Inmunoensayo fluorescente de flujo lateral basado en nanoperlas de puntos cuánticos

Resumen

En este artículo, describimos un protocolo para la preparación de nanoperlas de puntos cuánticos (QDNB) y la detección de biomarcadores de enfermedades utilizando tiras de inmunoensayo de flujo lateral basadas en QDNB. Los resultados de la prueba pueden evaluarse cualitativamente bajo iluminación con luz ultravioleta y medirse cuantitativamente con un lector de tiras fluorescentes en 15 minutos.

Resumen

Los puntos cuánticos, también conocidos como nanocristales semiconductores, son nuevas etiquetas fluorescentes para la obtención de imágenes y sensores biológicos. Sin embargo, los conjugados de anticuerpo de puntos cuánticos con dimensiones pequeñas (~10 nm), preparados a través de laboriosos procedimientos de purificación, exhiben una sensibilidad limitada en la detección de ciertos marcadores de enfermedades traza utilizando tiras de inmunoensayo de flujo lateral. En este trabajo, presentamos un método para la preparación de nanoperlas de puntos cuánticos (QDNB) utilizando un método de evaporación en emulsión de un solo paso. Utilizando el QDNB preparado, se fabricó un inmunoensayo de flujo lateral fluorescente para detectar biomarcadores de enfermedades utilizando la proteína C reactiva (PCR) como ejemplo. A diferencia de las nanopartículas de un solo punto cuántico, los conjugados de nanoperlas de puntos cuánticos y anticuerpos son más sensibles como etiquetas de inmunoensayo debido a la amplificación de la señal mediante la encapsulación de cientos de puntos cuánticos en una nanoperla compuesta de polímero. Además, el mayor tamaño de los QDNB facilita la separación por centrifugación al conjugar los QDNB con anticuerpos. Se fabricó el inmunoensayo de flujo lateral fluorescente basado en QDNBs y se midió la concentración de PCR en la muestra en 15 min. Los resultados de la prueba pueden evaluarse cualitativamente bajo iluminación con luz ultravioleta y medirse cuantitativamente con un lector fluorescente en 15 minutos.

Introducción

Las tiras de inmunoensayo de flujo lateral (LFIA, por sus siglas en inglés) sirven como herramientas cruciales de detección rápida en el punto de atención ^1,2, particularmente en el cribado de enfermedades durante epidemias. Sin embargo, las tiras reactivas tradicionales de LFIA a base de oro coloidal exhiben una baja sensibilidad de detección y solo proporcionan resultados cualitativos³. Para mejorar la sensibilidad de detección de LFIA, han surgido varias nanopartículas nuevas, incluido el látex^{coloreado 4,5}, las nanopartículas fluorescentes de conversión ascendente⁶, las microesferas fluorescentes resueltas en el tiempo ^7,8 y los puntos cuánticos ^9,10,11. Los puntos cuánticos (QD)^12,13, también conocidos como nanocristales semiconductores, ofrecen longitudes de onda de emisión sintonizables, un amplio rango de excitación y una alta eficiencia de luminiscencia, lo que los convierte en etiquetas ideales para la obtención de imágenes biológicas.

Sin embargo, la señal de fluorescencia emitida por los puntos cuánticos individuales sigue siendo débil, lo que da lugar a una sensibilidad de detección relativamente baja en los inmunoensayos. La encapsulación de numerosos puntos cuánticos dentro de microesferas puede amplificar las señales y mejorar la sensibilidad de los inmunoensayos basados en puntos cuánticos. Se han empleado varios métodos, como el autoensamblaje capa por capa 14,15,16,17,18, el método de hinchamiento^19,20 y la encapsulación de microesferas de sílice 21,22,23,24, para encapsular puntos cuánticos dentro de microesferas. Por ejemplo, las etiquetas de nanoesferas de sílice funcionalizadas con puntos cuánticos se pueden lograr aumentando la carga de QD por inmunorreacción intercalada²⁵. También se ha utilizado un secador por pulverización equipado con un atomizador ultrasónico para preparar nanoesferas QD-BSA²⁶ a nanoescala. Sin embargo, los métodos antes mencionados adolecen de complejos pasos múltiples, extinción por fluorescencia y baja productividad.

En nuestro trabajo anterior²⁷, se reportó un método de evaporación emulsión-solvente para encapsular puntos cuánticos dentro de nanoperlas de polímero. Esta técnica de preparación es simple, mantiene la eficiencia fluorescente de los QD, garantiza una alta eficiencia de encapsulación y permite una producción fácilmente escalable. Varios grupos de investigación han desarrollado con éxito tiras de LFIA utilizando QDNBs preparados a través de este método para aplicaciones, incluyendo la detección de toxinas alimentarias 28,29,30, la detección de biomarcadores de enfermedades infecciosas ^31,32 y el monitoreo ambiental³³.

Este protocolo presenta pasos específicos de preparación para nanoperlas de puntos cuánticos (QDNB), QDNB y conjugación de anticuerpos, preparación de LFIA basada en QDNB y medición de proteína C reactiva (CRP) en muestras de plasma humano.

Protocolo

El estudio fue aprobado por la Junta de Revisión Institucional del Hospital de Enfermedades de la Piel de Shanghái (No. 2020-15). Todos los procedimientos experimentales con muestras de sangre humana se llevaron a cabo en un laboratorio de Bioseguridad Nivel II. Los detalles de los reactivos y equipos utilizados en este estudio se enumeran en la Tabla de Materiales.

1. Preparación de nanoperlas QDs

NOTA: Para la síntesis de nanoperlas QD, se utilizó una técnica de evaporación de emulsión-solvente para sintetizar nanoperlas QD, con una proporción de fase oleosa a fase acuosa de 1:5. La mini emulsión se genera mediante ultrasonidos, y las nanoperlas se solidifican mediante la evaporación del disolvente (cloroformo). El hidróxido de sodio se utilizó para catalizar la hidrólisis de los grupos anhídrido en la superficie de las nanoperlas, convirtiéndolos en grupos carboxilo.

1. Preparación de soluciones en fase oleosa y en fase acuosa
   1. Prepare 1 mL de fase oleosa: 0,4 mL de solución de poli (anhídrido estireno-comaleico) (PSMA) (50 mg/mL), 0,1 mL de solución QDs (100 mg/mL), llene cualquier volumen inferior a 1 mL con cloroformo.
   2. Preparar 5 mL de fase acuosa: SDS solución acuosa (0,5 % en peso).
2. Preparación de la emulsión y solidificación
   1. Agregue 1 mL de fase oleosa y 5 mL de fase acuosa a un vial (15 mL) y coloque el vial en un agitador magnético. Encienda la alimentación del agitador magnético.
   2. Una vez que las fases de aceite y acuosa se hayan mezclado por completo, transfiera inmediatamente el matraz a la ultrasonicación programada (60 s, un pulso de 3 s seguido de una pausa de 3 s, 50% de amplitud) y encienda la alimentación.
   3. Observe la solución después de la ultrasonicación. La solución inicialmente de color carmesí pasó a una fase opalescente que aún conserva un matiz rojizo.
   4. Vuelva a colocar el vial en el agitador magnético a temperatura ambiente, agitando continuamente durante la noche. El cloroformo se evaporó gradualmente y la emulsión se solidificó en nanoperlas compuestas.
3. Modificación de la superficie de las nanoperlas
   1. Añadir 0,1 mL de hidróxido de sodio 0,1 mM a la suspensión de nanoperlas durante 1 h. Los grupos anhídrido en la superficie de las nanoperlas se hidrolizan en grupos carboxilo.
4. Purificación de nanoperlas
   1. Apague el agitador magnético y mueva las nanoperlas solidificadas a un tubo de centrífuga. Centrifugar el tubo a 13523 x g durante 10 min a temperatura ambiente y desechar el sobrenadante.
   2. Agregue el volumen inicial de agua desionizada a la precipitación, cubra el tubo con su tapa, sumérjalo en el baño de agua ultrasónico y mantenga la inmersión hasta que el precipitado se disperse por completo.
   3. Repita los pasos 1.4.1-1.4.2 dos veces y, finalmente, transfiera las nanoperlas a la botella de vidrio. Guárdelo a 4 °C hasta su uso.
5. Caracterización de nanoperlas
   1. Caracterizar el tamaño y la morfología de las nanoperlas QDs utilizando imágenes de microscopía electrónica de transmisión (TEM)²².
      NOTA: Se pueden obtener diferentes tamaños de nanoperlas cambiando la proporción de la solución QDs y la solución PSMA. El tamaño de las nanoperlas QDs también se puede determinar a través de la dispersión dinámica de la luz (DLS)²⁷.

2. Preparación de conjugados QDNB-anticuerpo

1. Activación de grupos carboxilo
   1. Añadir 100 μL de QDNB preparado (10 mg/mL) en 200 μL de tampón de fosfato (PB, 20 mM, pH 6,0), luego añadir 6 μL de EDC (20 mg/mL).
   2. Incubar la mezcla durante 30 min a temperatura ambiente en una batidora rotativa.
   3. Después de la incubación, centrifugar la mezcla a 13523 x g durante 10 min a temperatura ambiente y desechar el sobrenadante.
   4. Añada 100 μL de PB (20 mM, pH 6,0) a la precipitación, cubra el tubo con su tapa y sumerja el tubo en el baño de agua ultrasónico operativo hasta que el precipitado se disperse por completo.
2. Conjugación de anticuerpo y nanoperlas
   1. Dispersar 100 μg de anticuerpo en 200 μL de PB (20 mM, pH 6,0) y añadir la suspensión de QDNB activada obtenida en el paso 2.1 en la solución de anticuerpos.
   2. Incubar la mezcla a temperatura ambiente durante 30 min con rotación continua. Elimine el exceso de anticuerpos por centrifugación a 6010 x g durante 5 min (a temperatura ambiente) y luego deseche cuidadosamente el sobrenadante.
3. Bloqueo de nanoperlas
   1. Añadir 200 μL de solución de caseína al 1% (en tampón PB de 20 mM, pH 7,4) al residuo (obtenido en el paso 2.2.2), cubrir el tubo con su tapa y sumergirlo en el baño de agua ultrasónico operativo hasta que el residuo se disperse por completo.
   2. Incubar la mezcla a temperatura ambiente durante 2 h con rotación continua.
      NOTA: El objetivo de este paso es bloquear cualquier sitio no reaccionado en la superficie de QDNB.
4. Almacenamiento de conjugados
   1. Añadir 100 μL de solución conservante (20 mM de tampón PB, pH 7,4, 1% BSA, 5% trehalosa, 6% sacarosa, 0,1% S9, pH 7,4) a la mezcla y almacenar a 4 °C para su uso posterior.

3. Preparación de tiras de inmunoensayo de flujo lateral

NOTA: La tira inmunocromatográfica está compuesta por una membrana de nitrocelulosa (NC), una almohadilla de muestra, una almohadilla conjugada, una almohadilla absorbente y una placa de cloruro de polivinilo (PVC) (Figura 1). Todas las soluciones deben prepararse y usarse de inmediato. Se recomienda que las tiras de inmunoensayo de flujo lateral se preparen en una sala limpia con humedad controlada.

1. Preparación de la membrana NC
   1. Prepare la solución de recubrimiento de la línea de prueba (línea T) y la línea de control (línea C): diluya el anticuerpo de captura de CRP y la IgG anti-conejo de cabra con PB hasta una concentración final de 1 mg/mL.
   2. Coloque correctamente el tablero de PVC y retire el papel protector ubicado a 25 mm del borde del tablero de PVC. Alinee y adhiera la membrana NC a lo largo del borde inferior del papel protector restante a la placa de PVC.
   3. Dispense las soluciones de recubrimiento de la línea T y la línea C sobre la membrana NC a una tasa de inyección de 1 μL/cm, asegurándose de que se coloque a 20 mm de distancia del borde superior, formando una línea de prueba (1 mm de ancho).
   4. Coloque la membrana NC en condiciones con una humedad inferior al 30% y un rango de temperatura de 18-26 °C para el secado. El tiempo de secado debe ser de al menos 24 h.
      NOTA: Asegúrese de que los bordes superior e inferior de la membrana NC estén al ras con los bordes correspondientes de las áreas adyacentes. Las membranas NC no deben tocarse con las manos. La humedad durante este paso debe controlarse dentro del rango de 45% a 65%. Antes de continuar, la solución de recubrimiento de la línea T, la solución de recubrimiento de la línea C y la membrana NC deben equilibrarse a la misma temperatura.
2. Preparación de la almohadilla conjugada
   1. Sumerja la almohadilla conjugada en la solución de tratamiento de la almohadilla conjugada (tampón PB de 20 mM, pH 7,4, 1% BSA).
   2. Coloque la almohadilla conjugada empapada en un horno de secado para el tratamiento de secado (temperatura ambiente) durante la noche.
   3. Adherir suavemente la almohadilla conjugada modificada sobre la placa de PVC.
   4. Diluir la solución conjugada de QDNB-anticuerpo preparada con la solución conservante (20 mM de tampón PB, pH 7,4, 1% BSA, 5% trehalosa, 6% sacarosa, 0,1% S9, pH 7,4).
   5. Dispense la solución conjugada de QDNB-anticuerpo en la almohadilla conjugada a una velocidad de inyección de 1 μL/cm y seque la almohadilla conjugada durante 24 h.
      NOTA: La relación de dilución específica debe ajustarse de acuerdo con el objetivo de detección.
3. Preparación de la almohadilla de muestras
   1. Sumerja la almohadilla de muestra en la solución de tratamiento de la almohadilla de muestra (20 mM de tampón PB, pH 7,4, 1% BSA, 5% trehalosa, 6% sacarosa, 0,1% S9, pH 7,4).
   2. Coloque la almohadilla de muestra empapada en un horno de secado (45 °C) y seque durante 24 h.
4. Ensamblar la tarjeta y cortarla en tiras
   1. Como se muestra en la Figura 1, coloque sucesivamente el papel absorbente (almohadilla absorbente), la almohadilla conjugada y la almohadilla de muestra en la placa de PVC con membrana NC.
   2. Corta la tarjeta en tiras de 3,8 mm de ancho.
5. Embalaje de las tiras
   1. Envuelva las tiras reactivas en un casete de plástico y selle una bolsa de papel de aluminio que contenga un desecante.

4. Operación del ensayo y evaluación cualitativa

NOTA: Se recomienda que las operaciones con muestras de sangre humana se realicen en un laboratorio de Bioseguridad de Nivel II. Las muestras de plasma humano se obtuvieron de un laboratorio clínico (de sujetos humanos no identificados). Típicamente, la sangre humana se recolectó utilizando un tubo de vacío de EDTA y el plasma se aisló de acuerdo con el protocolo estándar³⁴. Centrifugar a 3.000 × g durante 10 min a temperatura ambiente para la separación por plasma. Recoja la capa superior de plasma amarillo con una pipeta y almacene el plasma en un tubo de 1,5 ml a -80 °C hasta su uso.

1. Pipetear 10 μL de muestra de plasma o solución de calibrador en 1 mL de un tampón PBS que contenga 0,1% de Tween 20. A continuación, transfiera 100 μL de la muestra diluida preparada a la almohadilla de muestra de la tira reactiva.
2. Después de una carrera de 15 minutos, observe las señales de fluorescencia de la línea T y la línea C bajo la exposición a la luz ultravioleta para obtener resultados cualitativos.
3. Inserte la tarjeta de tiras en un lector de ensayo de flujo lateral fluorescente para obtener las intensidades de fluorescencia para el análisis cuantitativo.
   NOTA: En este ejemplo, se emplea el método de inmunoensayo sándwich ^35,36; Una línea roja (línea de control) indica un resultado negativo, mientras que las dos líneas rojas (líneas de prueba y de control) indican un resultado positivo. La ausencia de la línea de control indica que la prueba realizada no es válida.

Resultados

Los procedimientos de preparación de QDNB se ilustran esquemáticamente en la Figura 1A. La fase oleosa que contenía QDs y polímero en cloroformo se mezcló con la fase acuosa, y se obtuvo una miniemulsión por sonicación. La emulsión se solidificó por evaporación gradual del cloroformo. La micrografía electrónica de transmisión (TEM) de QDNB se presenta en la Figura 2A. Los QDNBs tienen una morfología esférica, con diámetros medios de 96 nm, medido...

Discusión

En este trabajo se describe un protocolo para la preparación de nanoperlas de puntos cuánticos (QDNB)²⁷ y el uso de QDNB para la preparación de inmunoensayos fluorescentes de flujo lateral (LFIA). Se demuestra la medición cualitativa y cuantitativa de la PCR en muestras. Este LFIA basado en QDNB también se puede aplicar a otros biomarcadores de enfermedades^25,32, toxinas alimentarias^29,30

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
(dimethylamino)propyl)-N’-ethylcarbodiimide hydrochloride	Sigma-Aldrich	03450
Absorbance paper	Kinbio Biotech	CH37K
Bovine serum albumin	Sigma-Aldrich	B2064
Casein	Sigma-Aldrich	C8654
CdSe/ZnS quantum dot	Suzhou Mesolight Inc.	CdSe/ZnS-625
Choloroform	Sino Pharm	10006818
CRP antibody	Hytest Biotech	4C28
Fluorescent lateral flow assay reader	Suzhou Helmence Precision Instrument	FIC-H1
Glass fiber pad	Kinbio Biotech	SB06
Goat anti-rabbit IgG	Sangon Biotech	D111018
Nitrocellulose membrane	Satorious	CN140
Poly(styrene-maleic anhydride) copolymer	Sigma-Aldrich	S458066
Rabbit IgG	Sangon Biotech	D110502
Sodium dodecyl sulfate	Sino Pharm	30166428
Sodium hydroxide	Sino Pharm	10019718