Флуоресцентный иммунологический анализ на основе наногранул квантовых точек

Резюме

В данной статье мы описываем протокол получения наношариков на квантовых точках (QDNB) и обнаружения биомаркеров заболевания с помощью полосок для иммуноферментного анализа на основе квантовых точек на основе QDNB. Результаты испытаний могут быть качественно оценены при ультрафиолетовом освещении и количественно измерены с помощью считывателя флуоресцентных лент в течение 15 минут.

Аннотация

Квантовые точки, также известные как полупроводниковые нанокристаллы, являются новыми флуоресцентными метками для биологической визуализации и зондирования. Тем не менее, конъюгаты антител на квантовых точках с малыми размерами (~10 нм), полученные с помощью трудоемких процедур очистки, демонстрируют ограниченную чувствительность при обнаружении определенных следовых маркеров заболевания с помощью иммуноферментных полосок с боковым потоком. В данной работе мы представляем способ получения наношариков на квантовых точках (QDNB) с использованием метода одноэтапного эмульсионного выпаривания. С использованием полученного QDNB был изготовлен флуоресцентный иммунологический анализ для выявления биомаркеров заболевания на примере С-реактивного белка (СРБ). В отличие от наночастиц на основе одиночных квантовых точек, конъюгаты наношариков и антител на основе квантовых точек более чувствительны в качестве меток иммуноферментного анализа благодаря усилению сигнала путем инкапсуляции сотен квантовых точек в одну полимерную композитную нанобусину. Кроме того, больший размер QDNB облегчает разделение центрифугированием при конъюгации QDNB с антителами. Был изготовлен флуоресцентный иммунологический анализ на основе QDNBs, а концентрация СРБ в образце была измерена за 15 минут. Результаты испытаний могут быть качественно оценены при ультрафиолетовом освещении и количественно измерены с помощью флуоресцентного считывателя в течение 15 минут.

Введение

Полоски для иммуноферментного анализа бокового потока (LFIA) служат важнейшими инструментами быстрого выявления в местах оказания медицинской помощи ^1,2, особенно при скрининге заболеваний во время эпидемий. Однако традиционные тест-полоски LFIA на основе коллоидного золота демонстрируют низкую чувствительность обнаружения и дают только качественные результаты³. Для повышения чувствительности детектирования LFIA были разработаны различные новые наночастицы, в том числе цветной латекс ^4,5, флуоресцентные наночастицы с повышающей конверсией⁶, флуоресцентные микросферы ^7,8 с временным разрешением и квантовые точки ^9,10,11. Квантовые точки (КТ)^12,13, также известные как полупроводниковые нанокристаллы, обладают настраиваемой длиной волны излучения, широким диапазоном возбуждения и высокой эффективностью люминесценции, что делает их идеальными метками для биологической визуализации.

Тем не менее, флуоресцентный сигнал, излучаемый отдельными квантовыми точками, остается слабым, что приводит к относительно низкой чувствительности обнаружения в иммунологических анализах. Инкапсуляция многочисленных квантовых точек в микросферах может усилить сигналы и повысить чувствительность иммунологических анализов на основе квантовых точек. Для инкапсуляции квантовых точек внутри микросфер были использованы различные методы, такие как послойная самосборка 14,15,16,17,18, метод набухания ^19,20 и инкапсуляция микросфер кремнезема 21,22,23,24. Например, функционализированные квантовыми точками наносферы кремнезема могут быть достигнуты путем увеличения нагрузки квантовой точки на сэндвич-иммунореакцию²⁵. Распылительная сушилка, оснащенная ультразвуковым распылителем, также использовалась для получения наноразмерных наносфер QD-BSA²⁶. Однако вышеупомянутые методы страдают от сложной многоступенчатости, гашения флуоресценции и низкой производительности.

В нашей предыдущей работе²⁷ сообщалось о методе испарения эмульсии-растворителем для инкапсуляции квантовых точек внутри полимерных наношариков. Этот метод приготовления прост, поддерживает флуоресцентную эффективность квантовых точек, обеспечивает высокую эффективность инкапсуляции и позволяет легко масштабировать производство. Несколько исследовательских групп успешно разработали полоски LFIA с использованием QDNB, полученных с помощью этого метода, для приложений, включая обнаружение пищевых токсинов ^28,29,30, обнаружение биомаркеров инфекционных заболеваний^31,32 и мониторинг окружающей среды³³.

В этом протоколе представлены конкретные этапы подготовки наногранул квантовых точек (QDNB), конъюгации QDNB и антител, получения LFIA на основе QDNB и измерения C-реактивного белка (CRP) в образцах плазмы крови человека.

протокол

Исследование было одобрено Институциональным наблюдательным советом Шанхайской больницы кожных заболеваний (No 2020-15). Все экспериментальные процедуры с использованием образцов крови человека проводились в лаборатории уровня биобезопасности II. Подробная информация о реагентах и оборудовании, использованных в этом исследовании, приведена в Таблице материалов.

1. Приготовление наношариков QD

Примечание: Для синтеза наногранул квантовой тона был использован метод испарения эмульсии-растворителя для синтеза наногранул квантовой тона с соотношением масляной фазы к водной фазе 1:5. Мини-эмульсия создается с помощью ультразвука, а наногранулы затвердевают путем испарения растворителя (хлороформа). Гидроксид натрия был использован для катализа ангидридных групп на поверхности наногранул, превращая их в карбоксильные группы.

1. Приготовление растворов масляной фазы и водной фазы
   1. Приготовьте 1 мл масляной фазы: 0,4 мл раствора поли (стирол-ко-малеинового ангидрида) (ПСМА) (50 мг/мл), 0,1 мл раствора КТ (100 мг/мл), залейте хлороформом любой объем менее 1 мл.
   2. Приготовьте 5 мл водной фазы: водный раствор SDS (0,5 мас.%).
2. Приготовление эмульсии и затвердевание
   1. Добавьте 1 мл масляной фазы и 5 мл водной фазы во флакон (15 мл) и поместите флакон на магнитную мешалку. Включите мощность магнитной мешалки.
   2. После того как масляная и водная фазы полностью перемешаются, немедленно переведите колбу на запрограммированное (60 с, импульс 3 с с последующей паузой 3 с, амплитуда 50%) ультразвук и включите питание.
   3. Наблюдайте за раствором после ультразвукового исследования. Первоначально малиновый цвет раствора перешел в опалесцирующую фазу, которая все еще сохраняет красноватый оттенок.
   4. Поместите флакон обратно на магнитную мешалку при комнатной температуре, непрерывно помешивая в течение ночи. Хлороформ постепенно испарялся, а эмульсия затвердевала в композитные наногранулы.
3. Модификация поверхности наношариков
   1. Добавьте 0,1 мл 0,1 мМ гидроксида натрия в суспензию наногранул на 1 ч. Ангидридные группы на поверхности наногранул гидролизуются в карбоксильные группы.
4. Очистка наногранул
   1. Выключите магнитную мешалку и переместите затвердевшие наношарики в центрифужную трубку. Центрифугируйте пробирку при давлении 13523 х г в течение 10 минут при комнатной температуре и выбросьте надосадочную жидкость.
   2. Добавьте в осадок первоначальный объем деионизированной воды, накройте трубку крышкой, погрузите ее в ультразвуковую водяную баню и поддерживайте погружение до полного рассеивания осадка.
   3. Повторите шаги 1.4.1-1.4.2 дважды, и, наконец, перенесите наношарики в стеклянную бутылку. Храните его при температуре 4 °C до использования.
5. Определение характеристик наногранул
   1. Охарактеризовать размер и морфологию наногранул квантовых точек с помощью визуализации с помощью просвечивающей электронной микроскопии (ПЭМ)²².
      ПРИМЕЧАНИЕ: Различные размеры наногранул могут быть получены путем изменения пропорции раствора квантовой точки и раствора ПСМА. Размер наногранул квантовых точек также может быть определен с помощью динамического рассеяния света (DLS)²⁷.

2. Получение конъюгатов QDNB-антител

1. Активация карбоксильных групп
   1. Добавьте 100 μL готового QDNB (10 мг/мл) в 200 μL фосфатного буфера (PB, 20 мМ, pH 6,0), затем добавьте 6 μL EDC (20 мг/мл).
   2. Инкубировать смесь в течение 30 минут при комнатной температуре на ротационном смесителе.
   3. После инкубации центрифугируйте смесь при 13523 х г в течение 10 минут при комнатной температуре и выбросьте надосадочную жидкость.
   4. Добавьте в осадок 100 мкл PB (20 мМ, pH 6,0), накройте пробирку крышкой и погрузите пробирку в рабочую ультразвуковую водяную баню до полного диспергирования осадка.
2. Конъюгация антител и наногранул
   1. Диспергируйте 100 мкг антитела в 200 мкл PB (20 мМ, pH 6,0) и добавьте в раствор антитела активированную суспензию QDNB, полученную на стадии 2.1.
   2. Инкубировать смесь при комнатной температуре в течение 30 минут при непрерывном вращении. Излишки антител удалить центрифугированием при 6010 х г в течение 5 мин (при комнатной температуре), а затем осторожно выбросить надосадочную жидкость.
3. Блокирование наногранул
   1. Добавьте 200 мкл 1% раствора казеина (в 20 мМ PB буфере, pH 7,4) к остатку (полученному на шаге 2.2.2), накройте пробирку крышкой и погрузите в рабочую ультразвуковую водяную баню до полного диспергирования остатка.
   2. Инкубировать смесь при комнатной температуре в течение 2 ч при непрерывном вращении.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Целью этого шага является блокировка любых неотреагировавших сайтов на поверхности QDNB.
4. Хранение конъюгатов
   1. Добавьте в смесь 100 μЛ консервирующего раствора (20 мМ PB буфера, pH 7,4, 1% BSA, 5% трегалозы, 6% сахарозы, 0,1% S9, pH 7,4) и храните при 4 °C для последующего использования.

3. Приготовление полосок для иммуноферментного анализа бокового потока

ПРИМЕЧАНИЕ: Иммунохроматографическая полоска состоит из мембраны из нитроцеллюлозы (НЦ), прокладки для образца, конъюгированной прокладки, абсорбирующей прокладки и платы из поливинилхлорида (ПВХ) (Рисунок 1). Все растворы должны быть приготовлены и использованы немедленно. Рекомендуется готовить полоски для иммуноферментного анализа бокового потока в чистом помещении с контролируемой влажностью.

1. Подготовка мембраны с ЧПУ
   1. Приготовьте раствор для покрытия тестовой линии (Т-линия) и контрольной линии (С-линия): разведите антитело захвата СРБ и козий антикроличьи IgG с ПБ до конечной концентрации 1 мг/мл.
   2. Правильно разместите плиту ПВХ и снимите защитную бумагу, расположенную на расстоянии 25 мм от края плиты ПВХ. Выровняйте и приклейте NC-мембрану по нижнему краю оставшейся защитной бумаги к плите из ПВХ.
   3. Нанесите растворы покрытий T-line и C-line на мембрану NC со скоростью струи 1 мкл/см, обеспечивая ее расположение на расстоянии 20 мм от верхнего края, образуя тестовую линию (шириной 1 мм).
   4. Для сушки поместите мембрану NC в условия с влажностью менее 30% и температурным режимом 18-26 °C. Время сушки должно составлять не менее 24 часов.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Убедитесь, что верхний и нижний края мембраны NC находятся на одном уровне с соответствующими краями смежных областей. К мембранам с ЧПУ нельзя прикасаться руками. Влажность на этом этапе следует контролировать в диапазоне от 45% до 65%. Прежде чем продолжить, раствор покрытия T-line, раствор покрытия C-line и мембрана NC должны быть уравновешены до одной и той же температуры.
2. Приготовление конъюгированной прокладки
   1. Погрузите конъюгатную прокладку в раствор для обработки конъюгированной прокладки (20 мМ PB буфера, pH 7,4, 1% BSA).
   2. Поместите замоченную конъюгатную подушечку в сушильную печь для обработки сушкой (комнатной температуры) на ночь.
   3. Аккуратно приклейте модифицированную сопряженную прокладку к плите из ПВХ.
   4. Приготовленный раствор конъюгата QDNB-антитела разбавить консервирующим раствором (20 мМ PB буфера, pH 7,4, 1% BSA, 5% трегалозы, 6% сахарозы, 0,1% S9, pH 7,4).
   5. Диспонируйте раствор конъюгата антитела QDNB на конъюгатную прокладку со скоростью струи 1 мкл/см и высушите конъюгатную прокладку в течение 24 ч.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Удельный коэффициент разбавления должен быть отрегулирован в соответствии с целью обнаружения.
3. Подготовка прокладки для образцов
   1. Погрузите прокладку для отбора проб в раствор для обработки пробы (20 мМ PB буфера, pH 7,4, 1% BSA, 5% трегалозы, 6% сахарозы, 0,1% S9, pH 7,4).
   2. Поместите замоченную прокладку для образцов в сушильную печь (45 °C) и сушите в течение 24 часов.
4. Сборка карты и нарезка ее на полоски
   1. Как показано на рисунке 1, последовательно поместите абсорбирующую бумагу (абсорбирующую прокладку), сопряженную прокладку и прокладку для образцов на плиту из ПВХ с ЧПУ-мембраной.
   2. Разрежьте открытку на полоски шириной 3,8 мм.
5. Упаковка стрипсов
   1. Оберните тест-полоски в пластиковую кассету и запечатайте мешочек из алюминиевой фольги, содержащий влагопоглотитель.

4. Пробирная операция и качественная оценка

ПРИМЕЧАНИЕ: Операции с образцами крови человека рекомендуется проводить в лаборатории уровня биобезопасности II. Образцы человеческой плазмы были получены из клинической лаборатории (у обезличенных людей). Как правило, человеческую кровь собирали с помощью вакуумной пробирки ЭДТА, а плазму выделяли по стандартному протоколу³⁴. Центрифугируйте при давлении 3 000 × г в течение 10 мин при комнатной температуре для разделения плазмы. Соберите верхний слой желтой плазмы с помощью пипетки и храните плазму в пробирке объемом 1,5 мл при температуре -80 °C до использования.

1. Пипетку 10 мкл образца плазмы или раствора калибратора в 1 мл PBS-буфера, содержащего 0,1% Tween 20. Затем переложите 100 мкл подготовленного разведенного образца на пробоотборник тест-полоски.
2. После 15-минутного прогона наблюдайте за сигналами флуоресценции линии Т и линии С под воздействием ультрафиолетового излучения для получения качественных результатов.
3. Вставьте стрип-карту в флуоресцентный считыватель для анализа бокового потока, чтобы получить интенсивность флуоресценции для количественного анализа.
   ПРИМЕЧАНИЕ: В данном примере используется метод сэндвич-иммуноанализа^35,36; Одна красная линия (контрольная линия) указывает на отрицательный результат, в то время как две красные линии (тестовая и контрольная линии) указывают на положительный результат. Отсутствие контрольной линии свидетельствует о том, что проведенное испытание является недействительным.

Результаты

Процедуры подготовки QDNB схематически проиллюстрированы на рисунке 1A. Масляную фазу, содержащую квантовые точки и полимер в хлороформе, смешивали с водной фазой, и получали мини-эмульсию методом ультразвука. Эмульсию затвердевали путем постепенного испарения хлорофор?...

Обсуждение

В данной статье мы описываем протокол получения наногранул квантовых точек (QDNB)²⁷ и использование QDNB для подготовки флуоресцентных иммунологических анализов бокового потока (LFIA). Продемонстрировано качественное и количественное измерение СРБ в образцах. Этот LFIA на основе ...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
(dimethylamino)propyl)-N’-ethylcarbodiimide hydrochloride	Sigma-Aldrich	03450
Absorbance paper	Kinbio Biotech	CH37K
Bovine serum albumin	Sigma-Aldrich	B2064
Casein	Sigma-Aldrich	C8654
CdSe/ZnS quantum dot	Suzhou Mesolight Inc.	CdSe/ZnS-625
Choloroform	Sino Pharm	10006818
CRP antibody	Hytest Biotech	4C28
Fluorescent lateral flow assay reader	Suzhou Helmence Precision Instrument	FIC-H1
Glass fiber pad	Kinbio Biotech	SB06
Goat anti-rabbit IgG	Sangon Biotech	D111018
Nitrocellulose membrane	Satorious	CN140
Poly(styrene-maleic anhydride) copolymer	Sigma-Aldrich	S458066
Rabbit IgG	Sangon Biotech	D110502
Sodium dodecyl sulfate	Sino Pharm	30166428
Sodium hydroxide	Sino Pharm	10019718