Quantum Dots Nanobeads를 기반으로 한 형광 측면 유동 면역분석법

요약

여기에서는 양자점 나노비드(QDNB)의 제조 및 QDNB 기반 측면 유동 면역분석 스트립을 사용한 질병 바이오마커 검출을 위한 프로토콜에 대해 설명합니다. 테스트 결과는 UV 조명 아래에서 정성적으로 평가할 수 있으며 형광 스트립 리더를 사용하여 15분 이내에 정량적으로 측정할 수 있습니다.

초록

반도체 나노결정으로도 알려진 양자점은 생물학적 이미징 및 감지를 위한 새로운 형광 라벨입니다. 그러나 번거로운 정제 절차를 통해 준비된 작은 치수(~10nm)의 양자점-항체 접합체는 측면 유동 면역분석 스트립을 사용하여 특정 미량 질환 마커를 검출하는 데 제한된 감도를 보입니다. 여기에서는 원스텝 에멀젼 증착법을 이용한 양자점 나노비드(QDNB)의 제조 방법을 제시한다. 준비된 QDNB를 사용하여 C-반응성 단백질(CRP)을 예로 들어 질병 바이오마커를 검출하기 위해 형광 측면 유동 면역분석을 제작했습니다. 단일 양자점 나노입자와 달리 양자점 나노비드-항체 접합체는 수백 개의 양자점을 하나의 고분자 복합 나노비드에 캡슐화하여 신호 증폭으로 인해 면역분석 라벨로서 더 민감합니다. 또한 QDNB의 크기가 크기 때문에 QDNB를 항체와 결합할 때 원심분리 분리가 더 쉽습니다. QDNB를 기반으로 한 형광 측면 유동 면역분석법을 제작하고 15분 만에 시료 내 CRP 농도를 측정했습니다. 테스트 결과는 UV 조명 아래에서 정성적으로 평가할 수 있으며 15분 이내에 형광 리더를 사용하여 정량적으로 측정할 수 있습니다.

서문

측면 유동 면역분석(LFIA) 스트립은 특히 전염병 중 질병 스크리닝에서 현장 진료 ^1,2에서 중요한 신속한 검출 도구 역할을 합니다. 그러나 기존의 콜로이드 금 기반 LFIA 테스트 스트립은 검출 감도가 낮고 정성적 결과만 제공합니다³. LFIA의 검출 감도를 향상시키기 위해 유색 라텍스 ^4,5, 상향 변환 형광 나노 입자⁶, 시간 분해 형광 마이크로 스피어 ^7,8 및 양자점 ^9,10,11을 포함한 다양한 새로운 나노 입자가 등장했습니다. 반도체 나노결정이라고도 하는 양자점(QD)^12,13은 조정 가능한 방출 파장, 넓은 여기 범위 및 높은 발광 효율을 제공하여 생물학적 이미징에 이상적인 라벨입니다.

그러나 개별 양자점에서 방출되는 형광 신호는 여전히 약하여 면역분석에서 검출 감도가 상대적으로 낮습니다. 마이크로스피어 내에 수많은 양자점을 캡슐화하면 신호를 증폭하고 양자점 기반 면역분석의 감도를 개선할 수 있습니다. 층별 자기 조립(layer-by-layer self-assembly) 14,15,16,17,18, 팽윤 방법(^19,20) 및 실리카 마이크로스피어(21,22,23,24 캡슐화)와 같은 다양한 방법이 마이크로스피어 내부의 양자점을 캡슐화하기 위해 사용되었다. 예를 들어, 양자점 기능성 실리카 나노구 라벨은 샌드위치 면역반응²⁵당 QD 로딩을 증가시킴으로써 달성할 수 있습니다. 초음파 분무기가 장착된 분무 건조기는 또한 나노 스케일 QD-BSA 나노 구체²⁶을 제조하는 데 사용되었습니다. 그러나 앞서 언급한 방법은 복잡한 다단계, 형광 소멸 및 낮은 생산성으로 어려움을 겪습니다.

이전 연구²⁷에서는 고분자 나노비드 내부에 양자점을 캡슐화하기 위한 에멀젼-용매 증발 방법이 보고되었습니다. 이 제조 기법은 간단하고, QD의 형광 효율을 유지하며, 높은 캡슐화 효율을 보장하고, 쉽게 확장 가능한 생산을 가능하게 합니다. 여러 연구 그룹은 식품 독소 검출^28,29,30, 전염병 바이오마커 검출 ^31,32 및 환경 모니터링³³을 포함한 응용 분야를 위해 이 방법을 통해 준비된 QDNB를 사용하여 LFIA 스트립을 성공적으로 개발했습니다.

이 프로토콜은 양자점 나노비드(QDNB), QDNB 및 항체 접합, QDNB 기반 LFIA 준비, 인간 혈장 샘플에서 C 반응성 단백질(CRP) 측정을 위한 특정 준비 단계를 제시합니다.

프로토콜

이 연구는 상하이 피부병 병원의 기관 검토 위원회(No. 2020-15)의 승인을 받았습니다. 인간 혈액 샘플과 관련된 모든 실험 절차는 생물 안전 레벨 II 실험실에서 수행되었습니다. 이 연구에 사용된 시약 및 장비의 세부 사항은 재료 표에 나열되어 있습니다.

1. QD 나노비드의 제조

참고: QD 나노비드 합성을 위해 에멀젼-용매 증발 기술을 사용하여 QD 나노비드를 합성했으며, 오일상과 수상의 비율은 1:5였습니다. 미니 에멀젼은 초음파를 통해 생성되고 나노 비드는 용매 (클로로포름) 증발을 통해 응고됩니다. 수산화 나트륨은 나노 비드 표면에서 무수물 그룹의 가수 분해를 촉매하여 카르복실 기로 변환하는 데 사용되었습니다.

1. 유상(oil phase) 및 수성상(aqueous phase) 용액의 준비
   1. 오일상 1mL 준비: 폴리(스티렌-코말레산 무수물)(PSMA) 용액 0.4mL(50mg/mL), QD 용액 0.1mL(100mg/mL), 1mL 미만의 부피에 클로로포름을 채웁니다.
   2. 5mL의 수성 상을 준비하십시오 : SDS 수용액 (0.5 wt %).
2. 에멀젼 및 응고의 준비
   1. 바이알(15mL)에 오일상 1mL와 수성상 5mL를 넣고 바이알을 자석 교반기에 놓습니다. 자기 교반기의 전원을 켭니다.
   2. 오일과 수성 상이 완전히 혼합 된 후 즉시 플라스크를 프로그래밍 된 (60 초, 3 초 펄스 후 3 초 일시 중지, 50 % 진폭) 초음파로 옮기고 전원을 켭니다.
   3. 초음파 처리 후 용액을 관찰하십시오. 처음에는 진홍색이었던 용액이 여전히 붉은 색조를 유지하는 유백색 단계로 전환되었습니다.
   4. 바이알을 실온의 자석 교반기에 다시 놓고 밤새 계속 저어줍니다. 클로로포름은 점차적으로 증발하고 에멀젼은 복합 나노 비드로 응고되었습니다.
3. nanobeads의 표면 개질
   1. 0.1mL의 0.1mM 수산화나트륨을 나노비즈 현탁액에 1시간 동안 첨가합니다. 나노비드 표면의 무수물기는 카르복실기로 가수분해됩니다.
4. 나노비드의 정제
   1. 자기 교반기를 끄고 응고된 나노비드를 원심분리기 튜브로 옮깁니다. 튜브를 실온에서 13523 x g 로 10분 동안 원심분리하고 상층액을 버립니다.
   2. 침전물에 초기 부피의 탈이온수를 추가하고, 튜브를 뚜껑으로 덮고, 초음파 수조에 담그고, 침전물이 완전히 분산될 때까지 침수를 유지합니다.
   3. 1.4.1-1.4.2 단계를 두 번 반복하고 마지막으로 나노 비드를 유리병에 옮깁니다. 사용할 때까지 4 °C에서 보관하십시오.
5. nanobeads의 특성 분석
   1. 투과 전자 현미경(TEM) 이미징을 사용하여 QD 나노비드의 크기와 형태를 특성화합니다²².
      참고: QDs 용액과 PSMA 용액의 비율을 변경하여 다양한 크기의 nanobeads를 얻을 수 있습니다. QD 나노비드의 크기는 동적 광 산란(DLS)²⁷을 통해서도 확인할 수 있습니다.

2. QDNB 항체 접합체의 제조

1. 카르복실기(carboxyl group)의 활성화
   1. 200μL의 인산염 완충액(PB, 20mM, pH 6.0)에 준비된 QDNB 100μL(10mg/mL)를 넣은 다음 6μL의 EDC(20mg/mL)를 추가합니다.
   2. 회전식 믹서에서 실온에서 30분 동안 혼합물을 배양합니다.
   3. 배양 후 혼합물을 실온에서 13523 x g 에서 10분 동안 원심분리하고 상층액을 버립니다.
   4. 침전물에 100μL의 PB(20mM, pH 6.0)를 추가하고 튜브를 뚜껑으로 덮은 다음 침전물이 완전히 분산될 때까지 튜브를 작동 중인 초음파 수조에 담그십시오.
2. 항체와 nanobeads의 접합
   1. 200μL의 PB(20mM, pH 6.0)에 100μg 항체를 분산시키고 2.1단계에서 얻은 활성 QDNB 현탁액을 항체 용액에 첨가합니다.
   2. 혼합물을 실온에서 30분 동안 연속 회전으로 배양합니다. 6010 x g 에서 5 분 (실온에서) 원심 분리하여 여분의 항체를 제거 한 후 상층액을 조심스럽게 버립니다.
3. 나노비드의 차단
   1. 200 μL의 1 % 카제인 용액 (20mM PB 완충액, pH 7.4)을 잔류 물 (2.2.2 단계에서 얻음)에 넣고 튜브를 뚜껑으로 덮고 잔류 물이 완전히 분산 될 때까지 작동 초음파 수조에 담그십시오.
   2. 혼합물을 실온에서 연속 회전으로 2시간 동안 배양합니다.
      참고: 이 단계의 목적은 QDNB 표면에서 반응되지 않은 부위를 차단하는 것입니다.
4. 접합체의 저장
   1. 100μL의 방부액(20mM PB 버퍼, pH 7.4, 1% BSA, 5% 트레할로스, 6% 자당, 0.1% S9, pH 7.4)을 혼합물에 넣고 후속 사용을 위해 4°C에서 보관합니다.

3. 측면 유동 면역분석 스트립의 준비

참고: 면역크로마토그래피 스트립은 니트로셀룰로오스(NC) 멤브레인, 샘플 패드, 접합 패드, 흡수 패드 및 폴리염화비닐(PVC) 보드로 구성됩니다(그림 1). 모든 솔루션은 즉시 준비하고 사용해야 합니다. 측면 유동 면역분석 스트립은 습도가 조절된 클린룸에서 준비하는 것이 좋습니다.

1. NC 멤브레인의 제조
   1. 테스트 라인(T-line) 및 제어 라인(C-line) 코팅 용액 준비: CRP 포획 항체 및 염소 항-토끼 IgG를 PB로 최종 농도 1mg/mL로 희석합니다.
   2. PVC 보드를 올바르게 놓고 PVC 보드 가장자리에서 25mm 떨어진 곳에 있는 보호 용지를 제거합니다. 나머지 보호 용지의 아래쪽 가장자리를 따라 NC 멤브레인을 PVC 보드에 정렬하고 부착합니다.
   3. T-라인 및 C-라인 코팅 용액을 1μL/cm의 분사 속도로 NC 멤브레인에 디스펜싱하여 상단 가장자리에서 20mm 떨어진 곳에 배치하여 테스트 라인(너비 1mm)을 형성합니다.
   4. 건조를 위해 습도가 30% 미만이고 온도 범위가 18-26°C인 조건에 NC 멤브레인을 배치합니다. 건조 시간은 24시간 이상이어야 합니다.
      알림: NC 멤브레인의 상단 및 하단 가장자리가 인접 영역의 해당 가장자리와 같은 높이인지 확인합니다. NC 멤브레인은 손으로 만져서는 안 됩니다. 이 단계의 습도는 45%에서 65% 범위 내에서 제어해야 합니다. 진행하기 전에 T-line 코팅 용액, C-line 코팅 용액 및 NC 멤브레인을 동일한 온도로 평형화해야 합니다.
2. 접합 패드의 준비
   1. 접합체 패드를 접합 패드 처리 용액(20mM PB 완충액, pH 7.4, 1%BSA)에 담급니다.
   2. 적신 접합체 패드를 건조 오븐에 넣고 밤새 건조 처리(실온)합니다.
   3. 수정된 접합 패드를 PVC 보드에 부드럽게 부착합니다.
   4. 제조된 QDNB 항체 접합체 용액을 방부제 용액(20mM PB 버퍼, pH 7.4, 1% BSA, 5% 트레할로스, 6% 자당, 0.1% S9, pH 7.4)으로 희석합니다.
   5. QDNB 항체 접합체 용액을 1μL/cm의 분사 속도로 접합체 패드에 분주하고 접합체 패드를 24시간 동안 건조시킵니다.
      알림: 특정 희석 비율은 검출 대상에 따라 조정해야 합니다.
3. 샘플 패드 준비
   1. 샘플 패드를 샘플 패드 처리 용액(20mM PB 버퍼, pH 7.4, 1% BSA, 5% 트레할로스, 6% 자당, 0.1% S9, pH 7.4)에 담그십시오.
   2. 적신 샘플 패드를 건조 오븐(45°C)에 넣고 24시간 동안 건조시킵니다.
4. 카드를 조립하여 스트립으로 자르기
   1. 그림 1과 같이 NC 멤브레인이 있는 PVC 보드에 흡수지(흡수 패드), 접합 패드 및 샘플 패드를 연속적으로 배치합니다.
   2. 카드를 3.8mm 너비의 스트립으로 자릅니다.
5. 스트립의 포장
   1. 테스트 스트립을 플라스틱 카세트에 넣고 건조제가 들어 있는 알루미늄 호일 파우치를 밀봉합니다.

4. 분석 작업 및 정성적 평가

알림: 인간 혈액 샘플과 관련된 작업은 생물 안전 레벨 II 실험실에서 수행하는 것이 좋습니다. 인간 혈장 샘플은 임상 실험실에서 획득했습니다(비식별화된 인간 피험자로부터). 전형적으로, EDTA 진공관을 사용하여 인간의 혈액을 수집하고, 혈장은 표준 프로토콜³⁴에 따라 분리하였다. 혈장 분리를 위해 실온에서 10분 동안 3,000× g 에서 원심분리합니다. 피펫을 사용하여 노란색 플라즈마 상층부를 수집하고 플라즈마를 -80°C에서 1.5ml 튜브에 담아 사용할 때까지 보관합니다.

1. 10 μL의 혈장 시료 또는 교정기 용액을 0.1% 트윈 20이 포함된 PBS 완충액 1mL에 피펫팅합니다. 그런 다음 준비된 희석된 샘플 100μL를 테스트 스트립의 샘플 패드에 옮깁니다.
2. 15분 실행 후 자외선 노출 상태에서 T 라인과 C 라인의 형광 신호를 관찰하여 정성적 결과를 얻습니다.
3. 스트립 카드를 형광 측면 유동 분석 리더에 삽입하여 정량 분석을 위한 형광 강도를 얻습니다.
   참고: 이 예에서, 샌드위치 면역분석법은^35,36; 하나의 빨간색 선(제어 라인)은 부정적인 결과를 나타내고 두 개의 빨간색 선(테스트 및 제어 라인)은 긍정적인 결과를 나타냅니다. 제어 라인이 없다는 것은 수행된 테스트가 유효하지 않음을 나타냅니다.

결과

QDNB 준비 절차는 그림 1A에 개략적으로 설명되어 있습니다. 클로로포름에 QD와 중합체를 함유하는 오일상을 물상과 혼합하고, 초음파 처리에 의해 미니 에멀젼을 얻었다. 에멀젼은 클로로포름의 점진적인 증발에 의해 응고되었다. QDNB의 투과 전자 현미경 사진(TEM)은 그림 2A에 나와 있습니다. QDNB는 TEM 이미지에서 50개 이상의 QDNB로 측정된 평균 직경이 96n...

토론

여기에서는 양자점 나노비드(QDNB)²⁷의 준비를 위한 프로토콜과 형광 측면 유동 면역분석(LFIA)의 준비를 위한 QDNB의 사용에 대해 설명합니다. 샘플에서 CRP의 정성적 및 정량적 측정이 입증됩니다. 이 QDNB 기반 LFIA는 다른 질병 바이오마커(^25,32), 식품 독소(^29,30), 바이러스(^16,27

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
(dimethylamino)propyl)-N’-ethylcarbodiimide hydrochloride	Sigma-Aldrich	03450
Absorbance paper	Kinbio Biotech	CH37K
Bovine serum albumin	Sigma-Aldrich	B2064
Casein	Sigma-Aldrich	C8654
CdSe/ZnS quantum dot	Suzhou Mesolight Inc.	CdSe/ZnS-625
Choloroform	Sino Pharm	10006818
CRP antibody	Hytest Biotech	4C28
Fluorescent lateral flow assay reader	Suzhou Helmence Precision Instrument	FIC-H1
Glass fiber pad	Kinbio Biotech	SB06
Goat anti-rabbit IgG	Sangon Biotech	D111018
Nitrocellulose membrane	Satorious	CN140
Poly(styrene-maleic anhydride) copolymer	Sigma-Aldrich	S458066
Rabbit IgG	Sangon Biotech	D110502
Sodium dodecyl sulfate	Sino Pharm	30166428
Sodium hydroxide	Sino Pharm	10019718