Inmunoensayo fluorescente de flujo lateral basado en nanoperlas de puntos cuánticos

Resumen

En este artículo, describimos un protocolo para la preparación de nanoperlas de puntos cuánticos (QDNB) y la detección de biomarcadores de enfermedades utilizando tiras de inmunoensayo de flujo lateral basadas en QDNB. Los resultados de la prueba pueden evaluarse cualitativamente bajo iluminación con luz ultravioleta y medirse cuantitativamente con un lector de tiras fluorescentes en 15 minutos.

Resumen

Los puntos cuánticos, también conocidos como nanocristales semiconductores, son nuevas etiquetas fluorescentes para la obtención de imágenes y sensores biológicos. Sin embargo, los conjugados de anticuerpo de puntos cuánticos con dimensiones pequeñas (~10 nm), preparados a través de laboriosos procedimientos de purificación, exhiben una sensibilidad limitada en la detección de ciertos marcadores de enfermedades traza utilizando tiras de inmunoensayo de flujo lateral. En este trabajo, presentamos un método para la preparación de nanoperlas de puntos cuánticos (QDNB) utilizando un método de evaporación en emulsión de un solo paso. Utilizando el QDNB preparado, se fabricó un inmunoensayo de flujo lateral fluorescente para detectar biomarcadores de enfermedades utilizando la proteína C reactiva (PCR) como ejemplo. A diferencia de las nanopartículas de un solo punto cuántico, los conjugados de nanoperlas de puntos cuánticos y anticuerpos son más sensibles como etiquetas de inmunoensayo debido a la amplificación de la señal mediante la encapsulación de cientos de puntos cuánticos en una nanoperla compuesta de polímero. Además, el mayor tamaño de los QDNB facilita la separación por centrifugación al conjugar los QDNB con anticuerpos. Se fabricó el inmunoensayo de flujo lateral fluorescente basado en QDNBs y se midió la concentración de PCR en la muestra en 15 min. Los resultados de la prueba pueden evaluarse cualitativamente bajo iluminación con luz ultravioleta y medirse cuantitativamente con un lector fluorescente en 15 minutos.

Introducción

Las tiras de inmunoensayo de flujo lateral (LFIA, por sus siglas en inglés) sirven como herramientas cruciales de detección rápida en el punto de atención ^1,2, particularmente en el cribado de enfermedades durante epidemias. Sin embargo, las tiras reactivas tradicionales de LFIA a base de oro coloidal exhiben una baja sensibilidad de detección y solo proporcionan resultados cualitativos³. Para mejorar la sensibilidad de detección de LFIA, han surgido varias nanopartículas nuevas, incluido el látex^{coloreado 4,5}, las nanopartícula....

Protocolo

El estudio fue aprobado por la Junta de Revisión Institucional del Hospital de Enfermedades de la Piel de Shanghái (No. 2020-15). Todos los procedimientos experimentales con muestras de sangre humana se llevaron a cabo en un laboratorio de Bioseguridad Nivel II. Los detalles de los reactivos y equipos utilizados en este estudio se enumeran en la Tabla de Materiales.

1. Preparación de nanoperlas QDs

NOTA: Para la síntesis de nanoperlas QD, se utilizó una técnica de evaporación de emulsión-solvente para sintetizar nanoperlas QD, con una proporción de fase oleosa a fase acuosa de 1:5.....

Discusión

En este trabajo se describe un protocolo para la preparación de nanoperlas de puntos cuánticos (QDNB)²⁷ y el uso de QDNB para la preparación de inmunoensayos fluorescentes de flujo lateral (LFIA). Se demuestra la medición cualitativa y cuantitativa de la PCR en muestras. Este LFIA basado en QDNB también se puede aplicar a otros biomarcadores de enfermedades^25,32, toxinas alimentarias^29,30

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
(dimethylamino)propyl)-N’-ethylcarbodiimide hydrochloride	Sigma-Aldrich	03450
Absorbance paper	Kinbio Biotech	CH37K
Bovine serum albumin	Sigma-Aldrich	B2064
Casein	Sigma-Aldrich	C8654
CdSe/ZnS quantum dot	Suzhou Mesolight Inc.	CdSe/ZnS-625
Choloroform	Sino Pharm	10006818
CRP antibody	Hytest Biotech	4C28
Fluorescent lateral flow assay reader	Suzhou Helmence Precision Instrument	FIC-H1
Glass fiber pad	Kinbio Biotech	SB06
Goat anti-rabbit IgG	Sangon Biotech	D111018
Nitrocellulose membrane	Satorious	CN140
Poly(styrene-maleic anhydride) copolymer	Sigma-Aldrich	S458066
Rabbit IgG	Sangon Biotech	D110502
Sodium dodecyl sulfate	Sino Pharm	30166428
Sodium hydroxide	Sino Pharm	10019718