Fluoreszierender Lateral-Flow-Immunoassay auf Basis von Quantenpunkt-Nanokügelchen

Zusammenfassung

Hier beschreiben wir ein Protokoll für die Herstellung von Quantenpunkt-Nanokügelchen (QDNB) und den Nachweis von Krankheitsbiomarkern mit QDNB-basierten Lateral-Flow-Immunoassay-Streifen. Die Testergebnisse können unter UV-Licht-Beleuchtung qualitativ beurteilt und mit einem fluoreszierenden Stripreader innerhalb von 15 min quantitativ gemessen werden.

Zusammenfassung

Quantenpunkte, auch Halbleiter-Nanokristalle genannt, sind neuartige Fluoreszenzmarkierungen für die biologische Bildgebung und Sensorik. Quantenpunkt-Antikörperkonjugate mit kleinen Abmessungen (~10 nm), die durch aufwendige Aufreinigungsverfahren hergestellt wurden, weisen jedoch eine begrenzte Sensitivität beim Nachweis bestimmter Marker für Spurenkrankheiten mit Lateral-Flow-Immunoassay-Streifen auf. Darin stellen wir ein Verfahren zur Herstellung von Quantenpunkt-Nanokügelchen (QDNB) unter Verwendung eines einstufigen Emulsionsverdampfungsverfahrens vor. Unter Verwendung des präparierten QDNB wurde ein fluoreszierender Lateral-Flow-Immunoassay zum Nachweis von Krankheitsbiomarkern am Beispiel des C-reaktiven Proteins (CRP) hergestellt. Im Gegensatz zu einzelnen Quantenpunkt-Nanopartikeln sind Quantenpunkt-Nanokügelchen-Antikörper-Konjugate aufgrund der Signalverstärkung als Immunoassay-Markierungen empfindlicher, indem sie Hunderte von Quantenpunkten in einer Polymerkomposit-Nanokügelchen verkapseln. Darüber hinaus erleichtert die größere Größe der QDNBs die Zentrifugationstrennung bei der Konjugation von QDNBs mit Antikörpern. Der fluoreszierende Lateral-Flow-Immunoassay auf Basis von QDNBs wurde hergestellt und die CRP-Konzentration in der Probe in 15 Minuten gemessen. Die Testergebnisse können unter UV-Licht-Beleuchtung qualitativ beurteilt und mit einem Fluoreszenz-Reader innerhalb von 15 min quantitativ gemessen werden.

Einleitung

Lateral-Flow-Immunoassay-Streifen (LFIA) dienen als wichtige Instrumente für den Schnellnachweis am Point-of-Care ^1,2, insbesondere beim Krankheitsscreening während Epidemien. Herkömmliche kolloidale LFIA-Teststreifen auf Goldbasis weisen jedoch eine geringe Nachweisempfindlichkeit auf und liefern nur qualitative Ergebnisse³. Um die Detektionsempfindlichkeit von LFIA zu erhöhen, sind verschiedene neue Nanopartikel entstanden, darunter farbiger Latex ^4,5, fluoreszierende Nanopartikel⁶ mit Aufkonversion, zeitaufgelöste fluoreszierende Mikrosphären ^7,8 und Quantenpunkte ^9,10,11. Quantenpunkte (QDs)^12,13, auch Halbleiter-Nanokristalle genannt, bieten abstimmbare Emissionswellenlängen, einen großen Anregungsbereich und eine hohe Lumineszenzeffizienz, was sie zu idealen Markierungen für die biologische Bildgebung macht.

Das Fluoreszenzsignal, das von einzelnen Quantenpunkten emittiert wird, bleibt jedoch schwach, was zu einer relativ geringen Nachweisempfindlichkeit in Immunoassays führt. Die Verkapselung zahlreicher Quantenpunkte in Mikrosphären kann Signale verstärken und die Empfindlichkeit von Quantenpunkt-basierten Immunoassays verbessern. Verschiedene Verfahren, wie die schichtweise Selbstorganisation 14,15,16,17,18, das Quellverfahren^19,20 und die Verkapselung mit Siliziumdioxid-Mikrosphären 21,22,23,24, wurden verwendet, um Quantenpunkte innerhalb von Mikrosphären einzukapseln. Zum Beispiel können quantenpunktfunktionalisierte Siliziumdioxid-Nanosphärenmarkierungen durch Erhöhung der QD-Beladung pro Sandwich-Immunreaktion²⁵ erreicht werden. Ein Sprühtrockner, der mit einem Ultraschallzerstäuber ausgestattet ist, wurde auch zur Herstellung von nanoskaligen QD-BSA-Nanosphären^{verwendet 26}. Die oben genannten Methoden leiden jedoch unter komplexen Mehrschritten, Fluoreszenzlöschung und geringer Produktivität.

In unserer vorherigen Arbeit²⁷ wurde über eine Emulsions-Lösungsmittel-Verdampfungsmethode zur Verkapselung von Quantenpunkten in Polymer-Nanokügelchen berichtet. Diese Präparationstechnik ist einfach, behält die Fluoreszenzeffizienz von QDs bei, gewährleistet eine hohe Verkapselungseffizienz und ermöglicht eine einfach skalierbare Produktion. Mehrere Forschungsgruppen haben erfolgreich LFIA-Streifen unter Verwendung von QDNBs entwickelt, die mit dieser Methode für Anwendungen hergestellt wurden, einschließlich des Nachweises von Lebensmitteltoxinen ^28,29,30, des Nachweises von Biomarkern für Infektionskrankheiten^31,32 und der Umweltüberwachung ³³.

Dieses Protokoll stellt spezifische Präparationsschritte für Quantenpunkt-Nanokügelchen (QDNB), QDNB- und Antikörperkonjugation, die Herstellung von QDNB-basierter LFIA und die Messung von C-reaktivem Protein (CRP) in humanen Plasmaproben vor.

Protokoll

Die Studie wurde vom Institutional Review Board des Shanghai Skin Disease Hospital (Nr. 2020-15) genehmigt. Alle experimentellen Verfahren mit menschlichen Blutproben wurden in einem Labor der Biosicherheitsstufe II durchgeführt. Die Einzelheiten zu den in dieser Studie verwendeten Reagenzien und Geräten sind in der Materialtabelle aufgeführt.

1. Vorbereitung von QDs-Nanokügelchen

HINWEIS: Für die QD-Nanobead-Synthese wurde eine Emulsions-Lösungsmittel-Verdampfungstechnik zur Synthese von QD-Nanobeads mit einem Verhältnis von Öl- zu Wasserphase von 1:5 verwendet. Die Mini-Emulsion wird durch Ultraschall erzeugt, und die Nanokügelchen werden durch Verdampfung mit Lösungsmittel (Chloroform) verfestigt. Natriumhydroxid wurde verwendet, um die Hydrolyse von Anhydridgruppen auf der Nanokügelchenoberfläche zu katalysieren und sie in Carboxylgruppen umzuwandeln.

1. Herstellung von Lösungen in der Ölphase und in der wässrigen Phase
   1. Bereiten Sie 1 ml Ölphase vor: 0,4 ml Poly(styrol-co-maleinsäureanhydrid) (PSMA)-Lösung (50 mg/ml), 0,1 mL QD-Lösung (100 mg/ml), füllen Sie ein beliebiges Volumen von weniger als 1 mL mit Chloroform.
   2. Bereiten Sie 5 mL wässrige Phase vor: wässrige SDS-Lösung (0,5 Gew.-%).
2. Herstellung der Emulsion und Erstarrung
   1. Geben Sie 1 mL Ölphase und 5 mL wässrige Phase in ein Fläschchen (15 mL) und stellen Sie das Fläschchen auf einen Magnetrührer. Schalten Sie den Magnetrührer ein.
   2. Nachdem die Öl- und die wässrige Phase vollständig vermischt sind, wird der Kolben sofort auf die programmierte Ultraschalluntersuchung (60 s, ein 3 s-Impuls, gefolgt von einer Pause von 3 s, 50 % Amplitude) umgestellt und die Stromversorgung eingeschaltet.
   3. Beobachten Sie die Lösung nach der Ultraschalluntersuchung. Die anfänglich purpurrote Lösung ging in eine opalisierende Phase über, die noch einen rötlichen Unterton behält.
   4. Stellen Sie das Fläschchen bei Raumtemperatur wieder auf den Magnetrührer und rühren Sie über Nacht kontinuierlich um. Das Chloroform wurde nach und nach verdampft und die Emulsion verfestigte sich zu zusammengesetzten Nanokügelchen.
3. Oberflächenmodifikation von Nanokügelchen
   1. Geben Sie 0,1 ml 0,1 mM Natriumhydroxid für 1 h in die Nanokügelchen-Suspension. Die Anhydridgruppen auf der Oberfläche von Nanokügelchen werden zu Carboxylgruppen hydrolysiert.
4. Aufreinigung von Nanokügelchen
   1. Schalten Sie den Magnetrührer aus und bewegen Sie die erstarrten Nanokügelchen in ein Zentrifugenröhrchen. Das Röhrchen wird bei 13523 x g 10 Minuten lang bei Raumtemperatur zentrifugiert und der Überstand verworfen.
   2. Geben Sie das anfängliche Volumen an deionisiertem Wasser in den Niederschlag, decken Sie das Rohr mit seinem Deckel ab, tauchen Sie es in das Ultraschall-Wasserbad und halten Sie das Eintauchen aufrecht, bis der Niederschlag vollständig dispergiert ist.
   3. Wiederholen Sie die Schritte 1.4.1-1.4.2 zweimal und übertragen Sie abschließend die Nanokügelchen auf die Glasflasche. Bis zur Verwendung bei 4 °C lagern.
5. Charakterisierung von Nanokügelchen
   1. Charakterisierung der Größe und Morphologie der QDs-Nanokügelchen mit Hilfe der Transmissionselektronenmikroskopie (TEM)^{Bildgebung 22}.
      HINWEIS: Durch Ändern des Verhältnisses von QDs-Lösung und PSMA-Lösung können unterschiedliche Größen von Nanokügelchen erhalten werden. Die Größe der QDs-Nanokügelchen kann auch durch dynamische Lichtstreuung (DLS) bestimmt ^werden27.

2. Herstellung von QDNB-Antikörper-Konjugaten

1. Aktivierung von Carboxylgruppen
   1. Geben Sie 100 μl vorbereitetes QDNB (10 mg/ml) in 200 μl Phosphatpuffer (PB, 20 mM, pH 6,0) und fügen Sie dann 6 μl EDC (20 mg/ml) hinzu.
   2. Die Mischung 30 min bei Raumtemperatur auf einem Rotationsmischer inkubieren.
   3. Nach der Inkubation wird das Gemisch bei 13523 x g 10 min bei Raumtemperatur zentrifugiert und der Überstand verworfen.
   4. Geben Sie 100 μl PB (20 mM, pH 6,0) zur Fällung, decken Sie das Röhrchen mit seinem Deckel ab und tauchen Sie das Röhrchen in das betriebsbereite Ultraschall-Wasserbad, bis der Niederschlag vollständig dispergiert ist.
2. Konjugation von Antikörpern und Nanokügelchen
   1. 100 μg Antikörper in 200 μl PB (20 mM, pH 6,0) dispergieren und die aktivierte QDNB-Suspension aus Schritt 2.1 in die Antikörperlösung geben.
   2. Inkubieren Sie die Mischung 30 Minuten lang bei Raumtemperatur mit kontinuierlicher Rotation. Überschüssige Antikörper durch Zentrifugation bei 6010 x g für 5 min (bei Raumtemperatur) entfernen und dann den Überstand vorsichtig entsorgen.
3. Blockierung von Nanokügelchen
   1. Dem Rückstand (erhalten in Schritt 2.2.2) werden 200 μl 1%ige Kaseinlösung (in 20 mM PB Puffer, pH 7,4) zugegeben, das Röhrchen mit seinem Deckel abgedeckt und in das betriebsbereite Ultraschallwasserbad getaucht, bis der Rückstand vollständig dispergiert ist.
   2. Die Mischung 2 h lang bei Raumtemperatur mit kontinuierlicher Rotation inkubieren.
      HINWEIS: Das Ziel dieses Schritts ist es, alle nicht umgesetzten Stellen auf der Oberfläche von QDNB zu blockieren.
4. Lagerung von Konjugaten
   1. 100 μl Konservierungslösung (20 mM PB Puffer, pH 7,4, 1 % BSA, 5 % Trehalose, 6 % Saccharose, 0,1 % S9, pH 7,4) zu der Mischung geben und zur späteren Verwendung bei 4 °C lagern.

3. Vorbereitung der Lateral-Flow-Immunoassay-Streifen

HINWEIS: Der immunchromatographische Streifen besteht aus einer Nitrocellulose (NC)-Membran, einem Probenpad, einem konjugierten Pad, einem absorbierenden Pad und einer Polyvinylchlorid (PVC)-Platte (Abbildung 1). Alle Lösungen sollten sofort vorbereitet und verwendet werden. Es wird empfohlen, Lateral-Flow-Immunoassay-Streifen in einem Reinraum mit kontrollierter Luftfeuchtigkeit vorzubereiten.

1. Vorbereitung der NC-Membran
   1. Bereiten Sie die Beschichtungslösung für die Testlinie (T-Linie) und die Kontrolllinie (C-Linie) vor: Verdünnen Sie den CRP-Capture-Antikörper und das Anti-Kaninchen-IgG für Ziegen mit PB auf eine Endkonzentration von 1 mg/ml.
   2. Legen Sie die PVC-Platte richtig an und entfernen Sie das Schutzpapier, das sich 25 mm von der Kante der PVC-Platte entfernt befindet. Richten Sie die NC-Bahn entlang der Unterkante des restlichen Schutzpapiers aus und kleben Sie sie auf die PVC-Platte.
   3. Dosieren Sie T-Linien- und C-Linien-Beschichtungslösungen mit einer Strahlrate von 1 μL/cm auf die NC-Membran, wobei Sie sicherstellen, dass sie 20 mm von der Oberkante entfernt platziert wird und eine Testlinie (1 mm breit) bildet.
   4. Stellen Sie die NC-Membran zum Trocknen unter Bedingungen mit einer Luftfeuchtigkeit von weniger als 30 % und einem Temperaturbereich von 18-26 °C auf. Die Trocknungszeit sollte mindestens 24 h betragen.
      HINWEIS: Stellen Sie sicher, dass die Ober- und Unterkanten der NC-Membran bündig mit den entsprechenden Kanten der angrenzenden Bereiche abschließen. NC-Membranen sollten nicht mit den Händen berührt werden. Die Luftfeuchtigkeit während dieses Schritts sollte im Bereich von 45 % bis 65 % kontrolliert werden. Bevor Sie fortfahren, sollten die T-Linien-Beschichtungslösung, die C-Linien-Beschichtungslösung und die NC-Membran auf die gleiche Temperatur ausgeglichen werden.
2. Vorbereitung des Konjugat-Pads
   1. Tauchen Sie das Konjugat-Pad in die Konjugat-Pad-Behandlungslösung (20 mM PB-Puffer, pH 7,4, 1 %BSA).
   2. Legen Sie das eingeweichte Konjugatpad zur Trocknungsbehandlung (Raumtemperatur) über Nacht in einen Trockenofen.
   3. Kleben Sie das modifizierte Konjugatpad vorsichtig auf die PVC-Platte.
   4. Die vorbereitete QDNB-Antikörper-Konjugatlösung wird mit der Konservierungslösung (20 mM PB Puffer, pH 7,4, 1 % BSA, 5 % Trehalose, 6 % Saccharose, 0,1 % S9, pH 7,4) verdünnt.
   5. Dosieren Sie die QDNB-Antikörper-Konjugatlösung mit einer Jetting-Rate von 1 μL/cm auf das Konjugatpad und trocknen Sie das Konjugatpad 24 h lang.
      HINWEIS: Das spezifische Verdünnungsverhältnis sollte entsprechend dem Nachweisziel angepasst werden.
3. Vorbereitung des Probenkissens
   1. Tauchen Sie das Probenpad in die Behandlungslösung für das Probenpad (20 mM PB Puffer, pH 7,4, 1 % BSA, 5 % Trehalose, 6 % Saccharose, 0,1 % S9, pH 7,4).
   2. Legen Sie das eingeweichte Probenpad in einen Trockenschrank (45 °C) und trocknen Sie es 24 h lang.
4. Zusammensetzen der Karte und Schneiden in Streifen
   1. Wie in Abbildung 1 gezeigt, legen Sie nacheinander das saugfähige Papier (saugfähiges Pad), das konjugierte Pad und das Probenpad auf die PVC-Platte mit NC-Membran.
   2. Schneide die Karte in 3,8 mm breite Streifen.
5. Verpacken der Streifen
   1. Umhüllen Sie die Teststreifen mit einer Plastikkassette und verschließen Sie einen Aluminiumfolienbeutel, der ein Trockenmittel enthält.

4. Durchführung des Assays und qualitative Bewertung

HINWEIS: Es wird empfohlen, Vorgänge mit menschlichen Blutproben in einem Labor der Biosicherheitsstufe II durchzuführen. Die menschlichen Plasmaproben wurden aus einem klinischen Labor entnommen (von nicht identifizierten menschlichen Probanden). In der Regel wurde menschliches Blut mit einer EDTA-Vakuumröhre entnommen und Plasma gemäß dem Standardprotokoll³⁴ isoliert. Zentrifugieren Sie bei 3.000 × g für 10 min bei Raumtemperatur für die Plasmatrennung. Entnehmen Sie die obere Schicht des gelben Plasmas mit einer Pipette und lagern Sie das Plasma bis zur Verwendung in einem 1,5-ml-Röhrchen bei -80 °C.

1. 10 μl Plasmaprobe oder Kalibratorlösung in 1 ml PBS-Puffer mit 0,1 % Tween 20 pipettieren. Übertragen Sie dann 100 μl der vorbereiteten verdünnten Probe auf das Probenpad des Teststreifens.
2. Beobachten Sie nach einem 15-minütigen Lauf die Fluoreszenzsignale der T-Linie und der C-Linie unter ultravioletter Lichteinstrahlung, um qualitative Ergebnisse zu erhalten.
3. Stecken Sie die Streifenkarte in ein fluoreszierendes Lateral-Flow-Assay-Lesegerät, um die Fluoreszenzintensitäten für die quantitative Analyse zu erhalten.
   HINWEIS: In diesem Beispiel wird das Sandwich-Immunoassay-Verfahren verwendet^35,36; Eine rote Linie (Kontrolllinie) zeigt ein negatives Ergebnis an, während die beiden roten Linien (Test- und Kontrolllinie) ein positives Ergebnis anzeigen. Das Fehlen der Kontrolllinie weist darauf hin, dass der durchgeführte Test ungültig ist.

Ergebnisse

Die QDNB-Vorbereitungsverfahren sind in Abbildung 1A schematisch dargestellt. Die Ölphase, die QDs und Polymer in Chloroform enthielt, wurde mit der Wasserphase gemischt, und eine Mini-Emulsion wurde durch Ultraschall erhalten. Die Emulsion wurde durch allmähliches Verdampfen von Chloroform verfestigt. Die transmissionselektronenmikroskopische Aufnahme (TEM) von QDNB ist in Abbildung 2A dargestellt. Die QDNBs haben eine sphärische Morphologie mit durchschnitt...

Diskussion

Hier beschreiben wir ein Protokoll zur Herstellung von Quantenpunkt-Nanokügelchen (QDNB)²⁷ und die Verwendung von QDNB zur Herstellung von fluoreszierenden Lateral-Flow-Immunoassays (LFIA). Die qualitative und quantitative Messung von CRP in Proben wird demonstriert. Diese QDNB-basierte LFIA kann auch auf andere Krankheitsbiomarker^25,32, Lebensmitteltoxine^29,30, Viren

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
(dimethylamino)propyl)-N’-ethylcarbodiimide hydrochloride	Sigma-Aldrich	03450
Absorbance paper	Kinbio Biotech	CH37K
Bovine serum albumin	Sigma-Aldrich	B2064
Casein	Sigma-Aldrich	C8654
CdSe/ZnS quantum dot	Suzhou Mesolight Inc.	CdSe/ZnS-625
Choloroform	Sino Pharm	10006818
CRP antibody	Hytest Biotech	4C28
Fluorescent lateral flow assay reader	Suzhou Helmence Precision Instrument	FIC-H1
Glass fiber pad	Kinbio Biotech	SB06
Goat anti-rabbit IgG	Sangon Biotech	D111018
Nitrocellulose membrane	Satorious	CN140
Poly(styrene-maleic anhydride) copolymer	Sigma-Aldrich	S458066
Rabbit IgG	Sangon Biotech	D110502
Sodium dodecyl sulfate	Sino Pharm	30166428
Sodium hydroxide	Sino Pharm	10019718