aiguille à ~1 cm de l’extrémité biseautée pointue d’un côté à l’autre jusqu’à ce qu’elle se brise.
      REMARQUE : Ce processus ne doit pas être précipité ; Sinon, les forces de cisaillement peuvent provoquer la fermeture de la lumière de l’aiguille, ce qui nécessite la répétition du processus.
    8. Insérez l’extrémité dénudée du fil dans la lumière de l’aiguille cassée de 1 cm, en vous assurant que l’aiguille repose immédiatement à côté de la partie isolée restante du fil.
    9. En vous assurant qu’il n’y a pas de partie non isolée entre l’aiguille et le côté le plus court restant du fil, sertissez l’aiguille pour la fixer au fil.
    10. Ensuite, utilisez les deux pinces pour plier soigneusement l’aiguille attachée afin de lui donner une courbure similaire à celle d’une aiguille de suture chirurgicale standard.
    11. Enfin, dénudez à ~5 mm de l’extrémité du côté long du fil (Figure 3). Une fois les électrodes suturées dans le DIAm, le côté long du fil sera tunnelisé pour un accès externe afin de permettre les enregistrements EMG DIAm.
    12. Répétez le processus pour fabriquer une deuxième électrode pour les enregistrements différentiels.
  2. Placement de l’électrode EMG du diaphragme
    1. Avant l’intervention chirurgicale, stérilisez ou autoclavez tout le matériel chirurgical, y compris (1) une tondeuse à poils de petits animaux, (2) un scalpel avec lame #11, (3) des ciseaux chirurgicaux, (4) une pince et (5) un porte-micro-aiguille.
    2. Procurez-vous une cage propre et fournissez-lui de la nourriture, de l’eau, de la litière et un enrichissement de l’environnement. Réserver sur un coussin chauffant. Cette cage servira à loger l’animal après l’opération.
    3. Stérilisez le champ opératoire avec un désinfectant approprié et mettez un équipement de protection individuelle (blouses, casquettes, masque et gants chirurgicaux). Placez les électrodes préalablement préparées dans une piscine d’alcool isopropylique à 70 %.
    4. Placez un coussin chauffant dans la zone chirurgicale pour maintenir la température corporelle du rat pendant l’anesthésie et la chirurgie. Couvrez le coussin chauffant avec une serviette chirurgicale stérilisée.
    5. Pesez le rat et calculez la dose d’anesthésique appropriée en fonction des directives de l’établissement en matière de soins et d’utilisation des animaux.
    6. Anesthésier le rat à l’aide d’une injection intramusculaire de kétamine (80 mg/kg) et de xylazine (10 mg/kg) ou d’un autre anesthésique approprié (selon les protocoles approuvés par l’établissement). Injecter de la buprénorphine à libération prolongée (1 mg/kg) et du carprofène (5 mg/kg) avant l’opération. Procéder une fois que l’animal ne répond plus au pincement des orteils.
    7. Utilisez une tondeuse pour raser le rat de l’apophyse xiphoïde jusqu’à environ la moitié des membres postérieurs. Rasez également le dos du rat où les électrodes seront extériorisées hors de la portée de l’animal (généralement autour des omoplates). Nettoyez l’excès de poils avec un morceau de gaze.
    8. Préparez la peau pour l’incision en la nettoyant avec de la gaze stérile trempée dans du gluconate de chlorohexidine (4 % en poids par volume).
    9. Placez l’animal en position couchée sur le coussin chauffant stérilisé. En commençant par le processus xiphoïde, utilisez le scalpel et une lame #11 propre pour faire une incision rostrocaudale de 4 à 5 cm. Cela devrait exposer les couches musculaires abdominales sous-jacentes.
    10. Faites une autre incision (3-4 cm) le long de la ligne médiane dans les couches musculaires pour exposer le contenu abdominal. Veillez à ne pas couper les organes abdominaux.
    11. Assurez-vous que la surface abdominale (c’est-à-dire inférieure) du DIAm est visible, bien que le côté droit de l’animal soit masqué par le foie.
    12. À l’aide d’un manche de scalpel ou d’un autre instrument contondant, enfoncez le foie et d’autres organes pour exposer la face abdominale du DIAm.
    13. Préparez l’électrode pour l’utilisation en la retirant de la piscine d’alcool isopropylique et en la lavant avec une solution saline stérile. Ensuite, à l’aide d’un porte-micro-aiguille, orientez l’une des électrodes préalablement préparées perpendiculairement aux fibres musculaires dans la région mi-costale du DIAm. Les fibres musculaires s’étendent radialement sur le DIAm.
      REMARQUE : Le DIAm est mince (~2 mm) et ne doit pas être perforé. L’objectif est plutôt d’intégrer la partie non isolée du fil d’électrode (Figure 3) dans le DIAm.
    14. Utilisez le microscope chirurgical pour insérer avec précaution le fil de suture de l’électrode (extrémité de l’aiguille) dans le DIAm. Laissez la courbure de l’aiguille guider l’électrode dans puis hors de la surface abdominale du DIAm, en veillant à ce que toute la partie non isolée du fil soit entièrement intégrée dans le muscle.
    15. Tirez doucement l’aiguille jusqu’à ce que le nœud du fil s’ancre dans le DIAm. Assurez-vous que la partie non isolée (2 mm) du fil de l’électrode est complètement à l’intérieur du DIAm, avec un nœud à l’endroit où l’aiguille est entrée pour la première fois dans le DIAm.
    16. Ensuite, coupez l’aiguille du fil de l’électrode et jetez-la dans un récipient pour objets tranchants.
    17. À l’aide de deux pinces, faites un nœud à l’endroit où l’aiguille de suture (3-0) est sortie du DIAm. Pour ce faire, attachez une boucle sur le côté court du fil, faites glisser la boucle vers la surface abdominale du DIAm et serrez soigneusement la boucle en un nœud. L’électrode (partie non isolée) doit maintenant être ancrée à son point d’entrée et de sortie.
    18. Coupez la partie excédentaire du côté le plus court du fil.
    19. Suivez les étapes 1.2.14 à 1.2.18 pour suturer une autre électrode du même côté du DIAm, à ~3 mm de la première.
    20. Effectuez l’implantation de la paire d’électrodes dans l’hémidiaphragme opposé de la même manière.
    21. Ensuite, assurez-vous que le côté le plus long des fils d’électrodes est entièrement à l’extérieur de la cavité abdominale et commencez à suturer (3-0) les couches musculaires pour fermer l’abdomen. Pour chaque paire d’électrodes, faites une boucle et ancrez-la.
      REMARQUE : Assurez-vous que 2-3 cm de fil sont laissés dans la cavité abdominale pour permettre au rat de s’étirer sans provoquer de tension sur le DIAm.
    22. Nettoyez l’excès de sang avec une solution saline, puis suturez (3-0) la couche musculaire de manière continue pour fermer le péritoine.
    23. Creusez un cathéter de 16 G de la peau dorsale médiale du rat jusqu’à la peau abdominale ouverte et tirez une paire de fils d’électrodes jusqu’à l’arrière du rat.
    24. Répétez le processus avec un deuxième cathéter de l’autre côté et tirez la deuxième paire de fils d’électrode à travers.
    25. Suturez la peau abdominale avec une suture 3-0 dans un motif de suture interrompu.
    26. Ensuite, pour chaque paire, faites un nœud avec les fils d’électrode et suturez-les en place.
    27. Fournir à l’animal une injection saline sous-cutanée (~1 ml pour 50 g de masse animale). Mettez l’animal dans une cage propre sur un coussin chauffant pour récupérer.
      REMARQUE : La laparotomie peut provoquer une inhibition de l’activité DIAm35,36. Attendez au moins 72 h avant l’analyse quantitative de toute mesure EMG.

2. Hémisection spinale cervicale

  1. Préparez la zone chirurgicale stérile comme précédemment.
  2. Avant la chirurgie, autoclavez ou stérilisez tout le matériel chirurgical. Matériel requis : (1) tondeuse à poils de petits animaux, (2) scalpel avec lame #11, (3) ciseaux chirurgicaux, (4) pinces, (5) rongeurs, (6) écarteurs, (7) couteau de dissection coudé.
  3. Environ 72 h après l’implantation de l’électrode DIAm EMG, peser le rat et calculer la dose d’anesthésique appropriée en fonction des directives institutionnelles de soins et d’utilisation des animaux.
  4. Avant d’anesthésier le rat, placez-le dans une cage de type Bowman et enregistrez l’EMG DIAm bilatéral comme indiqué à l’étape 3.2.
  5. Anesthésier le rat au moyen d’une injection intrapéritonéale de kétamine (80 mg/kg) et de xylazine (10 mg/kg) ou d’un autre anesthésique approprié, conformément au protocole du Comité institutionnel local de protection et d’utilisation des animaux. Injecter avant l’opération de la buprénorphine à libération prolongée (1 mg/kg) par voie sous-cutanée et du carprofène (5 mg/kg) par voie intrapéritonéale.
  6. Procéder une fois que l’animal ne répond plus au pincement des orteils. Vérifiez la profondeur de l’anesthésie avec un pincement des orteils environ toutes les 15 minutes.
  7. Avant de commencer l’opération, placez le rat en position couchée et enregistrez l’EMG chez le rat anesthésié comme indiqué à l’étape 3.3.
    REMARQUE : Assurez-vous que tous les enregistrements sont effectués avec le rat dans la même position.
  8. Rasez les poils du cou à peu près au niveau de l’oreille et jusqu’aux omoplates et retirez-les avec de la gaze humide.
  9. Nettoyez la peau avec du gluconate de chlorohexidine (4 % en poids par volume) et couvrez l’animal avec des couvercles chirurgicaux stériles (sauf pour le dos supérieur).
  10. À l’aide d’un scalpel, faites une incision rostro-caudale de 4 cm. Rétractez la peau et coupez le muscle acromiotrapèze. Ensuite, disséquez le muscle rhomboïde pour exposer les muscles rachidiens.
    REMARQUE : L’acromiotrapèze est le muscle trapèze moyen, et ses fibres musculaires sont à peu près parallèles à la colonne vertébrale. Le muscle rhomboïde est exposé dans le plan sous l’acromiotrapèze et ses fibres musculaires courent en diagonale.
  11. Rétracter les muscles rachidiens de C1 à C3.
    REMARQUE : Les muscles spinalis sont immédiatement adjacents à la colonne vertébrale.
  12. Effectuez soigneusement une laminectomie à C2 à l’aide d’un rongeur tout en regardant à travers un microscope chirurgical pour vous assurer qu’aucune artère ou nerf majeur n’est endommagé.
  13. Coupez et rétractez la dure-mère en C2.
  14. Connectez les fils d’électrodes exposés du dos du rat à l’amplificateur tout en effectuant l’hémisection vertébrale. Reportez-vous à l’étape 3 pour plus de détails.
  15. Pendant la surveillance de l’EMG DIAm, insérez le couteau de dissection coudé juste en dessous du point où la racine dorsale pénètre dans la moelle épinière et sectionnez jusqu’au milieu de la surface ventrale de la manière illustrée à la figure 2A.
    REMARQUE : Si vous utilisez un coussin chauffant électronique, il peut être nécessaire de l’éteindre pendant la surveillance de l’EMG pour éviter le bruit.
  16. Dans les secondes qui suivent cette section, assurez-vous que l’activité eupnéique DIAm EMG ipsilatérale à la lésion cesse et qu’une augmentation compensatoire de l’activité cDIAm EMG est évidente (Figure 2C).
  17. Si l’activité eupnéique de l’EMG iDIAm persiste, effectuez une autre incision avec le couteau à dissection, comme le montre la figure 2C. Cependant, ne coupez pas la ligne médiane ; La coupe du côté controlatéral entraînera très probablement la mort de l’animal.
  18. Suturez les muscles puis la peau avec des sutures stériles (3-0).
  19. Pour maintenir l’hydratation, injecter par voie sous-cutanée 1 mL de solution saline par 50 g de masse animale et placer l’animal dans une cage propre avec un coussin chauffant pour la récupération. Surveiller l’animal pendant qu’il se remet de l’opération.
  20. Environ 72 h plus tard (jour 3 post-C2SH), enregistrer l’activité EMG chez les rats éveillés conformément à l’étape 3.2 du protocole. Attention à ne pas abîmer les points de suture sur le dos du rat.
  21. Ensuite, anesthésie à nouveau le rat (en suivant les protocoles approuvés par l’établissement), en utilisant une dose d’anesthésique plus légère que celle qui serait nécessaire pour un avion chirurgical (entre 1/3 et 1/2 d’une dose normale). Des doses supplémentaires peuvent être administrées à condition que les rats présentent un réflexe cornéen intact et répondent au pincement des orteils.
  22. Surveillez l’activité de l’EMG DIAm en suivant l’étape 3 du protocole.
    REMARQUE : Placez le rat dans la même position que celle utilisée pour l’évaluation initiale de l’activité EMG iDIAm.
  23. Si l’activité eupnéique iDIAm EMG (c’est-à-dire l’activité en phase avec l’activité ECG inspiratoire cDIAm) est absente au jour 3, conclure que leC2SH initial a été réussi et inclure le même animal pour des analyses plus approfondies.

3. Acquisition et analyse des données

  1. Paramètres généraux et extraction des données
    1. Réglez les filtres passe-bande du préamplificateur sur 100 Hz (passe-haut) et 1000 Hz (passe-bas).
      REMARQUE : Ces paramètres de filtre éliminent les artefacts de mouvement et réduisent considérablement le bruit de 60 Hz et la contamination ECG (qui a une puissance de crête à ~75 Hz) tout en conservant la grande majorité du contenu fréquentiel du signal EMG DIAm intramusculaire. Basé sur la théorie de Nyquist, numériser avec une fréquence d’échantillonnage de 2000 Hz pour éviter le repliement et permettre une résolution adéquate pour noter l’activité de l’unité motrice dans l’EMG composé. Si vous effectuez des analyses spécialisées du contenu fréquentiel de la gamme de fréquences inférieures à 100 Hz, il est important de régler les paramètres de filtre du préamplificateur pour s’assurer que les fréquences d’intérêt ne sont pas filtrées.
    2. Surveillez deux canaux (EMG de l’hémidiaphragme gauche et de l’hémidiaphragme droit) dans un logiciel de visualisation sur un ordinateur et enregistrez les données dans un format approprié pour des analyses ultérieures.
    3. Collectez au moins 1 à 2 minutes d’enregistrements eupnéiques pour avoir suffisamment de données pour les analyses.
    4. Assurez-vous que les données sont collectées à trois moments ou plus :
      1. Avant C2SH, établir un enregistrement eupnéique de référence dans des conditions d’éveil et d’anesthésie.
      2. Au cours de la chirurgie C2SH pour établir le silençage de l’activité eupnéique iDIAm EMG dans des conditions anesthésiées.
      3. Au jour 3 post-C2SH pour confirmer que l’absence d’activité eupnéique iDIAm EMG persiste et établir un premier point de l’étendue du déficit chez les animaux éveillés qui n’est pas aussi influencé par le choc rachidien 2,39 ou l’administration de dépresseurs respiratoires comme la buprénorphine.
    5. Analysez les enregistrements DIAm EMG à l’aide de n’importe quel logiciel permettant d’effectuer des calculs sur des signaux numérisés (par exemple, Matlab, Python, R). Le processus de base est le suivant :
      1. Chargez les fichiers EMG bruts. Selon les paramètres de filtrage, il peut être nécessaire de tenir compte d’un décalage CC dans le signal.
        REMARQUE : Une solution simple consiste à soustraire la moyenne du signal EMG brut de lui-même.
      2. Calculez la valeur quadratique moyenne du signal EMG avec une fenêtre mobile de 50 ms. Cela peut être fait en déplaçant une fenêtre de calcul de 50 ms vers l’avant d’un point d’échantillonnage à la fois jusqu’à ce que la fin du signal soit atteinte.
        REMARQUE : Les analyses d’événements individuels de DIAm EMG fournissent la plus grande puissance statistique et permettent de regrouper l’activité eupnéique et non eupnéique. Ainsi, la détection de l’apparition et du décalage des respirations individuelles dans l’EMG DIAm est primordiale, comme souligné dans un précédent rapport40.
    6. Effectuez le filtrage de l’activité eupnéique en visualisant les histogrammes de la fréquence respiratoire instantanée et de la durée de l’éruption, comme indiqué dans un précédent rapport41.
  2. Enregistrements éveillés.
    1. Effectuez des enregistrements éveillés en plaçant des rats dans une cage à rongeurs de style Bowman. Une cage cylindrique de type Bowman peut accueillir des rats adultes pesant jusqu’à 750 g.
    2. Dévissez les tiges métalliques d’un côté de la cage de style Bowman et cajolez doucement le rat à l’intérieur. Revissez les tiges métalliques, piégeant le rat dans la cage cylindrique.
      REMARQUE : Acclimatez les rats à la cage pendant au moins 30 minutes avant de procéder à l’enregistrement. Si possible, il est préférable d’acclimater les rats à la cage de style Bowman pendant plusieurs jours avant toute mesure. Il est recommandé de fournir des friandises pendant que les rats sont dans la cage pendant cette phase d’acclimatation.
    3. Pour minimiser les stimuli visuels externes, utilisez une serviette en papier ou un objet similaire pour faire une tente autour de l’avant de la cage où se trouve la tête du rat. De plus, minimisez les bruits forts et assurez le confort physique du rat en tous points.
      REMARQUE : Les signes évidents d’inconfort comprennent l’agitation, la respiration rapide et la lutte contre la cage. Si l’un de ces signes est observé, il peut être nécessaire de ramener le rat dans la cage familiale et de tenter des enregistrements lorsque le rat est plus calme.
    4. Pour les rats plus petits (<300 g), insérez des matériaux de remplissage (p. ex. essuie-tout, boules de coton) dans des espaces supplémentaires de la cage pour décourager le rat de tourner à 180 degrés.
    5. Une fois le rat acclimaté, connectez soigneusement les fils sortant du dos du rat à un préamplificateur, qui alimente les signaux analogiques dans un convertisseur analogique-numérique, et suivez les procédures décrites à l’étape 3.1.
  3. Enregistrements anesthésiés
    1. Placez les rats dans la même position à chaque fois, de préférence enclins à imiter plus étroitement la posture du rat éveillé.
    2. Connectez les fils sortant du rat dorsum à un préamplificateur, qui alimente les signaux analogiques dans un convertisseur analogique-numérique, et suivez les procédures décrites à l’étape 3.1.
  4. Récupération d’animaux
    1. Placez les rats dans une cage à rats vide et propre, sans litière pour les récupérer.
    2. Placez la cage sur un coussin chauffant.
    3. Surveillez le rat à intervalles réguliers (<15 min) pendant les 3 premières heures ou jusqu’à ce qu’il commence à bouger. Surveiller à intervalles moins réguliers (30 min) jusqu’à ce que l’animal soit à nouveau réveillé.
    4. Une fois que le rat est ambulatoire, placez-le dans une cage propre avec de la litière, un accès à de la nourriture et de l’eau, et un enrichissement de l’environnement.
    5. Continuez à surveiller le rat au moins une fois par jour pendant toute la durée de l’expérience. Portez une attention particulière aux changements de poids/capacité à se nourrir ainsi qu’à l’intégrité des sites d’incision et des sutures.

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Résultats

L’approche présentée dans cet article minimise la variabilité inter-opérateurs en établissant des critères clairs pour l’évaluation de l’EMG DIAm dans un modèle deC2SH chez le rat. Tout d’abord, l’arrêt de l’activité eupnéique de l’EMG iDIAm immédiatement après C2SH doit être observé, comme le montre la figure 2. Si ce n’est pas le cas, une section secondaire peut être effectuée jusqu’à ce que l’activité eupnéique iDIAm disparaiss...

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Discussion

C2 hémisection spinale
La procédure décrite dans cet article met l’accent sur les évaluations de l’activité EMG DIAm qui servent à valider une lésion vertébraleC2 qui traverse les funicules latéraux et ventraux tout en épargnant les funicules dorsaux (Figure 2A). L’approche chirurgicale proposée présente deux avantages majeurs. Tout d’abord, il épargne les funicules dorsaux, qui préservent la fonction ambulatoire chez les rats, ...

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Déclarations de divulgation

Les auteurs n’ont aucun conflit d’intérêts à déclarer.

Remerciements

Les auteurs mentionnent la source de financement des NIH (NIH R01HL146114).

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matériels

NameCompanyCatalog NumberComments
25 G NeedleCardinal Health1188825100Covidien Monoject Hypdermic Standard Needles: 25 G x 1" (0.508 mm x 2.5 cm) A
3-0 Vicryl Violet BraidedEthiconJ774D3-0 Suture
Adson-Brown ForcepsFine Science Tools11627-12Tip Shape: Straight, Tips: Shark Teeth, Tip Width: 1.4mm, Tip Dimensions: 2 x 1.4 m, Alloy / Material: Stainless Steel, Length: 12 cm
Bowman Style CageBraintree ScientificPOR-530Weight range: 250 up to 750 g; Maximum length: 9" (228 mm); Basic unit is constructed of .5" (123 mm) jeweled acrylic.
Castroviejo Needle HolderFine Science Tools12565-14Tip Shape: Straight, Tip Width: 1.5 mm, Clamping Length: 10 mm, Lock: Yes, Scissors: No, Alloy / Material: Stainless Steel, Length: 14 cm, Serrated:
Yes, Feature: Tungsten Carbide
Clip Lead 1m TP ShieldedBiopac Systems, IncLEAD110SShielded lead wires for EMG
Data Acquisition SoftwareLabChartLabChart 7.3.8Data recording, visualization, and analysis software for multi-channel recordings and real-time assessments
Data Analysis Software - Matlab 2023bMathworks, Inc.Version 23.2General purpose programming language for post hoc analysis
Dissecting KnifeFine Science Tools10056-12Cutting Edge: 4 mm, Thickness: 0.5 mm, Alloy / Material: Stainless Steel, Length: 12.5 cm, Blade Shape: Angled 30°
Dumont #3 ForcepsFine Science Tools11293-00Style: #3, Tip Shape: Straight, Tips: Standard, Tip Dimensions: 0.17 x 0.1 mm, Length: 12 cm, Alloy / Material: Dumostar
Electromyogram AmplifierBiopac Systems, IncEMG100CEMG amplifier
Friedman RongeurFine Science Tools16000-14Tip Shape: Curved, Cup Size: 2.5mm, Alloy / Material: Stainless Steel, Length: 13cm, Joint Action: Single
Friedman-Pearson RongeursFine Science Tools16021-14Alloy / Material: Stainless Steel, Length: 14cm, Joint Action: Single, Cup Size: 1mm, Tip Shape: Curved
Isolated Power Supply ModuleBiopac Systems, IncIPS100COperates 100-series amplifier modules indepdent of the Biopac Systems, Inc.'s MP series Data Acquisition System
Kelly HemostatsFine Science Tools13019-14Tips: Serrated, Tip Width: 1.5mm, Clamping Length: 22mm, Alloy / Material: Stainless Steel, Length: 14cm, Tip Shape: Curved
Knife CuretteV. MuellerVM101-4414Tip: Sharp, Tip Diameter: 2 mm
Micro Dissecting ScissorsBiomedical Research Instruments, Inc.11-2420Length: 4", Angle: Straight, Blade Length: 23 mm
Multistranded stainless steel wireCooner Wire, Inc.AS 631AWG 40; Overall diameter: 0.011 mm (with insulation), 0.008 mm (without insulation).
PowerLab 8/35ADInstrumentsPL3508Data acquisition system
Scalpel Blade #11Fine Science Tools10011-00Blade Shape: Angled, Cutting Edge: 20 mm, Thickness: 0.4 mm, Alloy / Material: Carbon Steel
Scalpel Handle #3Fine Science Tools10003-12Alloy / Material: Stainless Steel, Length: 12 cm
Sprague Dawley RatInotivOrder code: 002Sprague Dawley outbred rats (female and male)
Surgical MicroscopeOlympusSZ61Surgical microscope 
Suture Cutting ScissorsGeorge Tiemann & Co.110-1250SBAlloy / Material: Stainless Steel, Tip Shape: Straight, Tips: Sharp/Blunt, Length: 4.5"
Vannas Spring ScissorsFine Science Tools15000-08Tips: Sharp, Cutting Edge: 2.5 mm, Tip Diameter: 0.05 mm, Length: 8 cm, Alloy / Material: Stainless Steel, Serrated: No, Tip Shape: Straight
Weitlaner RetractorCodman50-5647Prongs: 2 x 3 Blunt, Length: 4.5"

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