Un método integrado para crear optrodes electrofisiológicos flexibles y convenientes para el registro in vivo en múltiples regiones

Resumen

Hemos desarrollado un enfoque simplificado y rentable para la fabricación de electrodos y hemos realizado grabaciones de señales en múltiples regiones en ratones que se mueven libremente. El uso de la optogenética, junto con la electrofisiología multirregional y el registro de señales de calcio, permitió la revelación de las actividades neuronales en todas las regiones del modelo de convulsiones.

Resumen

La epilepsia es un trastorno neurológico caracterizado por descargas anormales sincronizadas que involucran múltiples regiones cerebrales. Las lesiones focales facilitan la propagación de señales epilépticas a través de circuitos neuronales asociados. Por lo tanto, el registro in vivo del potencial de campo local (LFP) de las regiones críticas del cerebro es esencial para descifrar los circuitos involucrados en la propagación de las convulsiones. Sin embargo, los métodos actuales para la fabricación e implantación de electrodos carecen de flexibilidad. Aquí, presentamos un dispositivo práctico diseñado para registros electrofisiológicos (LFP y electroencefalografía [EEG]) en múltiples regiones. Además, integramos a la perfección la manipulación optogenética y el registro de señalización de calcio con el registro LFP. Se observaron fuertes secreciones posteriores en varias regiones separadas durante las convulsiones epilépticas, acompañadas de un aumento de la señalización de calcio. El enfoque utilizado en este estudio ofrece una estrategia conveniente y flexible para las grabaciones neuronales sincrónicas en diversas regiones del cerebro. Tiene el potencial de avanzar en la investigación sobre los trastornos neurológicos al proporcionar información sobre los perfiles neuronales de múltiples regiones involucradas en estos trastornos.

Introducción

La epilepsia es una afección neurológica común caracterizada por convulsiones recurrentes, que se manifiestan como convulsiones, alteraciones sensoriales y pérdida^{del conocimiento.} Los mecanismos fisiopatológicos subyacentes a la epilepsia son complejos e involucran múltiples regiones cerebrales interconectadas ^2,3. Los avances recientes en neuroimagen han arrojado luz sobre las redes a gran escala implicadas en la epilepsia ^4,5. Sin embargo, la comprensión de los intrincados circuitos y mecanismos de red que subyacen a la generación y propagación de la epilepsia sigue siendo limitada, en parte debido a la insuficiente aplicación de técnicas de registro neuronal multirregional⁶. Por lo tanto, es imperativo desarrollar un método flexible e integrado capaz de monitorear simultáneamente la actividad neuronal en regiones cerebrales dispares.

Se realizan registros electrofisiológicos para capturar las convulsiones y determinar la presencia de epilepsia⁷. Excepto para el registro de la actividad electrofisiológica, existe un énfasis creciente en la actividad precisa del calcio de poblaciones neurales específicas en los estudios de epilepsia ^8,9. Los avances en la síntesis de indicadores de calcio y varios diseños de sondas han llevado a los investigadores a adoptar la fotometría de fibra para capturar los cambios en la actividad neuronal y las sustancias neuronales dentro del cerebro^10,11. Los dos métodos independientes de detección de la actividad neuronal, a saber, la electrofisiología y el registro de fotometría de fibras, se complementan entre sí, lo que facilita una comprensión más completa de los procesos neuronales dinámicos.

Además, el registro sincrónico y la modulación de la actividad neuronal son fundamentales para obtener información sobre el funcionamiento del cerebro tanto a nivel de red como celular. Este enfoque permite a los investigadores observar y manipular los complejos procesos del cerebro en tiempo real. La optogenética se ha convertido en una herramienta indispensable para sondear la señalización neuronal, debido a su capacidad distintiva para la estimulación o inhibición selectiva¹². A pesar de las amplias aplicaciones del registro electrofisiológico multicéntrico en neurociencia¹³, la integración del registro electrofisiológico multirregional con la fotometría de fibras y la manipulación optogenética sigue siendo limitada. Más importante aún, los métodos actuales para fabricar e implantar electrodos multirregionales carecen de flexibilidad¹⁴. Estas limitaciones obstaculizan nuestra capacidad para diseccionar funciones e interacciones de circuitos específicos en múltiples regiones. Aquí, presentamos un enfoque de registro in vivo multirregional rentable y conveniente que arroja luz sobre los procesos neuronales en todas las regiones en las convulsiones inducidas por la combustión y otros trastornos neuropsiquiátricos.

Protocolo

Este protocolo recibió la aprobación del Comité de Cuidado y Uso de Animales de la Universidad de Fudan y se llevó a cabo siguiendo las pautas y regulaciones diseñadas por la Guía para el Cuidado y Uso de Animales de Laboratorio de los Institutos Nacionales de Salud. Se implementaron todas las medidas posibles para minimizar el número de animales utilizados en este estudio. El tiempo necesario para realizar cada paso se incluye en los pasos respectivos.

1. Preparación de los electrodos (Figura 1)

1. Corte una longitud adecuada de alambre de tungsteno (~20 mm) y queme la capa de aislamiento en un extremo para exponer el alambre de tungsteno (1,6-2 mm). Doble el otro extremo del alambre en forma de "L" (vea la Figura 1A, ~ 1 min)
2. Coloque con cuidado el extremo "L" del alambre de tungsteno sobre la fibra óptica (consulte la Figura 1B, ~ 1 min).
   NOTA: El alambre de tungsteno debe ser 0,2-0,4 mm más largo que la punta de la fibra óptica.
3. Sumerja una gota de adhesivo y aplíquela a la interfaz de la fibra óptica y el alambre de tungsteno (consulte la Figura 1C, ~ 1 min). Debido a la tensión superficial del líquido, el alambre de tungsteno se unirá a la fibra óptica.
4. Aplique el adhesivo una vez y deje que se seque. A continuación, aplica una segunda capa. Esto tensará aún más la unión entre el alambre de tungsteno y la fibra óptica (consulte la Figura 1C, ~ 1 min).
   NOTA: Durante el proceso de aplicación, se debe tener cuidado para evitar que el adhesivo fluya hacia la punta de la fibra óptica, ya que esto puede afectar su transmitancia.
5. En la esquina de la forma de "L", use adhesivo para unir estrechamente la base de la fibra óptica y el alambre de tungsteno (~ 1 min).
   NOTA: El aumento del área de contacto y la solidificación esférica de la gota de adhesivo aseguran una unión firme entre la fibra óptica y el alambre de tungsteno.
6. Utilice la soldadura para establecer una conexión entre el alambre de tungsteno y el pin del conector hembra (consulte la Figura 1D, ~ 3 min para cada uno)
   NOTA: Dado que el alambre de tungsteno no es sensible al calor, la tasa de éxito de la soldadura se puede aumentar a casi el 100% mediante un manguito de metal diseñado cortando la ubicación de la ranura del pasador para unir físicamente los dos componentes. Posteriormente, la soldadura que llena el manguito asegura una conexión estable entre el alambre de tungsteno insertado y el pin.
7. De acuerdo con el diseño experimental, suelde el número requerido de optrodes (ver Figura 1E, ~10 min)
   NOTA: En este estudio se utilizaron tres optrodes.
8. Corte el alambre esmaltado a la longitud adecuada (~30 mm) y queme el aislamiento en ambos extremos. Envuelve un extremo del alambre esmaltado alrededor de la base del tornillo y suéldalo. Conecte el otro extremo del cable esmaltado a las clavijas del conector hembra a través de un soldador, que sirve como registro de EEG y conexión a tierra para el electrodo de cráneo (consulte la Figura 1F, ~ 5 min)
   NOTA: Debido a la flexibilidad del cable esmaltado, es conveniente conectar la calavera y los pines del conector hembra. La soldadura después de enrollar el alambre esmaltado alrededor de un tornillo es más confiable que la soldadura de montaje en superficie.
9. Aplique adhesivo termofusible a la matriz de pines del conector hembra para encapsular el conector hembra y asegurarse de que las uniones de soldadura estén completamente envueltas. Durante la solidificación del adhesivo termofusible, dé forma al adhesivo con una tabla de plástico para minimizar la ocupación de espacio durante la implantación (consulte la Figura 1F, ~ 3 min)
   NOTA: Debido a los riesgos potenciales de quemaduras asociados con el uso de pegamento termofusible, el adhesivo AB se considera una alternativa más segura.
10. A continuación, utilice un medidor de intensidad lumínica y un multímetro digital para medir la luminosidad y la conductividad. Al pasar estas pruebas, la configuración está lista para su uso (consulte la Figura 1G, ~ 2 min)
    NOTA: Cuando trabaje con láseres, use siempre gafas protectoras adecuadas para la longitud de onda y la potencia específicas de la luz láser. Se requieren fibras de alta calidad para transmitir al menos el 80% de la luz desde el extremo del cable de conexión hasta la punta de la fibra implantable. Además, se midió la resistencia desde la punta del alambre de tungsteno hasta la ranura del cabezal del pin con un rango aceptable de 1-5 Ω.
11. Antes de usar, sumerja los electrodos preparados en alcohol al 75% durante 15 minutos, luego transfiéralos a solución salina estéril (~16 minutos).
    NOTA: El peso total del dispositivo de electrodo encapsulado (0,6701 ± 0,01123 g, n = 4) no afecta la actividad de los ratones. Los electrodos se esterilizan previamente mediante esterilización por plasma.

2. Protocolo para la implantación de electrodos (Figura 2)

1. Anestesiar a los ratones con isoflurano (2%-4%) y asegurarlos en un aparato estereotáxico (ver Figura 2A, ~2 min). Use ungüento para los ojos del ratón para prevenir la sequedad mientras está bajo anestesia. Aplicar lidocaína sobre la piel alrededor del perímetro de la incisión craneal y una inyección subcutánea de carprofeno a una dosis de 5 mg/kg.
   NOTA: La anestesia adecuada se confirma a través de la ausencia del reflejo de enderezamiento y la pérdida de respuesta al pinzamiento del dedo del pie. Para procedimientos quirúrgicos prolongados, el uso de un anestésico inyectable es más apropiado.
2. Después de asegurar al animal en el aparato estereotáxico, recorte el cuero cabelludo a lo largo del borde del cráneo y limpie la superficie del cráneo con alcohol al 75% para exponer las posiciones del bregma y la lambda (ver Figura 2B, ~3 min).
   NOTA: El procedimiento prequirúrgico incluye el corte del cabello, la desinfección del sitio quirúrgico, la preesterilización de los instrumentos y las herramientas quirúrgicas.
3. Nivele el cerebro y perfore agujeros (~0,8 mm) por encima de las regiones de interés (ROI) con un microtaladro. Inyecte los virus relevantes con una bomba de jeringa (ver Figura 2C - F , ~20 min).
   NOTA: La información detallada sobre los virus y los ROI en este estudio se muestra en la Tabla de Materiales y la Figura 3.
4. Sujete los optrodes con un soporte y mueva su punta hasta el punto bregma, estableciendo esta posición en 'cero'. Usando el punto bregma como coordenada de referencia, mueva los optrodes a las regiones objetivo (ver Figura 2G, ~3 min). Coloque los optrodes a 0,3 mm por encima del lugar de inyección del virus.
   NOTA: En la estrategia de implantación vertical, la distancia mínima entre los dos electrodos es de aproximadamente 2 mm, dependiendo del grosor del manguito de fibra óptica y del diámetro exterior de la férula. Se puede utilizar un método de inserción en ángulo para la grabación simultánea desde regiones muy cercanas.
5. Después de insertar las fibras ópticas en las áreas cerebrales correspondientes, aplique una pequeña cantidad de adhesivo tisular alrededor de ellas para cubrir el tejido expuesto. Luego, aplique secuencialmente adhesivo adicional y un poco de cemento dental. Después de que el cemento dental se solidifique, suelte el soporte con cuidado (consulte la Figura 2H, ~ 5 min).
6. Antes de cada nueva implantación de optrode, realice la recalibración, que implica repetir el paso 2.4 (ver Figura 2I).
   NOTA: Para cada implantación, coloque el optrode en bregma como el punto "cero".
7. Después de implantar todos los optrodes, perfore los orificios detrás del punto lambda para 'Ground' y por encima del neocórtex para 'EEG' con un microdrill (~1 min).
   NOTA: El tamaño del orificio perforado (~1,1 mm) debe coincidir con el diámetro del tornillo.
8. Inserte los tornillos de cráneo en el orificio por encima de la corteza y detrás del punto lambda (ver Figura 2J, ~5 min).
   NOTA: Los tornillos de cráneo se utilizan para el registro de EEG y la conexión a tierra, respectivamente.
9. Organice los alambres de tungsteno y los alambres esmaltados para que se coloquen por encima del área de implantación y no queden expuestos fuera del cráneo. Asegure la posición del conector hembra con un soporte (consulte la Figura 2K, ~ 2 min).
10. Llene el sitio de implantación con cemento dental para asegurar una conexión estable entre el dispositivo de electrodos y el cráneo. Encapsule los cables internos, dejando expuestos los orificios de inserción del conector hembra para la conexión a la cabecera (consulte la Figura 2L, ~ 6 min).
11. Después del endurecimiento del cemento dental, aplique yodo a la piel alrededor del perímetro del cuero cabelludo expuesto y luego coloque al animal en una almohadilla térmica (~ 1 min).
    NOTA: Asegúrese de que el animal no quede desatendido hasta que haya recuperado la conciencia suficiente para mantener la decúbito esternal. Las condiciones estériles deben mantenerse durante toda la cirugía de supervivencia.
12. Administrar antibióticos y analgésicos para apoyar la recuperación postquirúrgica.
    NOTA: Los animales que han sido sometidos a cirugía no se reintroducen en compañía de otros animales hasta que se hayan recuperado por completo. A los animales se les administraron inyecciones intraperitoneales de ceftriaxona sódica (180 mg/kg) e inyecciones subcutáneas de carprofeno (5 mg/kg), y se les aplicó gel de lidocaína en las heridas quirúrgicas diariamente durante 3 días. Se requiere que los animales sobrevivan durante un período designado para completar las pruebas de comportamiento. Posteriormente, se les practicará la eutanasia con isoflurano al 4%-5%, seguido de perfusión y corte de tejido para evaluar la infección viral y los sitios de implantación de electrodos.

3. Protocolo para el registro in vivo del cerebro

1. Antes de realizar la grabación de la señal y las pruebas de comportamiento (prueba de campo abierto)¹⁵, asegúrese de que el ratón se someta a un período de 3 días de manipulación suave para aclimatarlo al entorno.
   NOTA: En este estudio, los ratones se colocaron en un campo abierto (42 cm × 42 cm) para que se movieran libremente, lo que nos permitió observar su comportamiento convulsivo.
2. Después de anestesiar a los ratones con isoflurano (2%-4%), conecte las fibras ópticas secuencialmente en el orden del sitio de registro antes de insertar la cabecera.
3. Ajuste el pulso de luz de 635 nm con un ciclo de trabajo del 10% a 20 Hz. Configure la estimulación de luz durante 10 s (200 pulsos) durante la grabación. Ajuste la intensidad en las puntas de la fibra óptica a 3 mW.
4. Utilice un sistema de fotometría de fibra para registrar el período de prueba de comportamiento de las señales Gcamp6m a una frecuencia de muestreo de 30 Hz por un canal LED de 470 nm.
5. Registre simultáneamente las señales de calcio, LFP y EEG bajo estimulación optogenética, junto con las actuaciones conductuales correspondientes (véase la figura 3).
6. Emplee el etiquetado de sincronización de señal de lógica de transistor-transistor (TTL) para garantizar la coherencia temporal en los datos registrados.

4. Tratamiento de datos

1. Cargue datos de fotometría en el software de MATLAB. A continuación, utilice la codificación personalizada (Archivo complementario 1) para eliminar la tendencia de la señal de calcio.
2. Defina los cambios en la intensidad de la fluorescencia con la ecuación (1):
   ΔF/F = (F_t - F₀)/ F₀ (1)
   Donde F_t representa los valores de fluorescencia de la señal de calcio en tiempo real, y F₀ denota la intensidad de fluorescencia basal promediada antes del evento.
3. Importe los datos electrofisiológicos, frecuencia muestreada de 1000 Hz, a MATLAB (Archivo complementario 2).
4. Coordine la visualización de la señalización de calcio y los datos electrofisiológicos en alineación con los marcadores sincronizados.

Resultados

Combinamos la optogenética con el registro electrofisiológico multirregional y las imágenes de calcio para observar la actividad neuronal en varias regiones del cerebro durante las convulsiones optogenéticas. Para ello, se inyectó un virus adenoasociado (AAV) que expresa ChrimsonR bajo el control del promotor de CaMKIIα (AAV-CaMKIIα-ChrimsonR-mcherry)¹⁶ en un sitio epileptogénico clásico, la corteza piriforme (ROI 1)¹⁷, en roedores...

Discusión

Aquí, empleamos un dispositivo optrode de fabricación propia para el registro de señales neuronales in vivo en múltiples regiones. Se ha validado la viabilidad de este sistema para la estimulación optogenética simultánea, el registro de señales de calcio y el registro electrofisiológico. El método de preparación de electrodos descrito en este documento es eficiente y rentable. De acuerdo con el diseño experimental, podríamos registrar señales de regiones cerebrales...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
8-32 adapter	Plexon	Custom ordered	Connect the female connector and headstage
AAV-CaMKIIα-ChrimsonR-mcherry	Taitool Bioscience	S0371-9	4 x 1012 VG/mL
AAV-hsyn-Gcamp6m	Taitool Bioscience	S0471-9	4 x 1012 VG/mL
DAPI	Sigma	236276	Titered 1:500
Dental Cement	New Century Dental	430205
Electrophysiological recordings system	Plexon	Omniplex
Enameled wire	N/A	Custom ordered	Diameter = 0.2 mm
Female connector	N/A	Custom ordered	1.25 mm pitch
Glue	Loctite	45282
Laser	Changchun New Industries	BH81563	635 nm
MATLAB	MathWorks	R2021b
Microdrill	RWD	78001
Multichannel fiber photometry	ThinkerTech	FPS-SS-MC-LED
Optical fiber	Xi'an Bogao	L-200UM	Select the appropriate fiber length based on the depth of the targeted brain regions.
PFA-Coated Tungsten wire	A-M System	795500	Bare 0.002"; Coated 0.0040"
Power meter	Thorlabs	PM100D
Stereotaxic Fxrame	RWD	68807
Tissue adhesive	3M	1469SB