基于量子点纳米珠的荧光侧向层析免疫测定

摘要

在这里，我们描述了一种制备量子点纳米珠 （QDNB） 和使用基于 QDNB 的侧流免疫测定条检测疾病生物标志物的方案。可以在紫外光照射下对测试结果进行定性评估，并使用荧光条读数器在 15 分钟内进行定量测量。

摘要

量子点，也称为半导体纳米晶体，是用于生物成像和传感的新型荧光标记物。然而，通过费力的纯化程序制备的小尺寸 （~10 nm） 量子点抗体偶联物在使用侧向层析免疫测定试纸条检测某些痕量疾病标志物时表现出有限的灵敏度。在此，我们提出了一种使用一步乳液蒸发法制备量子点纳米珠 （QDNB） 的方法。使用制备的 QDNB，以 C 反应蛋白 （CRP） 为例，构建荧光侧流免疫测定法来检测疾病生物标志物。与单个量子点纳米颗粒不同，量子点纳米珠-抗体偶联物作为免疫测定标记物更敏感，因为通过将数百个量子点封装在一个聚合物复合纳米珠中来放大信号。此外，QDNB 的较大尺寸有助于在将 QDNB 与抗体偶联时更容易离心分离。制备基于 QDNBs 的荧光侧流免疫分析，并在 15 min 内测量样品中的 CRP 浓度。测试结果可以在紫外光照射下进行定性评估，并在 15 分钟内使用荧光读数仪进行定量测量。

引言

侧向层析免疫测定 （LFIA） 试纸条是床旁的重要快速检测工具 ^1,2，特别是在流行病期间的疾病筛查中。然而，传统的胶体金基 LFIA 试纸检测灵敏度低，仅提供定性结果³。为了提高 LFIA 的检测灵敏度，出现了各种新的纳米颗粒，包括彩色乳胶 ^4,5、上转换荧光纳米颗粒⁶、时间分辨荧光微球 ^7,8 和量子点 ^9,10,11。量子点 （QD）^12,13，也称为半导体纳米晶体，具有可调谐的发射波长、宽激发范围和高发光效率，使其成为生物成像的理想标记物。

然而，单个量子点发射的荧光信号仍然很弱，导致免疫测定中的检测灵敏度相对较低。在微球中封装大量量子点可以放大信号并提高基于量子点的免疫测定的灵敏度。已采用各种方法，例如逐层自组装 14,15,16,17,18、溶胀法 ^19,20 和二氧化硅微球 21,22,23,24 封装，将量子点封装在微球内。例如，可以通过增加每个夹心免疫反应的 QD 负载来实现量子点功能化二氧化硅纳米球标记²⁵。配备超声波雾化器的喷雾干燥器也用于制备纳米级 QD-BSA 纳米球²⁶。然而，上述方法存在复杂的多步骤、荧光猝灭和低生产率的问题。

在我们之前的工作²⁷ 中，报道了一种将量子点封装在聚合物纳米珠内的乳液溶剂蒸发方法。这种制备技术简单，可保持 QD 的荧光效率，确保高包埋效率，并允许轻松进行放大生产。几个研究小组已经使用通过这种方法制备的 QDNB 成功开发了 LFIA 试纸条，用于食品毒素检测 28,29,30、传染病生物标志物检测^31,32 和环境监测³³。

该方案介绍了量子点纳米珠 （QDNB）、QDNB 和抗体偶联、基于 QDNB 的 LFIA 的制备以及人血浆样品中 C 反应蛋白 （CRP） 测量的具体制备步骤。

研究方案

该研究获得上海市皮肤病医院机构审查委员会 （No. 2020-15） 批准。所有涉及人类血液样本的实验程序均在生物安全 II 级实验室中进行。本研究中使用的试剂和设备的详细信息列在 材料表中。

1. QDs 纳米珠的制备

注：对于 QD 纳米珠合成，使用乳液溶剂蒸发技术合成 QD 纳米珠，油相与水相的比例为 1：5。 通过 超声处理生成微型乳液，纳米珠通过溶剂（氯仿）蒸发固化。氢氧化钠用于催化纳米珠表面的酸酐基团水解，将它们转化为羧基。

1. 油相和水相溶液的制备
   1. 准备 1 mL 油相：0.4 mL 聚（苯乙烯-共马来酸酐）（PSMA） 溶液 （50 mg/mL），0.1 mL QDs 溶液 （100 mg/mL），用氯仿填充任何体积小于 1 mL。
   2. 准备 5 mL 水相：SDS 水溶液 （0.5 wt %）。
2. 乳化和固化的制备
   1. 向样品瓶 （15 mL） 中加入 1 mL 油相和 5 mL 水相，然后将样品瓶放在磁力搅拌器上。打开磁力搅拌器的电源。
   2. 油相和水相完全混合后，立即将烧瓶转移到编程的（60 s，3 s 脉冲，然后是 3 s 暂停，50% 振幅）超声并打开电源。
   3. 观察超声处理后的溶液。最初的深红色溶液过渡到乳白色，但仍保留着淡红色的底色。
   4. 将样品瓶放回室温下的磁力搅拌器上，持续搅拌过夜。氯仿逐渐蒸发，乳剂凝固成复合纳米珠。
3. 纳米珠的表面改性
   1. 向纳米珠悬浮液中加入 0.1 mL 0.1 mM 氢氧化钠 1 小时。纳米珠表面的酸酐基团水解成羧基。
4. 纳米珠的纯化
   1. 关闭磁力搅拌器，将固化的纳米珠移至离心管中。在室温下以 13523 x g 离心管 10 分钟，弃去上清液。
   2. 将初始体积的去离子水加入沉淀物中，用盖子盖住管子，将其浸入超声波水浴中，并保持浸泡直至沉淀物完全分散。
   3. 重复步骤 1.4.1-1.4.2 两次，最后，将纳米珠转移到玻璃瓶中。将其储存在 4 °C 直至使用。
5. 纳米珠的表征
   1. 使用透射电子显微镜 （TEM） 成像表征 QD 纳米珠的大小和形态²²。
      注：通过改变 QDs 溶液和 PSMA 溶液的比例，可以获得不同大小的纳米珠。QD 纳米珠的大小也可以通过动态光散射 （DLS） 来确定²⁷。

2. QDNB 抗体偶联物的制备

1. 羧基的活化
   1. 在 200 μL 磷酸盐缓冲液 （PB， 20 mM， pH 6.0） 中加入 100 μL 制备的 QDNB （10 mg/mL），然后加入 6 μL EDC （20 mg/mL）。
   2. 在室温下在旋转混合器上孵育混合物 30 分钟。
   3. 孵育后，在室温下以 13523 x g 离心混合物 10 分钟，并弃去上清液。
   4. 向沉淀中加入 100 μL PB（20 mM，pH 6.0），用盖子盖住试管，然后将试管浸入操作中的超声波水浴中，直到沉淀物完全分散。
2. 抗体和纳米珠的偶联
   1. 将 100 μg 抗体分散在 200 μL PB （20 mM，pH 6.0） 中，并将步骤 2.1 中获得的活化 QDNB 悬浮液添加到抗体溶液中。
   2. 将混合物在室温下连续旋转孵育 30 分钟。通过在 6010 x g 下离心 5 分钟（在室温下）去除多余的抗体，然后小心丢弃上清液。
3. 纳米珠的封闭
   1. 向残留物中加入 200 μL 1% 酪蛋白溶液（在 20 mM PB 缓冲液中，pH 7.4）（在步骤 2.2.2 中获得），用盖子盖住试管，然后将其浸入操作中的超声波水浴中，直到残留物完全分散。
   2. 将混合物在室温下连续旋转孵育 2 小时。
      注意：此步骤的目的是阻断 QDNB 表面的任何未反应位点。
4. 偶联物的储存
   1. 向混合物中加入 100 μL 保存溶液（20 mM PB 缓冲液，pH 7.4,1% BSA，5% 海藻糖，6% 蔗糖，0.1% S9，pH 7.4），并在 4 °C 下储存以备后续使用。

3. 侧流免疫测定试纸的制备

注：免疫层析试纸条由硝酸纤维素 （NC） 膜、样品垫、偶联物垫、吸收垫和聚氯乙烯 （PVC） 板组成（图 1）。所有溶液都应准备好并立即使用。建议在湿度受控的洁净室中制备侧向层析免疫测定试纸。

1. NC膜的制备
   1. 制备测试线（T 线）和对照线（C 线）包被溶液：用 PB 稀释 CRP 捕获抗体和山羊抗兔 IgG 至终浓度为 1 mg/mL。
   2. 正确放置 PVC 板，并去除距离 PVC 板边缘 25 毫米处的保护纸。将 NC 膜沿剩余保护纸的下边缘对齐并粘附到 PVC 板上。
   3. 以 1 μL/cm 的喷射速率将 T 线和 C 线涂层溶液分配到 NC 膜上，确保其与上边缘相距 20 mm，形成测试线（1 mm 宽）。
   4. 将 NC 膜置于湿度小于 30% 且温度范围为 18-26 °C 的条件下进行干燥。干燥时间应至少为 24 小时。
      注意：确保 NC 膜的顶部和底部边缘与相邻区域的相应边缘齐平。NC 膜不应用手触摸。此步骤中的湿度应控制在 45% 至 65% 的范围内。在进行之前，T-line 涂层溶液、C-line 涂层溶液和 NC 膜应平衡至相同温度。
2. 共轭垫的制备
   1. 将偶联垫浸入偶联垫处理溶液（20 mM PB 缓冲液，pH 7.4,1%BSA）中。
   2. 将浸泡过的偶联垫放入干燥箱中进行干燥处理（室温）过夜。
   3. 轻轻地将改性的共轭垫粘附到 PVC 板上。
   4. 用保存溶液（20 mM PB 缓冲液，pH 7.4,1% BSA，5% 海藻糖，6% 蔗糖，0.1% S9，pH 7.4）稀释制备的 QDNB-抗体偶联物溶液。
   5. 以 1 μL/cm 的喷射速率将 QDNB-抗体偶联物溶液分配到偶联垫上，并干燥偶联垫 24 小时。
      注意：应根据检测目标调整特定稀释比例。
3. 样品垫的制备
   1. 将样品垫浸入样品垫处理溶液（20 mM PB 缓冲液，pH 7.4,1% BSA，5% 海藻糖，6% 蔗糖，0.1% S9，pH 7.4）中。
   2. 将浸泡的样品垫放入干燥箱 （45 °C） 中并干燥 24 小时。
4. 组装卡片并将其切割成条
   1. 如图 1 所示，将吸水纸（吸水垫）、共轭垫和样品垫依次放置在带有 NC 膜的 PVC 板上。
   2. 将卡片剪成 3.8 毫米宽的条带。
5. 条带包装
   1. 将试纸装在塑料盒中，并密封装有干燥剂的铝箔袋。

4. 检测操作和定性评价

注：涉及人类血液样本的操作建议在生物安全 II 级实验室进行。人血浆样本来自临床实验室（来自去识别化的人类受试者）。通常，使用 EDTA 真空管采集人血，并根据标准方案³⁴ 分离血浆。在室温下以 3,000 × g 离心 10 分钟以进行血浆分离。使用移液管收集黄色血浆上层，并将血浆储存在-80°C的1.5 ml管中直至使用。

1. 将 10 μL 血浆样品或校准液移液到 1 mL 含有 0.1% Tween 20 的 PBS 缓冲液中。然后，将 100 μL 制备的稀释样品转移到试纸的样品垫上。
2. 运行 15 分钟后，在紫外光照射下观察 T 线和 C 线的荧光信号，以获得定性结果。
3. 将条带卡插入荧光侧向层析检测仪中，以获得用于定量分析的荧光强度。
   注意：在这个例子中，采用夹心免疫测定法^35,36;一条红线（控制线）表示阴性结果，而两条红线（测试线和控制线）表示阳性结果。没有控制线表示进行的测试无效。

结果

QDNB 制备过程如图 1A 所示。将含有 QD 和氯仿中聚合物的油相与水相混合，通过超声处理获得微型乳液。乳剂通过氯仿的逐渐蒸发而凝固。QDNB 的透射电子显微镜照片 （TEM） 如图 2A 所示。QDNB 具有球形形态，平均直径为 96 nm，在 TEM 图像中测量超过 50 个 QDNB。在纳米珠内清楚地观察到 QD 纳米颗粒，表明封装成功。 图 2B 和

讨论

在这里，我们描述了制备量子点纳米珠 （QDNB）²⁷ 的方案以及使用 QDNB 制备荧光侧流免疫测定 （LFIA）。证明了样品中 CRP 的定性和定量测量。这种基于 QDNB 的 LFIA 还可以应用于其他疾病生物标志物^25,32、食物毒素^29,30、病毒^16,27 等。

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
(dimethylamino)propyl)-N’-ethylcarbodiimide hydrochloride	Sigma-Aldrich	03450
Absorbance paper	Kinbio Biotech	CH37K
Bovine serum albumin	Sigma-Aldrich	B2064
Casein	Sigma-Aldrich	C8654
CdSe/ZnS quantum dot	Suzhou Mesolight Inc.	CdSe/ZnS-625
Choloroform	Sino Pharm	10006818
CRP antibody	Hytest Biotech	4C28
Fluorescent lateral flow assay reader	Suzhou Helmence Precision Instrument	FIC-H1
Glass fiber pad	Kinbio Biotech	SB06
Goat anti-rabbit IgG	Sangon Biotech	D111018
Nitrocellulose membrane	Satorious	CN140
Poly(styrene-maleic anhydride) copolymer	Sigma-Aldrich	S458066
Rabbit IgG	Sangon Biotech	D110502
Sodium dodecyl sulfate	Sino Pharm	30166428
Sodium hydroxide	Sino Pharm	10019718