זרימה צידית פלואורסצנטית Immunoassay מבוסס על נקודות קוונטיות ננו-חרוזים

Summary

במאמר זה אנו מתארים פרוטוקול להכנת ננו-חרוזי נקודה קוונטית (QDNB) ולזיהוי סמנים ביולוגיים של מחלות באמצעות רצועות חיסון מבוססות זרימה צידית מבוססות QDNB. ניתן להעריך את תוצאות הבדיקה באופן איכותי תחת תאורת אור UV ולמדוד כמותית באמצעות קורא פס פלואורסצנטי תוך 15 דקות.

Abstract

נקודות קוונטיות, הידועות גם בשם ננו-גבישים מוליכים למחצה, הן תוויות פלואורסצנטיות חדשניות לדימות וחישה ביולוגיים. עם זאת, נוגדנים נקודתיים קוונטיים מצומדים עם ממדים קטנים (~ 10 ננומטר), שהוכנו באמצעות הליכי טיהור מייגעים, מפגינים רגישות מוגבלת בזיהוי סמנים מסוימים של מחלת קורט באמצעות רצועות חיסון זרימה רוחבית. כאן אנו מציגים שיטה להכנת ננו-חרוזי נקודה קוונטית (QDNB) בשיטת אידוי תחליב חד-שלבית. באמצעות QDNB כפי שהוכן, חיסון זרימה צידית פלואורסצנטית יוצר כדי לזהות סמנים ביולוגיים של מחלות באמצעות חלבון מגיב C (CRP) כדוגמה. שלא כמו ננו-חלקיקים של נקודה קוונטית בודדת, מצומדים של ננו-נוגדנים של נקודה קוונטית רגישים יותר כמו תוויות אימונואסאי בשל הגברת האות על ידי עטיפת מאות נקודות קוונטיות בננו-חרוז פולימרי מרוכב אחד. יתר על כן, הגודל הגדול יותר של QDNBs מאפשר הפרדת צנטריפוגות קלה יותר בעת הצמדת QDNB עם נוגדנים. בדיקת הזרימה הצידית הפלואורסצנטית המבוססת על QDNBs הייתה מפוברקת, וריכוז CRP בדגימה נמדד תוך 15 דקות. ניתן להעריך את תוצאות הבדיקה באופן איכותי תחת תאורת אור UV ולמדוד כמותית באמצעות קורא פלואורסצנטי תוך 15 דקות.

Introduction

רצועות Lateral flow immunoassay (LFIA) משמשות ככלים חיוניים לגילוי מהיר בנקודות טיפול ^1,2, במיוחד בבדיקות סקר למחלות במהלך מגיפות. עם זאת, רצועות בדיקת LFIA מסורתיות מבוססות זהב קולואידיות מציגות רגישות זיהוי נמוכה ומספקות רק תוצאות איכותיות³. כדי לשפר את רגישות הזיהוי של LFIA, הופיעו ננו-חלקיקים חדשים שונים, כולל לטקס צבעוני ^4,5,^{ננו-חלקיקים} פלואורסצנטיים 6, מיקרוספרות פלואורסצנטיות ^7,8 ונקודות קוונטיות ^9,10,11. נקודות קוונטיות (QDs)^12,13, הידועות גם כננו-גבישים מוליכים למחצה, מציעות אורכי גל של פליטה מתכווננת, טווח עירור רחב ויעילות הארה גבוהה, מה שהופך אותן לתוויות אידיאליות לדימות ביולוגי.

עם זאת, האות הפלואורסצנטי הנפלט מנקודות קוונטיות בודדות נותר חלש, וכתוצאה מכך רגישות הזיהוי נמוכה יחסית באימונואסות. אנקפסולציה של נקודות קוונטיות רבות בתוך מיקרוספרות יכולה להגביר אותות ולשפר את הרגישות של בדיקות חיסוניות מבוססות נקודות קוונטיות. שיטות שונות, כגון הרכבה עצמית שכבה אחר שכבה 14,15,16,17,18, שיטת הנפיחות^19,20, ומיקרספירת סיליקה 21,22,23,24 אנקפסולציה, שימשו כדי לתמצת נקודות קוונטיות בתוך מיקרוספרות. לדוגמה, ניתן להשיג תוויות ננו-ספירה של סיליקה עם פונקציונליות של נקודות קוונטיות על ידי הגדלת עומס QD לכל תגובה חיסונית דחוקה²⁵. מייבש ריסוס המצויד באטומיזר על-קולי שימש גם להכנת ננו-ספירות QD-BSA^{ננומטריות 26}. עם זאת, השיטות הנ"ל סובלות מריבוי שלבים מורכבים, מרווה פלואורסצנטית ופרודוקטיביות נמוכה.

בעבודתנו הקודמת²⁷ דווח על שיטת אידוי תחליב-ממס לעטיפת נקודות קוונטיות בתוך ננו-חרוזים פולימריים. טכניקת הכנה זו פשוטה, שומרת על היעילות הפלואורסצנטית של QDs, מבטיחה יעילות אנקפסולציה גבוהה ומאפשרת ייצור קל להרחבה. מספר קבוצות מחקר פיתחו בהצלחה רצועות LFIA באמצעות QDNB שהוכנו בשיטה זו ליישומים, כולל זיהוי רעלני מזון 28,29,30, זיהוי סמנים ביולוגיים של מחלות זיהומיות ^31,32 וניטור סביבתי³³.

פרוטוקול זה מציג שלבי הכנה ספציפיים עבור ננו-חרוזי נקודה קוונטית (QDNB), QDNB וצימוד נוגדנים, הכנת FFIA מבוסס QDNB ומדידה של חלבון מגיב C (CRP) בדגימות פלזמה אנושיות.

Protocol

המחקר אושר על ידי מועצת הסקירה המוסדית של בית החולים למחלות עור בשנחאי (מס '2020-15). כל ההליכים הניסיוניים הכוללים דגימות דם אנושיות נערכו במעבדה ברמת בטיחות ביולוגית II. פרטי הריאגנטים והציוד ששימשו במחקר זה מפורטים בטבלת החומרים.

1. הכנת ננו-חרוזי QDs

הערה: עבור סינתזת ננו-חרוזי QD, נעשה שימוש בטכניקת אידוי תחליב-ממס כדי לסנתז ננו-חרוזי QD, עם יחס בין פאזת שמן לשלב מים של 1:5. תחליב המיני נוצר באמצעות אולטרסוניקציה, והננו-חרוזים מתמצקים באמצעות אידוי ממס (כלורופורם). נתרן הידרוקסידי נוצל כדי לזרז את ההידרוליזה של קבוצות אנהידריד על פני השטח של ננו-חרוזים, ולהמיר אותם לקבוצות קרבוקסיל.

1. הכנת תמיסות פאזת שמן ופזה מימית
   1. הכן 1 מ"ל של שלב שמן: 0.4 מ"ל של פולי (סטירן-co-maleic אנהידריד) תמיסת (PSMA) (50 מ"ג / מ"ל), 0.1 מ"ל של תמיסת QDs (100 מ"ג / מ"ל), מלא כל נפח פחות מ 1 מ"ל עם כלורופורם.
   2. הכן 5 מ"ל של פאזה מימית: תמיסה מימית SDS (0.5 wt %).
2. הכנת תחליב והתמצקות
   1. מוסיפים 1 מ"ל פאזת שמן ו-5 מ"ל פאזה מימית לבקבוקון (15 מ"ל), ומניחים את הבקבוקון על מערבל מגנטי. הפעל את עוצמת המערבל המגנטי.
   2. לאחר שהשמן והשלבים המימיים מעורבבים לחלוטין, העבירו מיד את הבקבוק לאולטרסוניקציה המתוכנתת (60 שניות, פולס של 3 שניות ואחריו הפסקה של 3 שניות, 50% משרעת) והפעילו את הכוח.
   3. שימו לב לפתרון לאחר ultrasonication. התמיסה הראשונית בצבע ארגמן עברה לשלב אטום שעדיין שומר על גוון אדמדם.
   4. החזירו את הבקבוקון למערבל המגנטי בטמפרטורת החדר, תוך ערבוב מתמשך למשך הלילה. הכלורופורם התאדה בהדרגה, והתחליב התמצק לננו-חרוזים מרוכבים.
3. שינוי פני השטח של ננו-חרוזים
   1. הוסף 0.1 מ"ל של 0.1 mM נתרן הידרוקסידי לתרחיף ננו-חרוזים למשך שעה אחת. קבוצות האנהידריד על פני השטח של ננו-חרוזים עוברות הידרוליזה לקבוצות קרבוקסיל.
4. טיהור ננו-חרוזים
   1. כבו את המערבל המגנטי והעבירו את ננו-חרוזי הננו-חרוזים המוצקים לצינור צנטריפוגה. צנטריפוגה את הצינור ב 13523 x גרם במשך 10 דקות בטמפרטורת החדר, ולהשליך את supernatant.
   2. הוסף את הנפח הראשוני של מים deionized למשקעים, לכסות את הצינור עם המכסה שלה, לטבול אותו לתוך אמבט מים קולי, ולשמור על טבילה עד המשקע הוא התפזר במלואו.
   3. חזור על שלבים 1.4.1-1.4.2 פעמיים, ולבסוף, העבר את ננו-החרוזים לבקבוק הזכוכית. יש לאחסן בטמפרטורה של 4°C עד לשימוש.
5. אפיון ננו-חרוזים
   1. אפיין את הגודל והמורפולוגיה של ננו-חרוזי QDs באמצעות הדמיית מיקרוסקופ אלקטרוני שידור (TEM)²².
      הערה: ניתן להשיג גדלים שונים של ננו-חרוזים על-ידי שינוי היחס בין תמיסת QDs ותמיסת PSMA. ניתן לקבוע את גודל ננו-חרוזי QDs גם באמצעות פיזור אור דינמי (DLS)²⁷.

2. הכנת מצמידות נוגדנים QDNB

1. הפעלה של קבוצות קרבוקסיל
   1. הוסף 100 μL של QDNB מוכן (10 מ"ג / מ"ל) ב 200 μL של חיץ פוספט (PB, 20 mM, pH 6.0), ולאחר מכן להוסיף 6 μL של EDC (20 מ"ג / מ"ל).
   2. דוגרים על התערובת במשך 30 דקות בטמפרטורת החדר על מיקסר סיבובי.
   3. לאחר הדגירה, צנטריפוגו את התערובת ב 13523 x גרם במשך 10 דקות בטמפרטורת החדר ולזרוק את supernatant.
   4. הוסף 100 μL של PB (20 mM, pH 6.0) למשקעים, לכסות את הצינור עם המכסה שלה, לטבול את הצינור לתוך אמבט מים קולי תפעולי עד המשקע הוא התפזר במלואו.
2. צימוד נוגדנים וננו-חרוזים
   1. יש לפזר נוגדנים של 100 מיקרוגרם ב-200 מיקרוליטר של PB (20 מילימול, pH 6.0) ולהוסיף את תרחיף ה-QDNB המופעל שהתקבל משלב 2.1 לתמיסת הנוגדנים.
   2. דוגרים על התערובת בטמפרטורת החדר למשך 30 דקות עם סיבוב רציף. הסר נוגדנים עודפים על ידי צנטריפוגה ב 6010 x גרם במשך 5 דקות (בטמפרטורת החדר), ולאחר מכן בזהירות להשליך את supernatant.
3. חסימה של ננו-חרוזים
   1. הוסף 200 μL של תמיסת קזאין 1% (במאגר PB של 20 mM, pH 7.4) לשאריות (המתקבלות בשלב 2.2.2), כסה את הצינור במכסה שלו וטבול אותו באמבט המים האולטרסוני התפעולי עד שהשאריות מפוזרות במלואן.
   2. דוגרים על התערובת בטמפרטורת החדר במשך שעתיים עם סיבוב רציף.
      הערה: מטרת שלב זה היא לחסום אתרים שלא הגיבו על פני השטח של QDNB.
4. אחסון של מצומדים
   1. הוסף 100 μL של תמיסת חומר משמר (20 mM PB buffer, pH 7.4, 1% BSA, 5% trehalose, 6% סוכרוז, 0.1% S9, pH 7.4) לתערובת ואחסן ב 4 ° C לשימוש לאחר מכן.

3. הכנת רצועות immunoassay זרימה לרוחב

הערה: הרצועה האימונוכרומטוגרפית מורכבת מקרום ניטרוצלולוז (NC), כרית דגימה, פד מצומד, פד סופג ולוח פוליוויניל כלוריד (PVC) (איור 1). יש להכין את כל הפתרונות ולהשתמש בהם באופן מיידי. מומלץ להכין רצועות אימונואסאי זרימה לרוחב בחדר נקי עם לחות מבוקרת.

1. הכנת קרום NC
   1. הכינו תמיסת ציפוי קו בדיקה (T-line) וקו בקרה (C-line): דללו את נוגדן לכידת CRP ואת IgG נגד ארנב עיזים עם PB לריכוז סופי של 1 מ"ג/מ"ל.
   2. הניחו את לוח ה-PVC כראוי, והסירו את נייר המגן הממוקם 25 מ"מ מקצה לוח ה-PVC. יישרו והצמידו את קרום NC לאורך הקצה התחתון של נייר המגן שנותר ללוח ה-PVC.
   3. יש לפזר תמיסות ציפוי T-line ו-C-line על קרום NC בקצב סילון של 1 μL/cm, ולהבטיח שהוא ממוקם במרחק של 20 מ"מ מהקצה העליון, ויוצר קו בדיקה (1 מ"מ רוחב).
   4. מקם את קרום NC בתנאים עם לחות של פחות מ -30% וטווח טמפרטורות של 18-26 ° C לייבוש. זמן הייבוש צריך להיות לפחות 24 שעות.
      הערה: ודא שהקצוות העליונים והתחתונים של קרום NC צמודים לקצוות המתאימים של האזורים הסמוכים. אין לגעת בקרומי NC בידיים. הלחות במהלך שלב זה צריכה להיות נשלטת בטווח של 45% עד 65%. לפני שתמשיך, יש לאזן את תמיסת ציפוי קו T, תמיסת ציפוי קו C וקרום NC לאותה טמפרטורה.
2. הכנת הפד המצומד
   1. יש לטבול את הפד המצומד בתמיסת הטיפול בפד המצומד (20 mM PB buffer, pH 7.4, 1% BSA).
   2. הכניסו את כרית ההצמדה הספוגה לתנור ייבוש לטיפול ייבוש (בטמפרטורת החדר) למשך הלילה.
   3. הדביקו בעדינות את משטח ההצמדה שהשתנה על לוח ה-PVC.
   4. לדלל את הפתרון המצומד מוכן נוגדנים QDNB עם פתרון משמר (20 mM PB buffer, pH 7.4, 1% BSA, 5% trehalose, 6% סוכרוז, 0.1% S9, pH 7.4).
   5. יש להוציא את תמיסת הנוגדנים המצומדים QDNB על כרית הצמידות בקצב סילון של 1 μL/cm ולייבש את הפד המצומד למשך 24 שעות.
      הערה: יש להתאים את יחס הדילול הספציפי בהתאם ליעד האיתור.
3. הכנת פנקס מדגם
   1. יש לטבול את כרית הדגימה בתמיסת הטיפול בכרית הדגימה (20 mM PB buffer, pH 7.4, 1% BSA, 5% trehalose, 6% סוכרוז, 0.1% S9, pH 7.4).
   2. הכניסו את כרית הדגימה הספוגה לתנור ייבוש (45°C) וייבשו במשך 24 שעות.
4. הרכבת הכרטיס וחיתוכו לרצועות
   1. כפי שניתן לראות באיור 1, הניחו ברצף את נייר הספיגה (פד סופג), פד מצומד ומשטח דגימה על לוח PVC עם קרום NC.
   2. חותכים את הכרטיס לרצועות רוחב 3.8 מ"מ.
5. אריזת הרצועות
   1. עטפו את רצועות הבדיקה בקסטת פלסטיק ואטמו נרתיק רדיד אלומיניום המכיל חומר ייבוש.

4. פעולת בדיקה והערכה איכותית

הערה: פעולות הכוללות דגימות דם אנושיות מומלצות לביצוע במעבדה ברמת בטיחות ביולוגית II. דגימות הפלזמה האנושיות התקבלו ממעבדה קלינית (מנבדקים אנושיים לא מזוהים). בדרך כלל, דם אנושי נאסף באמצעות שפופרת ואקום EDTA, והפלזמה בודדה על פי פרוטוקול סטנדרטי³⁴. צנטריפוגה ב-3,000 × גרם למשך 10 דקות בטמפרטורת החדר להפרדת פלזמה. אספו את השכבה העליונה של הפלזמה הצהובה באמצעות פיפטה, ואחסנו את הפלזמה בצינור של 1.5 מ"ל בטמפרטורה של -80°C עד לשימוש.

1. פיפטה 10 μL של דגימת פלזמה או תמיסת כיול לתוך 1 מ"ל של חיץ PBS המכיל 0.1% Tween 20. לאחר מכן, להעביר 100 μL של הדגימה מדולל מוכן על כרית הדגימה של רצועת הבדיקה.
2. לאחר ריצה של 15 דקות, צפו באותות הפלואורסצנטיים של קו T וקו C תחת חשיפה לאור אולטרה סגול כדי לקבל תוצאות איכותיות.
3. הכנס את כרטיס הרצועה לקורא בדיקת זרימה צידית פלואורסצנטית כדי לקבל את עוצמות הפלואורסצנטיות לניתוח כמותי.
   הערה: בדוגמה זו, שיטת החיסון של סנדוויץ' משמשת^35,36; קו אדום אחד (קו בקרה) מציין תוצאה שלילית, ואילו שני הקווים האדומים (קווי בדיקה ובקרה) מציינים תוצאה חיובית. היעדר קו הבקרה מעיד על כך שהבדיקה שנערכה אינה חוקית.

תוצאות

הליכי הכנת QDNB מודגמים באופן סכמטי באיור 1A. שלב השמן המכיל QDs ופולימר בכלורופורם עורבב עם שלב המים, ומיני תחליב התקבל על ידי סוניקציה. התחליב התמצק על ידי אידוי הדרגתי של כלורופורם. מיקרוגרף אלקטרונים תמסורת (TEM) של QDNB מוצג באיור 2A. ל-QDNBs יש מורפולוגיה כדורית, ע?...

Discussion

במאמר זה אנו מתארים פרוטוקול להכנת ננו-כדוריות נקודה קוונטית (QDNB)²⁷ ושימוש ב-QDNB להכנת בדיקות חיסוניות פלואורסצנטיות לזרימה צידית (LFIA). מודגמת מדידה איכותית וכמותית של CRP במדגמים. LFIA מבוסס QDNB זה יכול להיות מיושם גם על סמנים ביולוגיים אחרים של מחלות^25,32...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
(dimethylamino)propyl)-N’-ethylcarbodiimide hydrochloride	Sigma-Aldrich	03450
Absorbance paper	Kinbio Biotech	CH37K
Bovine serum albumin	Sigma-Aldrich	B2064
Casein	Sigma-Aldrich	C8654
CdSe/ZnS quantum dot	Suzhou Mesolight Inc.	CdSe/ZnS-625
Choloroform	Sino Pharm	10006818
CRP antibody	Hytest Biotech	4C28
Fluorescent lateral flow assay reader	Suzhou Helmence Precision Instrument	FIC-H1
Glass fiber pad	Kinbio Biotech	SB06
Goat anti-rabbit IgG	Sangon Biotech	D111018
Nitrocellulose membrane	Satorious	CN140
Poly(styrene-maleic anhydride) copolymer	Sigma-Aldrich	S458066
Rabbit IgG	Sangon Biotech	D110502
Sodium dodecyl sulfate	Sino Pharm	30166428
Sodium hydroxide	Sino Pharm	10019718