Imunoensaio de fluxo lateral fluorescente baseado em nanoesferas de pontos quânticos

Resumo

Aqui, descrevemos um protocolo para a preparação de nanoesferas de pontos quânticos (QDNB) e a detecção de biomarcadores de doenças usando tiras de imunoensaio de fluxo lateral baseadas em QDNB. Os resultados do teste podem ser avaliados qualitativamente sob iluminação de luz UV e medidos quantitativamente usando um leitor de tiras fluorescentes em 15 minutos.

Resumo

Os pontos quânticos, também conhecidos como nanocristais semicondutores, são novos rótulos fluorescentes para imagens e sensores biológicos. No entanto, conjugados de anticorpo de ponto quântico com pequenas dimensões (~ 10 nm), preparados por meio de procedimentos de purificação trabalhosos, exibem sensibilidade limitada na detecção de certos marcadores de doenças vestigiais usando tiras de imunoensaio de fluxo lateral. Aqui, apresentamos um método para a preparação de nanoesferas de pontos quânticos (QDNB) usando um método de evaporação de emulsão de uma etapa. Usando o QDNB preparado, um imunoensaio fluorescente de fluxo lateral foi fabricado para detectar biomarcadores de doenças usando proteína C-reativa (PCR) como exemplo. Ao contrário das nanopartículas de ponto quântico único, os conjugados de nanoesferas de pontos quânticos e anticorpos são mais sensíveis como marcadores de imunoensaio devido à amplificação do sinal, encapsulando centenas de pontos quânticos em uma nanoesfera composta de polímero. Além disso, o tamanho maior dos QDNBs facilita a separação por centrifugação ao conjugar QDNBs com anticorpos. O imunoensaio fluorescente de fluxo lateral baseado em QDNBs foi confeccionado, e a concentração de PCR na amostra foi medida em 15 min. Os resultados do teste podem ser avaliados qualitativamente sob iluminação de luz UV e medidos quantitativamente usando um leitor fluorescente em 15 minutos.

Introdução

As tiras de imunoensaio de fluxo lateral (LFIA) servem como ferramentas cruciais de detecção rápida no local de atendimento ^1,2, particularmente na triagem de doenças durante epidemias. No entanto, as tiras de teste LFIA tradicionais à base de ouro coloidal exibem baixa sensibilidade de detecção e fornecem apenas resultados qualitativos³. Para aumentar a sensibilidade de detecção do LFIA, surgiram várias novas nanopartículas, incluindo látex colorido ^4,5, nanopartículas fluorescentes de conversão ascendente⁶, microesferas fluorescentes resolvidas no tempo ^7,8 e pontos quânticos ^9,10,11. Os pontos quânticos (QDs)^12,13, também conhecidos como nanocristais semicondutores, oferecem comprimentos de onda de emissão ajustáveis, uma ampla faixa de excitação e alta eficiência de luminescência, tornando-os rótulos ideais para imagens biológicas.

No entanto, o sinal de fluorescência emitido por pontos quânticos individuais permanece fraco, resultando em sensibilidade de detecção relativamente baixa em imunoensaios. O encapsulamento de vários pontos quânticos dentro de microesferas pode amplificar sinais e melhorar a sensibilidade dos imunoensaios baseados em pontos quânticos. Vários métodos, como automontagem camada por camada 14,15,16,17,18, o método de inchaço^19,20 e o encapsulamento da microesfera de sílica 21,22,23,24, foram empregados para encapsular pontos quânticos dentro de microesferas. Por exemplo, marcadores de nanoesferas de sílica funcionalizados por pontos quânticos podem ser alcançados aumentando a carga de QD por imunorreação²⁵ imprensada. Um secador por pulverização equipado com um atomizador ultrassônico também foi usado para preparar nanoesferas QD-BSA em nanoescala²⁶. No entanto, os métodos mencionados acima sofrem de multietapas complexas, têmpera de fluorescência e baixa produtividade.

Em nosso trabalho anterior²⁷, foi relatado um método de evaporação de emulsão-solvente para encapsular pontos quânticos dentro de nanoesferas de polímero. Essa técnica de preparação é simples, mantém a eficiência fluorescente dos QDs, garante alta eficiência de encapsulamento e permite uma produção fácil e escalável. Vários grupos de pesquisa desenvolveram com sucesso tiras LFIA usando QDNBs preparados por meio desse método para aplicações, incluindo detecção de toxinas alimentares 28,29,30, detecção de biomarcadores de doenças infecciosas ^31,32 e monitoramento ambiental³³.

Este protocolo apresenta etapas específicas de preparação para nanoesferas de pontos quânticos (QDNB), conjugação de QDNB e anticorpos, preparação de LFIA baseada em QDNB e medição de proteína C reativa (PCR) em amostras de plasma humano.

Protocolo

O estudo foi aprovado pelo Conselho de Revisão Institucional do Hospital de Doenças de Pele de Xangai (nº 2020-15). Todos os procedimentos experimentais envolvendo amostras de sangue humano foram realizados em laboratório de Biossegurança Nível II. Os detalhes dos reagentes e equipamentos usados neste estudo estão listados na Tabela de Materiais.

1. Preparação de nanoesferas de QDs

NOTA: Para a síntese de nanoesferas QD, uma técnica de evaporação de emulsão-solvente foi usada para sintetizar nanoesferas QD, com uma proporção de fase oleosa para fase aquosa de 1:5. A mini emulsão é gerada por ultrassom e as nanoesferas são solidificadas por evaporação de solvente (clorofórmio). O hidróxido de sódio foi utilizado para catalisar a hidrólise de grupos anidridos na superfície do nanobead, convertendo-os em grupos carboxila.

1. Preparação de soluções em fase oleosa e em fase aquosa
   1. Prepare 1 mL de fase oleosa: 0,4 mL de solução de poli (estireno-anidrido co-maleico) (PSMA) (50 mg / mL), 0,1 mL de solução de QDs (100 mg / mL), preencha qualquer volume menor que 1 mL com clorofórmio.
   2. Prepare 5 mL de fase aquosa: solução aquosa SDS (0,5% em peso).
2. Preparação de emulsão e solidificação
   1. Adicione 1 mL de fase oleosa e 5 mL de fase aquosa a um frasco para injetáveis (15 mL) e coloque o frasco em um agitador magnético. Ligue a energia do agitador magnético.
   2. Depois que as fases oleosa e aquosa estiverem completamente misturadas, transfira imediatamente o frasco para a ultrassonografia programada (60 s, um pulso de 3 s seguido por uma pausa de 3 s, amplitude de 50%) e ligue a energia.
   3. Observar a solução após a ultrassonização. A solução inicialmente de cor carmesim fez a transição para uma fase opalescente que ainda mantém um tom avermelhado.
   4. Coloque o frasco de volta no agitador magnético à temperatura ambiente, mexendo continuamente durante a noite. O clorofórmio foi gradualmente evaporado e a emulsão solidificada em nanoesferas compostas.
3. Modificação de superfície de nanoesferas
   1. Adicione 0,1 mL de hidróxido de sódio 0,1 mM à suspensão de nanoesferas por 1 h. Os grupos anidridos na superfície das nanoesferas são hidrolisados em grupos carboxila.
4. Purificação de nanoesferas
   1. Desligue o agitador magnético e mova as nanoesferas solidificadas para um tubo de centrífuga. Centrifugue o tubo a 13523 x g por 10 min à temperatura ambiente e descarte o sobrenadante.
   2. Adicione o volume inicial de água deionizada à precipitação, cubra o tubo com sua tampa, mergulhe-o no banho-maria ultrassônico e mantenha a imersão até que o precipitado esteja totalmente disperso.
   3. Repita as etapas 1.4.1-1.4.2 duas vezes e, finalmente, transfira as nanoesferas para a garrafa de vidro. Armazene-o a 4 °C até o uso.
5. Caracterização de nanoesferas
   1. Caracterize o tamanho e a morfologia das nanoesferas de QDs usando imagens de microscopia eletrônica de transmissão (TEM)²².
      NOTA: Diferentes tamanhos de nanoesferas podem ser obtidos alterando a proporção de solução de QDs e solução de PSMA. O tamanho das nanoesferas de QDs também pode ser determinado por meio de espalhamento dinâmico de luz (DLS) ²⁷ .

2. Preparação de conjugados de anticorpos QDNB

1. Ativação de grupos carboxila
   1. Adicione 100 μL de QDNB preparado (10 mg / mL) em 200 μL de tampão fosfato (PB, 20 mM, pH 6,0) e, em seguida, adicione 6 μL de EDC (20 mg / mL).
   2. Incube a mistura por 30 min em temperatura ambiente em um misturador rotativo.
   3. Após a incubação, centrifugue a mistura a 13523 x g durante 10 min à temperatura ambiente e elimine o sobrenadante.
   4. Adicione 100 μL de PB (20 mM, pH 6,0) à precipitação, cubra o tubo com sua tampa e mergulhe o tubo no banho-maria ultrassônico operacional até que o precipitado esteja totalmente disperso.
2. Conjugação de anticorpos e nanoesferas
   1. Dispersar 100 μg de anticorpo em 200 μL de PB (20 mM, pH 6,0) e adicionar a suspensão de QDNB ativada obtida na etapa 2.1 à solução de anticorpos.
   2. Incubar a mistura à temperatura ambiente durante 30 min com rotação contínua. Remova o excesso de anticorpos por centrifugação a 6010 x g por 5 min (à temperatura ambiente) e, em seguida, descarte cuidadosamente o sobrenadante.
3. Bloqueio de nanoesferas
   1. Adicionar 200 μL de solução de caseína a 1% (em tampão PB 20 mM, pH 7,4) ao resíduo (obtido na etapa 2.2.2), cobrir o tubo com sua tampa e mergulhá-lo no banho-maria ultrassônico operacional até que o resíduo esteja totalmente disperso.
   2. Incubar a mistura à temperatura ambiente durante 2 h com rotação contínua.
      NOTA: O objetivo desta etapa é bloquear quaisquer locais que não tenham reagido na superfície do QDNB.
4. Armazenamento de conjugados
   1. Adicione 100 μL de solução conservante (tampão PB 20 mM, pH 7,4, 1% BSA, 5% de trealose, 6% de sacarose, 0,1% S9, pH 7,4) à mistura e armazene a 4 ° C para uso subsequente.

3. Preparação de tiras de imunoensaio de fluxo lateral

NOTA: A fita imunocromatográfica é composta por uma membrana de nitrocelulose (NC), uma almofada de amostra, uma almofada conjugada, uma almofada absorvente e uma placa de cloreto de polivinila (PVC) (Figura 1). Todas as soluções devem ser preparadas e usadas imediatamente. Recomenda-se que as tiras de imunoensaio de fluxo lateral sejam preparadas em uma sala limpa com umidade controlada.

1. Preparação da membrana NC
   1. Preparar a solução de revestimento da linha de ensaio (linha T) e da linha de controlo (linha C): diluir o anticorpo de captura PCR e a imunoglobulina G anti-coelho caprino com PB até uma concentração final de 1 mg/ml.
   2. Coloque a placa de PVC corretamente e remova o papel protetor localizado a 25 mm da borda da placa de PVC. Alinhe e cole a membrana NC ao longo da borda inferior do papel protetor restante à placa de PVC.
   3. Dispense as soluções de revestimento T-line e C-line na membrana NC a uma taxa de jateamento de 1 μL/cm, garantindo que ela seja colocada a 20 mm de distância da borda superior, formando uma linha de teste (1 mm de largura).
   4. Coloque a membrana NC em condições com umidade inferior a 30% e faixa de temperatura de 18-26 °C para secagem. O tempo de secagem deve ser de pelo menos 24 h.
      NOTA: Certifique-se de que as bordas superior e inferior da membrana NC estejam niveladas com as bordas correspondentes das áreas adjacentes. As membranas NC não devem ser tocadas com as mãos. A umidade durante esta etapa deve ser controlada dentro da faixa de 45% a 65%. Antes de prosseguir, a solução de revestimento T-line, a solução de revestimento C-line e a membrana NC devem ser equilibradas na mesma temperatura.
2. Preparação da almofada conjugada
   1. Mergulhe a almofada conjugada na solução de tratamento da almofada conjugada (tampão PB 20 mM, pH 7,4, 1% BSA).
   2. Coloque a almofada conjugada embebida em um forno de secagem para tratamento de secagem (temperatura ambiente) durante a noite.
   3. Cole suavemente a almofada conjugada modificada na placa de PVC.
   4. Diluir a solução conjugada de anticorpos QDNB preparada com a solução conservante (tampão PB 20 mM, pH 7,4, BSA a 1%, trealose a 5%, sacarose a 6%, S9 a 0,1%, pH 7,4).
   5. Dispense a solução conjugada de anticorpos QDNB na almofada conjugada a uma taxa de jateamento de 1 μL / cm e seque a almofada conjugada por 24 h.
      NOTA: A razão de diluição específica deve ser ajustada de acordo com o alvo de detecção.
3. Preparação da almofada de amostra
   1. Mergulhe a almofada de amostra na solução de tratamento da almofada de amostra (tampão PB 20 mM, pH 7,4, 1% BSA, 5% de trealose, 6% de sacarose, 0,1% S9, pH 7,4).
   2. Coloque a almofada de amostra embebida em um forno de secagem (45 °C) e seque por 24 h.
4. Montando o cartão e cortando-o em tiras
   1. Conforme mostrado na Figura 1, coloque sucessivamente o papel absorvente (almofada absorvente), almofada conjugada e almofada de amostra na placa de PVC com membrana NC.
   2. Corte o cartão em tiras de 3,8 mm de largura.
5. Embalagem das tiras
   1. Envolva as tiras de teste em um de plástico e sele uma bolsa de folha de alumínio que contenha um dessecante.

4. Operação do ensaio e avaliação qualitativa

NOTA: Recomenda-se que as operações envolvendo amostras de sangue humano sejam realizadas em um laboratório de Nível de Biossegurança II. As amostras de plasma humano foram obtidas de um laboratório clínico (de seres humanos não identificados). Normalmente, o sangue humano foi coletado usando um tubo de vácuo EDTA e o plasma foi isolado de acordo com o protocolo padrão³⁴. Centrifugue a 3.000 × g por 10 min em temperatura ambiente para separação de plasma. Recolher a camada superior de plasma amarelo com uma pipeta e conservar o plasma num tubo de 1,5 ml a -80 °C até à utilização.

1. Pipete 10 μL de amostra de plasma ou solução calibradora em 1 mL de um tampão PBS contendo 0,1% de Tween 20. Em seguida, transfira 100 μL da amostra diluída preparada para a almofada de amostra da tira de teste.
2. Após uma corrida de 15 minutos, observe os sinais de fluorescência da linha T e da linha C sob exposição à luz ultravioleta para obter resultados qualitativos.
3. Insira o cartão de tira em um leitor de ensaio de fluxo lateral fluorescente para obter as intensidades de fluorescência para análise quantitativa.
   NOTA: Neste exemplo, o método de imunoensaio sanduíche é empregado^35,36; Uma linha vermelha (linha de controle) indica um resultado negativo, enquanto as duas linhas vermelhas (linhas de teste e controle) indicam um resultado positivo. A ausência da linha de controle indica que o teste realizado é inválido.

Resultados

Os procedimentos de preparação do QDNB são ilustrados esquematicamente na Figura 1A. A fase oleosa contendo QDs e polímero em clorofórmio foi misturada com a fase aquosa, e uma mini-emulsão foi obtida por sonicação. A emulsão foi solidificada por evaporação gradual do clorofórmio. A micrografia eletrônica de transmissão (MET) do QDNB é apresentada na Figura 2A. Os QDNBs têm uma morfologia esférica, com diâmetros médios de 96 nm, medidos em 50 ...

Discussão

Aqui, descrevemos um protocolo para a preparação de nanoesferas de pontos quânticos (QDNB)²⁷ e o uso de QDNB para a preparação de imunoensaios fluorescentes de fluxo lateral (LFIA). A medição qualitativa e quantitativa da PCR em amostras é demonstrada. Este LFIA baseado em QDNB também pode ser aplicado a outros biomarcadores de doenças^25,32, toxinas alimentares^29,30, vír...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
(dimethylamino)propyl)-N’-ethylcarbodiimide hydrochloride	Sigma-Aldrich	03450
Absorbance paper	Kinbio Biotech	CH37K
Bovine serum albumin	Sigma-Aldrich	B2064
Casein	Sigma-Aldrich	C8654
CdSe/ZnS quantum dot	Suzhou Mesolight Inc.	CdSe/ZnS-625
Choloroform	Sino Pharm	10006818
CRP antibody	Hytest Biotech	4C28
Fluorescent lateral flow assay reader	Suzhou Helmence Precision Instrument	FIC-H1
Glass fiber pad	Kinbio Biotech	SB06
Goat anti-rabbit IgG	Sangon Biotech	D111018
Nitrocellulose membrane	Satorious	CN140
Poly(styrene-maleic anhydride) copolymer	Sigma-Aldrich	S458066
Rabbit IgG	Sangon Biotech	D110502
Sodium dodecyl sulfate	Sino Pharm	30166428
Sodium hydroxide	Sino Pharm	10019718