JoVE Logo
АВТОРЫ
СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

Войдите в систему

Для просмотра этого контента требуется подписка на Jove Войдите в систему или начните бесплатную пробную версию.

В этой статье

  • Резюме
  • Аннотация
  • Введение
  • протокол
  • Результаты
  • Обсуждение
  • Раскрытие информации
  • Благодарности
  • Материалы
  • Ссылки
  • Перепечатки и разрешения

Резюме

Респираторные осложнения являются основной причиной смерти у лиц с травмой шейного отдела спинного мозга (ТСМ). Животные модели ТСМ имеют важное значение для механистической оценки и доклинических исследований. В данной работе мы представляем воспроизводимый метод оценки функционального восстановления активности мышц диафрагмы (DIAm) после односторонней спинальной гемисекции C2 (C2SH) у крыс.

Аннотация

После ТСМ активация DIAm может быть нарушена в зависимости от степени травмы. В настоящей рукописи описана односторонняямодель C2-гемисекции (C2SH) cSCI, которая нарушает электромиографическую (ЭМГ) эвпноэ-ипсилатеральную диафрагму (iDIAm) во время дыхания у крыс. Чтобы оценить восстановление моторного контроля DIAm, сначала необходимо четко определить степень дефицита, вызванногоC2SH. При проверке полной первоначальной потери iDIAm EMG во время дыхания последующее восстановление может быть классифицировано как отсутствующее или присутствующее, а степень восстановления может быть оценена с помощью амплитуды ЭМГ. Кроме того, путем измерения продолжительного отсутствия активности ЭМГ iDIAm во время дыхания после периода острого спинального шока после C2SH можно подтвердить успех исходного C2SH. Измерение активности контралатеральной диафрагмы (cDIAm) ЭМГ может дать информацию о компенсаторных эффектах C2SH, которые также отражают нейропластичность. Кроме того, записи DIAm EMG от бодрствующих животных могут предоставить жизненно важную физиологическую информацию о моторном контроле DIAm после C2SH. В этой статье описывается метод создания строгой, воспроизводимой инадежной C2SH модели cSCI у крыс, которая является отличной платформой для изучения дыхательной нейропластичности, компенсаторной активности cDIAm, а также терапевтических стратегий и фармацевтических препаратов.

Введение

В Соединенных Штатах насчитывается более 300 000 человек с травмой спинного мозга (ТСМ), примерно половина из которых имеет травмы шейного отдела1. Эти травмы приводят к значительным потерям благосостояния и создают финансовую нагрузку на людей, их семьи и систему здравоохранения. К счастью, большинство ТСМ являются неполными, что обеспечивает потенциал для укрепления спасенных путей1. Эта нейропластичность может позволить восстановить, по крайней мере, некоторые функции, включая активность DIAm, которая важна для вентиляционного и невентиляционного поведения. Таким образом, содействие нейропластичности является многообещающим направлением исследований для помощи людям с ТСМ2.

Модели ТСМ на грызунах могут внести существенный вклад в открытие методов лечения для улучшения здоровья человека. Одной из классических моделей ТСМ, используемых для изучения нейропластичности, является односторонняя перерезка (гемисекция) спинного мозга в точкеС2 (С2SH), при которой контралатеральная сторона остается нетронутой 3,4,5,6,7,8,9,10,11,12,13. ВлияниеC2SH на диафрагмальный выброс и важность щадящих контралатеральных путей были впервые обнаружены более ста лет назадПортером, чья основополагающая статья заложила основу для современных исследований дыхательной нейропластичности. Модель C2SH прерывает нисходящие входы от ростральной вентральной группы дыхания (rVRG) в продолговатом мозге, который содержит премоторные нейроны, ответственные за передачу выходных сигналов генерации дыхательного ритма14. Эти премоторные нейроны rVRG также передают возбуждающий нейронный драйв диафрагмальным моторным нейронам (рис. 1). Некоторые исследователи использовали различные подходы к модели C2SH 10,11,15,16, что может частично объяснить некоторую вариативность восстановления в разных исследованиях. Вкратце, подходы различаются с точки зрения сохранения дорсальных фуникулов, выполнения полной гемисекции или выполнения латеральной частичной транссекции, которая не полностью прерывает нисходящие входы от ипсилатеральной rVRG. В целом, модели C2SH особенно полезны для изучения дыхательной нейропластичности из-за скорости спонтанного восстановления электромиографической активности (ЭМГ) eupneic iDIAm с течением времени, которая может быть улучшена несколькими факторами, включая нейротрофическую передачу сигналов 17,18,19,20,21. Тем не менее, первоначальная потеря функции, определяемая как подавление активности эвноэической ЭМГ iDIAm, должна быть сначала установлена, прежде чем можно будет четко классифицировать восстановление. Такая проверка бездействия во время C2SH не проводилась в нескольких исследованиях 3,4,6,7,11,22,23.

Гистологические оценки иссеченного спинного мозга свидетельствуют только о повреждении соответствующего расположения ипсилатеральных возбуждающих бульбоспинальных путей, иннервирующих диафрагмальные мотонейроны в спинном мозге, но гистология не заменяет физиологические доказательства (например, ДИАм ЭМГ). Кроме того, гистологические оценки проводятся in vivo в терминальных временных точках (часто через несколько недель или месяцев после травмы) и не предоставляют информацию в режиме реального времени. Некоторые исследователи отметили, что величина поражения связана с величиной функционального дефицита или его отсутствием 5,24,25,26. Важно отметить, что обоснованность таких утверждений, вероятно, в значительной степени зависит от того, как классифицируется «функция» (т.е. каковы функциональные задачи и как они количественно оцениваются), а вариативность между исследованиями подчеркивает сложность создания функционально идентичных поражений у животных. Действительно, исследователи подчеркнули, что связь между степенью травмы и опорно-двигательной функцией мышц конечностей (количественно оцененной по шкале Бассо, Битти и Бреснахана (BBB)24) не является линейной27,28. В предыдущих исследованиях мы не обнаружили связи между распространенностьюC2 SH и степенью восстановления активности эвпноэ iDIAm EMG после травмы 10,29,30,31, хотя другие исследователи сообщали о взаимосвязи между вентиляционной функцией и степенью щадящего белого вещества 5. Таким образом, в случае модели C2SH подход к функциональной валидации бездействия iDIAm во время операции и предпочтительно на ранних этапах экспериментов с хронической травмой спинного мозга является как полезным, так и необходимым.

В настоящей статье подчеркивается использование ДИАм ЭМГ для подтверждения в реальном времени первоначальной потери ДИАм ЭМГ при дыхании после C2SH, а также последующих подтверждающих оценок через 3 дня (день 3) после травмы 18,21,31,32,33. В более ранней работе с моделью C2SH выполнялись повторные лапаротомии для записи DIAm EMG 10,13,30,34. Тем не менее, в более поздних работах использовались хронические электроды ЭМГ, которые позволяют регистрировать ЭМГ у крыс под наркозом и в сознании. Кроме того, хронические электроды снижают риск пневмоторакса и не требуют повторных лапаротомий, которые могут вызвать ингибирование DIAm35,36. Несмотря на то, что версии модели C2SH использовались многими исследователями, подтверждение подавления активности iDIAm не было сделано во время операции 3,4,6,7,11,22,23. Без такого подтверждения бездействия трудно понять, какую часть последующего восстановления отнести к нейропластичности ипсилатеральных и контралатеральных путей, которые могут оказывать дифференцированное воздействие. Это важное соображение, потому что инспираторный нервный драйв от rVRG к диафрагмальным мотонейронам является преимущественно ипсилатеральным, с потерей около 50% возбуждающих глутаматергических входов к диафрагмальным моторным нейронам после C2SH33. Тем не менее, существуют остаточные входы возбуждения вдоха от контралатерального rVRG, которые декуссируются ниже места поражения, иннервируя ипсилатеральные диафрагмальные мотонейроны и могут быть усилены за счет нейропластичности, способствуя функциональному восстановлению. При удалении преобладающего ипсилатерального возбуждающего входа в диафрагмальные моторные нейроны, активность эвпноэ iDIAm EMG теряется (по крайней мере, под анестезией), в то время как активность cDIAm продолжается и даже усиливается. Таким образом, потеря активности ЭМГ iDIAm во время дыхания является мерой успешногоC2SH (Рисунок 2).

Некоторый уровень активности iDIAm ЭМГ наблюдается уже через 1-4 дня после C2SH у бодрствующих животных23,37. Кроме того, у животных с децеребрацией активность iDIAm присутствует в течение нескольких минут или часов после верхней шейной гемисекции и подавляется анестезией38. Кроме того, успехC2SH подтверждается подтверждением отсутствия активности iDIAm EMG во время дыхания (эвпэа) у крыс, получавших анестезию, на 3-й день после травмы. Конфокальные визуализационные исследования подтвердили потерю глутаматергических синаптических входов на диафрагмальных моторных нейронах во время этой начальной стадии травмы37. На 3-й день после травмы, если имеется какая-либо остаточная эвноэиновая активность iDIAm ЭМГ, это интерпретируется как свидетельство неполного удаления ипсилатерального нисходящего инспираторного драйва из rVRG. Настоящая статья разделена на три раздела: (1) запись хронической ДИАм ЭМГ, (2) С2SH и (3) сбор данных ЭМГ у бодрствующих и обезболенных животных. Этот протокол описывает строгую, воспроизводимую и надежную C2SH модель cSCI у крыс, которая является отличной платформой для изучения дыхательной нейропластичности, компенсаторной активности cDIAm, а также терапевтических стратегий и фармацевтических препаратов.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

протокол

Этот протокол был одобрен Комитетом по уходу за животными и их использованию клиники Майо (номер протокола: A00003105-17-R23). Животные в настоящем исследовании представляли собой смесь самцов и самок крыс породы Спрэг-Доули в возрасте около 3 месяцев и весом от 200 г до 350 г. Подробная информация о реагентах и оборудовании, использованном в исследовании, приведена в Таблице материалов.

1. Имплантация электродов

  1. Подготовка электродов
    1. Убедитесь, что упомянутое оборудование доступно: (1) многожильная проволока из нержавеющей стали, (2) скальпель с лезвием #11, (3) ножницы, 4) микроскоп для препарирования, (5) линейка, (6) щипцы, (7) иглы 25 г, (8) 2 плоскогубца (по крайней мере, один с зоной обжима).
    2. Подробно процесс изготовления электродов показан на рисунке 3. Повторите этот процесс не менее двух раз для парных дифференциальных записывающих электродов.
    3. Сначала отмерьте и отрежьте 18 см проволоки из нержавеющей стали.
    4. Завяжите базовый верхний узел на расстоянии 4 см от одного конца проволоки, как показано на рисунке 3; это будет служить якорем, когда короткая сторона проволоки будет имплантирована и сшита в DIAm.
    5. С помощью скальпеля и хирургического эндоскопа для вскрытия осторожно снимите 2 мм изоляции, непосредственно прилегающей к узлу на более короткой стороне провода. Соблюдайте большую осторожность, чтобы не обрезать жилы многожильной проволоки.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Эта неизолированная часть служит проводящей поверхностью электрода. Как правило, качество сигнала начинает ухудшаться, если три или более пряди случайно перерезаны, и в этом случае электрод заменяется.
    6. Затем зачистите ~5 мм от конца короткой стороны проволоки, которую затем вставляют в просвет иглы 25 G, чтобы сделать инструмент из нити, похожий на шовный материал, который будет использоваться для имплантации электрода в DIAm.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Иглы более высокого калибра (например, до 28 G) также могут использоваться в зависимости от личных предпочтений. Благодаря меньшему диаметру игл более высокого калибра риск развития пневмоторакса потенциально может быть снижен. Однако также может быть сложнее ввести многожильные проволоки в меньший просвет иглы.
    7. Для этого достаньте иглу весом 25 г из упаковки и с помощью обоих плоскогубцев осторожно согните иглу на ~1 см от острого скошенного конца из стороны в сторону, пока она не сломается.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Этот процесс не должен быть поспешным; В противном случае сдвигающие силы могут привести к закрытию просвета иглы, что потребует повторения процесса.
    8. Вставьте зачищенный конец проволоки в просвет отломанной иглы на 1 см, следя за тем, чтобы игла прилегала непосредственно к оставшемуся изолированному участку проволоки.
    9. Убедившись, что между иглой и оставшейся более короткой стороной провода нет неизолированного участка, сожмите иглу, чтобы прикрепить ее к проволоке.
    10. Затем с помощью двух плоскогубцев осторожно согнуть прикрепленную иглу, чтобы придать ей кривизну, аналогичную кривизне стандартной хирургической иглы для наложения швов.
    11. Наконец, снимите ~5 мм с конца длинной стороны проволоки (Рисунок 3). После того, как электроды будут втянуты в DIAm, длинная сторона провода будет туннелирована для внешнего доступа, чтобы обеспечить запись DIAm EMG.
    12. Повторите процесс, чтобы сделать второй электрод для дифференциальной записи.
  2. Размещение мембранных электродов ЭМГ
    1. Перед операцией стерилизуйте или автоклавируйте все хирургическое оборудование, включая (1) машинки для стрижки шерсти мелких животных, (2) скальпель с лезвием #11, (3) хирургические ножницы, (4) щипцы и (5) держатель микроигл.
    2. Приобретите чистую клетку и обеспечьте ее едой, водой, подстилкой и обогащением окружающей среды. Отставьте в сторону на грелку. Эта клетка будет использоваться для содержания животного после операции.
    3. Простерилизуйте операционное поле соответствующим дезинфицирующим средством и наденьте средства индивидуальной защиты (скрабы, шапочки, маску и хирургические перчатки). Поместите подготовленные ранее электроды в ванну с 70% изопропиловым спиртом.
    4. Поместите грелку в операционную зону, чтобы поддерживать температуру тела крысы во время анестезии и операции. Накройте грелку стерилизованным хирургическим полотенцем.
    5. Взвесьте крысу и рассчитайте подходящую дозировку анестетика на основе рекомендаций по уходу за животными и их применению.
    6. Обезболивайте крысу с помощью внутримышечной инъекции кетамина (80 мг/кг) и ксилазина (10 мг/кг) или другого соответствующего анестетика (в соответствии с утвержденными в учреждении протоколами). Перед операцией вводите бупренорфин с пролонгированным высвобождением (1 мг/кг) и карпрофен (5 мг/кг). Продолжайте, как только животное перестанет реагировать на щипывание пальца ноги.
    7. Используйте машинки для стрижки, чтобы побрить крысу от мечевидного отростка примерно до середины задних конечностей. Кроме того, побрейте спину крысы, где электроды будут выведены за пределы досягаемости животного (обычно вокруг лопаток). Очистите лишние волосы с помощью куска марли.
    8. Подготовьте кожу к разрезу, очистив ее стерильной марлей, смоченной в хлоргексидина глюконате (4% от массы по объему).
    9. Поместите животное в лежачем положении на стерилизованную грелку. Начиная с мечевидного отростка, с помощью скальпеля и чистого лезвия #11 сделайте рострокаудальный разрез 4-5 см. Это должно обнажить нижележащие слои мышц живота.
    10. Сделайте еще один разрез (3-4 см) по средней линии в мышечных слоях, чтобы обнажить содержимое живота. Следите за тем, чтобы не прорезать органы брюшной полости.
    11. Убедитесь, что брюшная (т.е. нижняя) поверхность DIAm видна, хотя правая сторона животного будет закрыта печенью.
    12. С помощью рукоятки скальпеля или другого тупого инструмента надавите вниз на печень и другие органы, чтобы обнажить брюшную сторону DIAm.
    13. Подготовьте электрод к использованию, вынув его из ванны изопропилового спирта и промыв стерильным физиологическим раствором. Затем с помощью микроиглодержателя ориентируют один из заранее подготовленных электродов перпендикулярно мышечным волокнам в среднереберной области DIAm. Мышечные волокна распространяются радиально по DIAm.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Диаметр тонкий (~ 2 мм) и его нельзя прокалывать. Скорее, цель состоит в том, чтобы встроить неизолированную часть электродного провода (рис. 3) в диаметр.
    14. Используйте хирургический микроскоп, чтобы осторожно ввести электродную шовную проволоку (конец иглы) в DIAm. Позвольте кривизне иглы направить электрод внутрь, а затем из брюшной поверхности DIAm, гарантируя, что вся неизолированная часть провода будет полностью внедрена в мышцу.
    15. Осторожно протяните иглу до тех пор, пока узел в проволоке не закрепится в DIAm. Убедитесь, что неизолированная часть (2 мм) электродной проволоки полностью находится в пределах DIAm, с узлом в точке, где игла впервые вошла в DIAm.
    16. Далее отрежьте иглу от электродной проволоки и утилизируйте ее в емкости для острых предметов.
    17. С помощью двух щипцов завяжите узел в том месте, где игла шовной нити (3-0) выходила из диама. Для этого завяжите петлю на короткой стороне проволоки, сдвиньте петлю вниз к брюшной поверхности DIAm и аккуратно затяните петлю в узел. Теперь электрод (неизолированная часть) должен быть закреплен как на входе, так и на выходе.
    18. Отрежьте лишнюю часть от короткой стороны проволоки.
    19. Выполните шаги 1.2.14-1.2.18, чтобы зашить другой электрод на той же стороне диама, на расстоянии ~3 мм от первого.
    20. Аналогичным образом проводят имплантацию пары электродов в противоположную гемидиафрагму.
    21. Далее убедитесь, что вся длинная сторона электродных проводов находится за пределами брюшной полости и начните зашивать (3-0) мышечные слои, чтобы закрыть брюшную полость. Для каждой пары электродов сделайте петлю и закрепите ее.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Убедитесь, что 2-3 см проволоки осталось в брюшной полости, чтобы крыса могла растянуться, не вызывая напряжения в диаме.
    22. Очистите лишнюю кровь физиологическим раствором, а затем зашите (3-0) мышечный слой непрерывно, чтобы закрыть брюшину.
    23. Проведите катетер 16 G от медиальной дорсальной кожи крысы к открытой коже живота и протяните пару электродных проводов к спине крысы.
    24. Повторите процесс со вторым катетером с другой стороны и протяните через него вторую пару электродных проводов.
    25. Сшить кожу живота швом 3-0 по прерывистому рисунку шва.
    26. Далее для каждой пары завяжите электродные проволоки в узел и зашите их на место.
    27. Обеспечьте животному подкожную инъекцию физиологического раствора (~1 мл на 50 г массы животного). Посадите животное в чистую клетку поверх грелки, чтобы прийти в себя.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Лапаротомия может вызвать ингибирование активности DIAm35,36. Подождите не менее 72 часов до количественного анализа любых измерений ЭМГ.

2. Гемисекция шейного отдела позвоночника

  1. Подготовьте стерильную операционную область, как и раньше.
  2. Перед операцией проведите автоклавирование или стерилизацию всего хирургического оборудования. Необходимое оборудование: (1) машинки для стрижки шерсти мелких животных, (2) скальпель с лезвием #11, (3) хирургические ножницы, (4) щипцы, (5) ронжеры, (6) ретракторы, (7) угловой нож для препарирования.
  3. Примерно через 72 часа после имплантации электрода DIAm EMG взвесьте крысу и рассчитайте подходящую дозировку анестетика на основе рекомендаций по уходу за животными и их применению.
  4. Перед обезболиванием крысы поместите крысу в клетку по методу Боумена и запишите двустороннюю ДИАм ЭМГ, как описано в шаге 3.2.
  5. Обезболите крысу внутрибрюшинной инъекцией кетамина (80 мг/кг) и ксилазина (10 мг/кг) или другого подходящего анестетика в соответствии с протоколом местного Комитета по уходу за животными и их использованию. Перед операцией подкожно ввести бупренорфин с пролонгированным высвобождением (1 мг/кг) и внутрибрюшинно карпрофен (5 мг/кг).
  6. Продолжайте, как только животное перестанет реагировать на щипывание пальца ноги. Проверяйте глубину анестезии щипцом пальца ноги примерно каждые 15 минут.
  7. Перед началом операции поместите крысу в положение лежа и запишите ЭМГ у крысы под наркозом, как описано в шаге 3.3.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Убедитесь, что все записи выполняются с крысой в одном и том же положении.
  8. Сбрейте волосы от шеи примерно до уровня ушей и вниз до лопаток и удалите их влажной марлей.
  9. Очистите кожу глюконатом хлоргексидина (4% от массы по объему) и накройте животное стерильными хирургическими чехлами (кроме верхней спинки).
  10. С помощью скальпеля сделайте ростро-каудальный разрез диаметром 4 см. Втяните кожу и разрежьте акромиотрапическую мышцу. Затем рассеките ромбовидную мышцу, чтобы обнажить спинномозговые мышцы.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Акромиотрапическая мышца является средней трапециевидной мышцей, и ее мышечные волокна проходят примерно параллельно позвоночнику. Ромбовидная мышца обнажается в плоскости ниже акромиотрапии, и ее мышечные волокна проходят по диагонали.
  11. Втяните спинные мышцы от С1 до С3.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Мышцы позвоночника проходят непосредственно рядом с позвоночником.
  12. Осторожно выполните ламинэктомию вС2 с помощью ронжера, глядя в хирургический микроскоп, чтобы убедиться, что никакие крупные артерии или нервы не повреждены.
  13. Разрежьте и втяните твердую мозговую оболочку в точке C2.
  14. Подключите открытые электродные провода от спины крысы к усилителю во время выполнения спинальной гемисекции. Более подробную информацию см. в шаге 3.
  15. Во время мониторинга ДИАм ЭМГ вставьте наклонный рассекающий нож чуть ниже точки, где дорсальный корешок входит в спинной мозг, и разрежьте его до середины вентральной поверхности способом, показанным на рисунке 2А.
    ПРИМЕЧАНИЕ: При использовании электронной грелки может потребоваться выключить ее во время контроля ЭМГ, чтобы избежать шума.
  16. В течение нескольких секунд после этого разреза убедитесь, что активность эвпноэиновой ДИАм ЭМГ ипсилатеральной по отношению к травме прекращается и наблюдается компенсаторное увеличение активности ЭМГ цДИАм (рис. 2C).
  17. Если активность эвпноэической ЭМГ iDIAm сохраняется, выполните еще один разрез ножом для препарирования, как показано на рисунке 2C. Однако не режьте поперек средней линии; Разрез в контрлатеральную сторону, скорее всего, приведет к гибели животного.
  18. Сшить мышцы, а затем кожу стерильными швами (3-0).
  19. Для поддержания гидратации необходимо подкожно ввести 1 мл физиологического раствора на 50 г массы животного и поместить животное в чистую клетку с грелкой для восстановления. Наблюдайте за тем, как животное восстанавливается после операции.
  20. Примерно через 72 ч (день 3 после С2SH) зарегистрируйте активность ЭМГ у бодрствующих крыс в соответствии с протокольным шагом 3.2. Будьте осторожны, чтобы не повредить швы на тыльной стороне крысы.
  21. Затем снова обезболите крысу (в соответствии с утвержденными в учреждении протоколами), используя меньшую дозу анестетика, чем требуется для хирургического плана (от 1/3 до 1/2 нормальной дозы). Дополнительные дозы могут быть назначены до тех пор, пока крысы демонстрируют неповрежденный роговичный рефлекс и реагируют на защемление пальца ноги.
  22. Мониторинг активности DIAm EMG в соответствии с протокольным шагом 3.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Поместите крысу в то же положение, которое использовалось для первоначальной оценки активности iDIAm EMG.
  23. Если активность эвпноэ iDIAm EMG (т.е. активность в фазе с активностью инспираторной cDIAm EMG) отсутствует на 3-й день, сделайте вывод, что исходнаяC2SH была успешной, и включите то же животное для дальнейшего анализа.

3. Сбор и анализ данных

  1. Общие настройки и извлечение данных
    1. Установите полосовые фильтры предусилителя на частоту 100 Гц (верхние частоты) и 1000 Гц (низкочастотные).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Эти настройки фильтра устраняют артефакты движения и заметно снижают шум 60 Гц и загрязнение ЭКГ (пиковая мощность которого составляет ~75 Гц), сохраняя при этом подавляющее большинство частотного состава внутримышечного сигнала DIAm. Основываясь на теории Найквиста, оцифруйте с частотой дискретизации 2000 Гц, чтобы избежать искажения и обеспечить адекватное разрешение для учета активности двигательных единиц в сложной ЭМГ. При выполнении специализированного анализа частотного состава в диапазоне ниже 100 Гц важно установить настройки фильтра предусилителя, чтобы гарантировать, что интересующие частоты не будут отфильтрованы.
    2. Контролируйте два канала (левый и правый ЭМГ гемидадиафрагмы) в программном обеспечении визуализации на компьютере и сохраняйте данные в соответствующем формате для дальнейшего анализа.
    3. Соберите не менее 1-2 минут записей эвпноэ, чтобы получить достаточно данных для анализа.
    4. Убедитесь, что данные собираются в трех или более временных точках:
      1. ПередC2SH установите базовую регистрацию эвпноэ в бодрствующих и анестезируемых условиях.
      2. Во время операцииC2SH для установления подавления активности эвноэиновой iDIAm ЭМГ в условиях анестезии.
      3. На 3-й деньпосле С2SH подтвердить, что отсутствие активности эвпноэ iDIAm ЭМГ сохраняется, и установить начальную точку степени дефицита у бодрствующих животных, на которую не так сильно влияет спинальный шок 2,39 или прием респираторных депрессантов, таких как бупренорфин.
    5. Анализируйте записи DIAm EMG с помощью любого программного обеспечения, позволяющего выполнять вычисления на оцифрованных сигналах (например, Matlab, Python, R). Основной процесс заключается в следующем:
      1. Загрузите необработанные файлы EMG. В зависимости от настроек фильтрации может потребоваться учет смещения постоянного тока в сигнале.
        ПРИМЕЧАНИЕ: Простое решение состоит в том, чтобы вычесть среднее значение исходного сигнала ЭМГ из самого себя.
      2. Вычислите среднеквадратичное значение сигнала ЭМГ с подвижным окном в 50 мс. Это можно сделать, перемещая окно расчета в 50 мс вперед на одну точку выборки за раз до тех пор, пока сигнал не будет достигнут.
        ПРИМЕЧАНИЕ: Анализ отдельных событий DIAm EMG обеспечивает наибольшую статистическую мощность и позволяет кластеризовать эвпноэевую и неэвпноэическую активность. Таким образом, обнаружение начала и смещения отдельных вдохов при ДИАм ЭМГ имеет первостепенное значение, как подчеркивалось в предыдущем отчете40.
    6. Выполните фильтрацию эвноэической активности, визуализируя гистограммы мгновенной частоты дыхания и продолжительности всплеска, как показано в предыдущем отчете41.
  2. Записи в режиме бодрствования.
    1. Выполняйте записи в сознании, помещая крыс в клетку для грызунов в стиле Боумана. Цилиндрическая клетка в стиле Боумена может вместить взрослых крыс весом до 750 г.
    2. Открутите металлические прутья с одной стороны клетки в стиле Боумена и осторожно заманите крысу внутрь. Прикрутите металлические стержни обратно, заперв крысу в цилиндрической клетке.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Приучите крыс к клетке не менее чем на 30 минут, прежде чем приступить к записи. Если возможно, лучше всего приучить крыс к клетке в стиле Боумена в течение нескольких дней перед любыми измерениями. Хорошей практикой является предоставление угощений, пока крысы находятся в клетке во время этой фазы акклиматизации.
    3. Чтобы свести к минимуму внешние визуальные раздражители, используйте бумажное полотенце или аналогичный предмет, чтобы сделать палатку вокруг передней части клетки, где находится голова крысы. Кроме того, сведите к минимуму громкие звуки и обеспечьте физический комфорт крысы во всех точках.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Очевидные признаки дискомфорта включают ерзание, учащенное дыхание и борьбу с клеткой. Если наблюдается какой-либо из этих признаков, может потребоваться вернуть крысу в домашнюю клетку и попытаться сделать запись, когда крыса успокоится.
    4. Для более мелких крыс (<300 г) вставьте наполнители (например, бумажное полотенце, ватные шарики) в дополнительные места в клетке, чтобы крыса не поворачивалась на 180 градусов.
    5. После того как крыса акклиматизируется, осторожно подключите провода, выходящие из спинки крысы, к предусилителю, который подает аналоговые сигналы в аналого-цифровой преобразователь, и следуйте процедурам, описанным в шаге 3.1.
  3. Записи под наркозом
    1. Каждый раз размещайте крыс в одном и том же положении, желательно склонных, чтобы более точно имитировать позу бодрствующей крысы.
    2. Подключите провода, выходящие из спинки крысы, к предусилителю, который подает аналоговые сигналы в аналого-цифровой преобразователь, и следуйте процедурам, описанным в шаге 3.1.
  4. Восстановление животных
    1. Поместите крыс в пустую, чистую клетку для крыс без подстилки для восстановления.
    2. Поместите клетку на грелку.
    3. Наблюдайте за крысой через равные промежутки времени (<15 минут) в течение первых 3 часов или до тех пор, пока крыса не начнет двигаться. Наблюдайте через менее регулярные промежутки времени (30 минут) до тех пор, пока животное снова не придет в себя.
    4. После того, как крыса будет передвигаться, поместите ее в чистую клетку с подстилкой, доступом к еде и воде, обогащением окружающей среды.
    5. Продолжайте наблюдать за крысой не реже одного раза в день на протяжении всего эксперимента. Обратите особое внимание на изменения веса/способности к питанию, а также на целостность мест разрезов и швов.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Результаты

Подход, представленный в данной статье, минимизирует межоператорную вариабельность за счет установления четких критериев оценки DIAm ЭМГ в модели C2SH на крысе. Во-первых, необходимо наблюдать прекращение эвпноэальной активности iDIAm EMG сразу после C2SH, как показано на

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Обсуждение

С2 спинальная гемисекция
Процедура, описанная в этой статье, делает акцент на оценке активности DIAm EMG, которая служит валидацией поражения позвоночникаC2, которое пересекает латеральные и вентральные фуникулы с сохранением дорсальных фуникулов (рис. 2A

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Раскрытие информации

У авторов нет конфликта интересов, о котором можно было бы заявить.

Благодарности

Авторы указывают источник финансирования NIH (NIH R01HL146114).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Материалы

NameCompanyCatalog NumberComments
25 G NeedleCardinal Health1188825100Covidien Monoject Hypdermic Standard Needles: 25 G x 1" (0.508 mm x 2.5 cm) A
3-0 Vicryl Violet BraidedEthiconJ774D3-0 Suture
Adson-Brown ForcepsFine Science Tools11627-12Tip Shape: Straight, Tips: Shark Teeth, Tip Width: 1.4mm, Tip Dimensions: 2 x 1.4 m, Alloy / Material: Stainless Steel, Length: 12 cm
Bowman Style CageBraintree ScientificPOR-530Weight range: 250 up to 750 g; Maximum length: 9" (228 mm); Basic unit is constructed of .5" (123 mm) jeweled acrylic.
Castroviejo Needle HolderFine Science Tools12565-14Tip Shape: Straight, Tip Width: 1.5 mm, Clamping Length: 10 mm, Lock: Yes, Scissors: No, Alloy / Material: Stainless Steel, Length: 14 cm, Serrated:
Yes, Feature: Tungsten Carbide
Clip Lead 1m TP ShieldedBiopac Systems, IncLEAD110SShielded lead wires for EMG
Data Acquisition SoftwareLabChartLabChart 7.3.8Data recording, visualization, and analysis software for multi-channel recordings and real-time assessments
Data Analysis Software - Matlab 2023bMathworks, Inc.Version 23.2General purpose programming language for post hoc analysis
Dissecting KnifeFine Science Tools10056-12Cutting Edge: 4 mm, Thickness: 0.5 mm, Alloy / Material: Stainless Steel, Length: 12.5 cm, Blade Shape: Angled 30°
Dumont #3 ForcepsFine Science Tools11293-00Style: #3, Tip Shape: Straight, Tips: Standard, Tip Dimensions: 0.17 x 0.1 mm, Length: 12 cm, Alloy / Material: Dumostar
Electromyogram AmplifierBiopac Systems, IncEMG100CEMG amplifier
Friedman RongeurFine Science Tools16000-14Tip Shape: Curved, Cup Size: 2.5mm, Alloy / Material: Stainless Steel, Length: 13cm, Joint Action: Single
Friedman-Pearson RongeursFine Science Tools16021-14Alloy / Material: Stainless Steel, Length: 14cm, Joint Action: Single, Cup Size: 1mm, Tip Shape: Curved
Isolated Power Supply ModuleBiopac Systems, IncIPS100COperates 100-series amplifier modules indepdent of the Biopac Systems, Inc.'s MP series Data Acquisition System
Kelly HemostatsFine Science Tools13019-14Tips: Serrated, Tip Width: 1.5mm, Clamping Length: 22mm, Alloy / Material: Stainless Steel, Length: 14cm, Tip Shape: Curved
Knife CuretteV. MuellerVM101-4414Tip: Sharp, Tip Diameter: 2 mm
Micro Dissecting ScissorsBiomedical Research Instruments, Inc.11-2420Length: 4", Angle: Straight, Blade Length: 23 mm
Multistranded stainless steel wireCooner Wire, Inc.AS 631AWG 40; Overall diameter: 0.011 mm (with insulation), 0.008 mm (without insulation).
PowerLab 8/35ADInstrumentsPL3508Data acquisition system
Scalpel Blade #11Fine Science Tools10011-00Blade Shape: Angled, Cutting Edge: 20 mm, Thickness: 0.4 mm, Alloy / Material: Carbon Steel
Scalpel Handle #3Fine Science Tools10003-12Alloy / Material: Stainless Steel, Length: 12 cm
Sprague Dawley RatInotivOrder code: 002Sprague Dawley outbred rats (female and male)
Surgical MicroscopeOlympusSZ61Surgical microscope 
Suture Cutting ScissorsGeorge Tiemann & Co.110-1250SBAlloy / Material: Stainless Steel, Tip Shape: Straight, Tips: Sharp/Blunt, Length: 4.5"
Vannas Spring ScissorsFine Science Tools15000-08Tips: Sharp, Cutting Edge: 2.5 mm, Tip Diameter: 0.05 mm, Length: 8 cm, Alloy / Material: Stainless Steel, Serrated: No, Tip Shape: Straight
Weitlaner RetractorCodman50-5647Prongs: 2 x 3 Blunt, Length: 4.5"

Ссылки

  1. Center, N. S. C. I. S. Spinal cord injury model systems 2022 annual report - complete public version. Center, N. S. C. I. S. , University of Alabama at Birmingham. (2023).
  2. Punjani, N., Deska-Gauthier, D., Hachem, L. D., Abramian, M., Fehlings, M. G. Neuroplasticity and regeneration after spinal cord injury. N Am Spine Soc J. 15, 100235(2023).
  3. El-Bohy, A. A., Goshgarian, H. G. The use of single phrenic axon recordings to assess diaphragm recovery after cervical spinal cord injury. Exp Neurol. 156 (1), 172-179 (1999).
  4. Fuller, D. D., et al. Modest spontaneous recovery of ventilation following chronic high cervical hemisection in rats. Exp Neurol. 211 (1), 97-106 (2008).
  5. Fuller, D. D., et al. Graded unilateral cervical spinal cord injury and respiratory motor recovery. Respir Physiol Neurobiol. 165 (2-3), 245-253 (2009).
  6. Golder, F. J., et al. Respiratory motor recovery after unilateral spinal cord injury: Eliminating crossed phrenic activity decreases tidal volume and increases contralateral respiratory motor output. J Neurosci. 23 (6), 2494-2501 (2003).
  7. Golder, F. J., Reier, P. J., Davenport, P. W., Bolser, D. C. Cervical spinal cord injury alters the pattern of breathing in anesthetized rats. J Appl Physiol. 91 (6), 2451-2458 (2001).
  8. Goshgarian, H. G. The role of cervical afferent nerve fiber inhibition of the crossed phrenic phenomenon. Exp Neurol. 72 (1), 211-225 (1981).
  9. Keomani, E., et al. A murine model of cervical spinal cord injury to study post-lesional respiratory neuroplasticity. J Vis Exp. (87), e51235(2014).
  10. Miyata, H., Zhan, W. Z., Prakash, Y. S., Sieck, G. C. Myoneural interactions affect diaphragm muscle adaptations to inactivity. J Appl Physiol. 79 (5), 1640-1649 (1995).
  11. Moreno, D. E., Yu, X. J., Goshgarian, H. G. Identification of the axon pathways which mediate functional recovery of a paralyzed hemidiaphragm following spinal cord hemisection in the adult rat. Exp Neurol. 116 (3), 219-228 (1992).
  12. Porter, W. T. The path of the respiratory impulse from the bulb to the phrenic nuclei. J Physiol. 17 (6), 455-485 (1895).
  13. Zhan, W. Z., Miyata, H., Prakash, Y. S., Sieck, G. C. Metabolic and phenotypic adaptations of diaphragm muscle fibers with inactivation. J Appl Physiol. 82 (4), 1145-1153 (1997).
  14. Smith, J. C., Ellenberger, H. H., Ballanyi, K., Richter, D. W., Feldman, J. L. Pre-botzinger complex: A brainstem region that may generate respiratory rhythm in mammals. Science. 254 (5032), 726-729 (1991).
  15. Vinit, S., Gauthier, P., Stamegna, J. C., Kastner, A. High cervical lateral spinal cord injury results in long-term ipsilateral hemidiaphragm paralysis. J Neurotrauma. 23 (7), 1137-1146 (2006).
  16. Warren, P. M., et al. Rapid and robust restoration of breathing long after spinal cord injury. Nat Commun. 9 (1), 4843(2018).
  17. Fogarty, M. J., Dasgupta, D., Khurram, O. U., Sieck, G. C. Chemogenetic inhibition of TrkB signalling reduces phrenic motor neuron survival and size. Mol Cell Neurosci. 125, 103847(2023).
  18. Gransee, H. M., Zhan, W. Z., Sieck, G. C., Mantilla, C. B. Targeted delivery of TrkB receptor to phrenic motoneurons enhances functional recovery of rhythmic phrenic activity after cervical spinal hemisection. PLoS One. 8 (5), e64755(2013).
  19. Gransee, H. M., Zhan, W. Z., Sieck, G. C., Mantilla, C. B. Localized delivery of brain-derived neurotrophic factor-expressing mesenchymal stem cells enhances functional recovery following cervical spinal cord injury. J Neurotrauma. 32 (3), 185-193 (2015).
  20. Mantilla, C. B., Greising, S. M., Stowe, J. M., Zhan, W. Z., Sieck, G. C. TrkB kinase activity is critical for recovery of respiratory function after cervical spinal cord hemisection. Exp Neurol. 261, 190-195 (2014).
  21. Sieck, G. C., Gransee, H. M., Zhan, W. Z., Mantilla, C. B. Acute intrathecal BDNF enhances functional recovery after cervical spinal cord injury in rats. J Neurophysiol. 125 (6), 2158-2165 (2021).
  22. Fuller, D. D., Golder, F. J., Olson, E. B., Mitchell, G. S. Recovery of phrenic activity and ventilation after cervical spinal hemisection in rats. J Appl Physiol. 100 (3), 800-806 (2006).
  23. Bezdudnaya, T., Hormigo, K. M., Marchenko, V., Lane, M. A. Spontaneous respiratory plasticity following unilateral high cervical spinal cord injury in behaving rats. Exp Neurol. 305, 56-65 (2018).
  24. Basso, D. M., Beattie, M. S., Bresnahan, J. C. A sensitive and reliable locomotor rating scale for open field testing in rats. J Neurotrauma. 12 (1), 1-21 (1995).
  25. Cloud, B. A., et al. Hemisection spinal cord injury in rat: The value of intraoperative somatosensory evoked potential monitoring. J Neurosci Methods. 211 (2), 179-184 (2012).
  26. Hurd, C., Weishaupt, N., Fouad, K. Anatomical correlates of recovery in single pellet reaching in spinal cord injured rats. Exp Neurol. 247, 605-614 (2013).
  27. Fouad, K., Hurd, C., Magnuson, D. S. Functional testing in animal models of spinal cord injury: Not as straight forward as one would think. Front Integr Neurosci. 7, 85(2013).
  28. Fouad, K., Popovich, P. G., Kopp, M. A., Schwab, J. M. The neuroanatomical-functional paradox in spinal cord injury. Nat Rev Neurol. 17 (1), 53-62 (2021).
  29. Fogarty, M. J., et al. Novel regenerative drug, SPG302 promotes functional recovery of diaphragm muscle activity after cervical spinal cord injury. J Physiol. 601 (12), 2513-2532 (2023).
  30. Prakash, Y. S., Miyata, H., Zhan, W. Z., Sieck, G. C. Inactivity-induced remodeling of neuromuscular junctions in rat diaphragmatic muscle. Muscle Nerve. 22 (3), 307-319 (1999).
  31. Sieck, G. C., Mantilla, C. B. Role of neurotrophins in recovery of phrenic motor function following spinal cord injury. Respir Physiol Neurobiol. 169 (2), 218-225 (2009).
  32. Brown, A. D., et al. Mitochondrial adaptations to inactivity in diaphragm muscle fibers. J Appl Physiol. 133 (1), 191-204 (2022).
  33. Rana, S., Zhan, W. Z., Mantilla, C. B., Sieck, G. C. Disproportionate loss of excitatory inputs to smaller phrenic motor neurons following cervical spinal hemisection. J Physiol. 598 (20), 4693-4711 (2020).
  34. Mantilla, C. B., Rowley, K. L., Zhan, W. Z., Fahim, M. A., Sieck, G. C. Synaptic vesicle pools at diaphragm neuromuscular junctions vary with motoneuron soma, not axon terminal, inactivity. Neuroscience. 146 (1), 178-189 (2007).
  35. Ford, G. T., Whitelaw, W. A., Rosenal, T. W., Cruse, P. J., Guenter, C. A. Diaphragm function after upper abdominal surgery in humans. Am Rev Respir Dis. 127 (4), 431-436 (1983).
  36. Road, J. D., Burgess, K. R., Whitelaw, W. A., Ford, G. T. Diaphragm function and respiratory response after upper abdominal surgery in dogs. J Appl Physiol Respir Environ Exerc Physiol. 57 (2), 576-582 (1984).
  37. Rana, S., Sunshine, M. D., Greer, J. J., Fuller, D. D. Ampakines stimulate diaphragm activity after spinal cord injury. J Neurotrauma. 38 (24), 3467-3482 (2021).
  38. Ghali, M. G., Marchenko, V. Dynamic changes in phrenic motor output following high cervical hemisection in the decerebrate rat. Exp Neurol. 271, 379-389 (2015).
  39. Ditunno, J. F., Little, J. W., Tessler, A., Burns, A. S. Spinal shock revisited: A four-phase model. Spinal Cord. 42 (7), 383-395 (2004).
  40. Khurram, O. U., Gransee, H. M., Sieck, G. C., Mantilla, C. B. Automated evaluation of respiratory signals to provide insight into respiratory drive. Respir Physiol Neurobiol. 300, 103872(2022).
  41. Khurram, O. U., Mantilla, C. B., Sieck, G. C. Neuromotor control of spontaneous quiet breathing in awake rats evaluated by assessments of diaphragm emg stationarity. J Neurophysiol. 130 (5), 1344-1357 (2023).
  42. Rana, S., Zhan, W. Z., Sieck, G. C., Mantilla, C. B. Cervical spinal hemisection alters phrenic motor neuron glutamatergic mRNA receptor expression. Exp Neurol. 353, 114030(2022).
  43. Mantilla, C. B., Greising, S. M., Zhan, W. Z., Seven, Y. B., Sieck, G. C. Prolonged c2 spinal hemisection-induced inactivity reduces diaphragm muscle specific force with modest, selective atrophy of type IIx and/or IIb fibers. J Appl Physiol. 114 (3), 380-386 (2013).
  44. Jensen, V. N., Romer, S. H., Turner, S. M., Crone, S. A. Repeated measurement of respiratory muscle activity and ventilation in mouse models of neuromuscular disease. J Vis Exp. (122), e55599(2017).
  45. Navarrete-Opazo, A., Mitchell, G. S. Recruitment and plasticity in diaphragm, intercostal, and abdominal muscles in unanesthetized rats. J Appl Physiol. 117 (2), 180-188 (2014).
  46. Redfern, M., Hughes, R., Chaffin, D. High-pass filtering to remove electrocardiographic interference from torso emg recordings. Clin Biomech. 8 (1), Bristol, Avon. 44-48 (1993).
  47. Seven, Y. B., Mantilla, C. B., Zhan, W. Z., Sieck, G. C. Non-stationarity and power spectral shifts in emg activity reflect motor unit recruitment in rat diaphragm muscle. Respir Physiol Neurobiol. 185 (2), 400-409 (2013).
  48. Christensen, H., Sogaard, K., Jensen, B. R., Finsen, L., Sjogaard, G. Intramuscular and surface emg power spectrum from dynamic and static contractions. J Electromyogr Kinesiol. 5 (1), 27-36 (1995).
  49. Belman, M. J., Sieck, G. C. The ventilatory muscles. Fatigue, endurance and training. Chest. 82 (6), 761-766 (1982).
  50. Belman, M. J., Sieck, G. C., Mazar, A. Aminophylline and its influence on ventilatory endurance in humans. Am Rev Respir Dis. 131 (2), 226-229 (1985).
  51. Levine, S., Gillen, J., Weiser, P., Gillen, M., Kwatny, E. Description and validation of an ecg removal procedure for emgdi power spectrum analysis. J Appl Physiol. 60 (3), 1073-1081 (1986).
  52. Schweitzer, T. W., Fitzgerald, J. W., Bowden, J. A., Lynne-Davies, P. Spectral analysis of human inspiratory diaphragmatic electromyograms. J Appl Physiol Respir Environ Exerc Physiol. 46 (1), 152-165 (1979).
  53. Sharp, J. T. The respiratory muscles in emphysema. Clin Chest Med. 4 (3), 421-432 (1983).
  54. Sinderby, C., Spahija, J., Beck, J. Changes in respiratory effort sensation over time are linked to the frequency content of diaphragm electrical activity. Am J Respir Crit Care Med. 163 (4), 905-910 (2001).
  55. Dougherty, B. J., et al. Recovery of inspiratory intercostal muscle activity following high cervical hemisection. Respir Physiol Neurobiol. 183 (3), 186-192 (2012).
  56. Lane, M. A., et al. Respiratory function following bilateral mid-cervical contusion injury in the adult rat. Exp Neurol. 235 (1), 197-210 (2012).
  57. Burns, D. P., Murphy, K. H., Lucking, E. F., O'halloran, K. D. Inspiratory pressure-generating capacity is preserved during ventilatory and non-ventilatory behaviours in young dystrophic mdx mice despite profound diaphragm muscle weakness. J Physiol. 597 (3), 831-848 (2019).
  58. Dow, D. E., Mantilla, C. B., Zhan, W. Z., Sieck, G. C. EMG-based detection of inspiration in the rat diaphragm muscle. Conf Proc IEEE Eng Med Biol Soc. 2006, 1204-1207 (2006).
  59. Rana, S., Sieck, G. C., Mantilla, C. B. Diaphragm electromyographic activity following unilateral midcervical contusion injury in rats. J Neurophysiol. 117 (2), 545-555 (2017).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на использование текста или рисунков этого JoVE статьи

Запросить разрешение

Смотреть дополнительные статьи

JoVE208

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Конфиденциальность

Условия эксплуатации

Политика

СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

РЕКОМЕНДОВАТЬ БИБЛИОТЕКЕ

НОВОСТИ JoVE

Исследования

Образование

АВТОРЫ

Библиотекарь

О JoVE

Авторские права © 2025 MyJoVE Corporation. Все права защищены