Un metodo integrato per la creazione di optrodi elettrofisiologici flessibili e convenienti per la registrazione in vivo multi-regione

Riepilogo

Abbiamo sviluppato un approccio semplificato ed economico per la fabbricazione di elettrodi e condotto registrazioni di segnali su più regioni in topi che si muovono liberamente. L'utilizzo dell'optogenetica, insieme all'elettrofisiologia multiregionale e alla registrazione del segnale del calcio, ha permesso la rivelazione delle attività neuronali in tutte le regioni nel modello di accensione delle crisi.

Abstract

L'epilessia è un disturbo neurologico caratterizzato da scariche anomale sincronizzate che coinvolgono più regioni del cervello. Le lesioni focali facilitano la propagazione dei segnali epilettici attraverso i circuiti neurali associati. Pertanto, la registrazione in vivo del potenziale di campo locale (LFP) dalle regioni cerebrali critiche è essenziale per decifrare i circuiti coinvolti nella propagazione delle crisi. Tuttavia, i metodi attuali per la fabbricazione e l'impianto di elettrodi mancano di flessibilità. Qui presentiamo un pratico dispositivo progettato per registrazioni elettrofisiologiche (LFP ed elettroencefalografia [EEG]) in più regioni. Inoltre, abbiamo integrato perfettamente la manipolazione optogenetica e la registrazione della segnalazione del calcio con la registrazione LFP. Durante le crisi epilettiche sono stati osservati robusti post-scarichi in diverse regioni separate, accompagnati da un aumento della segnalazione del calcio. L'approccio utilizzato in questo studio offre una strategia conveniente e flessibile per le registrazioni neurali sincrone in diverse regioni del cervello. Ha il potenziale per far progredire la ricerca sui disturbi neurologici fornendo approfondimenti sui profili neurali di più regioni coinvolte in questi disturbi.

Introduzione

L'epilessia è una condizione neurologica comune caratterizzata da convulsioni ricorrenti, che si manifestano come convulsioni, disturbi sensoriali e perdita^{di coscienza.} I meccanismi fisiopatologici alla base dell'epilessia sono complessi e coinvolgono più regioni cerebrali interconnesse ^2,3. I recenti progressi nel campo del neuroimaging hanno fatto luce sulle reti su larga scala coinvolte nell'epilessia ^4,5. Tuttavia, la comprensione degli intricati circuiti e meccanismi di rete alla base della generazione e della propagazione dell'epilessia rimane limitata, in parte a causa dell'insufficiente applicazione delle tecniche di registrazione neurale multi-regione⁶. Pertanto, è imperativo sviluppare un metodo flessibile e integrato in grado di monitorare simultaneamente l'attività neurale in diverse regioni del cervello.

Vengono condotte registrazioni elettrofisiologiche per catturare le convulsioni e determinare la presenza di epilessia⁷. Oltre alla registrazione dell'attività elettrofisiologica, negli studi sull'epilessia c'è una crescente enfasi sull'attività precisa del calcio di specifiche popolazioni neurali ^8,9. I progressi nella sintesi degli indicatori di calcio e vari progetti di sonde hanno spinto i ricercatori ad adottare la fotometria delle fibre per catturare i cambiamenti nell'attività neuronale e nelle sostanze neurali all'interno del cervello^10,11. I due metodi indipendenti di rilevamento dell'attività neuronale, vale a dire l'elettrofisiologia e la registrazione della fotometria delle fibre, si completano a vicenda, facilitando una comprensione più completa dei processi neuronali dinamici.

Inoltre, la registrazione sincrona e la modulazione dell'attività neurale sono fondamentali per ottenere informazioni sul funzionamento del cervello sia a livello di rete che cellulare. Questo approccio consente ai ricercatori di osservare e manipolare i complessi processi del cervello in tempo reale. L'optogenetica è emersa come uno strumento indispensabile per sondare la segnalazione neurale, grazie alla sua capacità distintiva di stimolazione o inibizione selettiva¹². Nonostante le diffuse applicazioni della registrazione elettrofisiologica multi-sito nelle neuroscienze¹³, l'integrazione della registrazione elettrofisiologica multi-regione con la fotometria delle fibre e la manipolazione optogenetica rimane limitata. Ancora più importante, gli attuali metodi per la fabbricazione e l'impianto di elettrodi multi-regione mancano di flessibilità¹⁴. Queste limitazioni ostacolano la nostra capacità di sezionare specifiche funzioni e interazioni del circuito in più regioni. Qui, presentiamo un approccio di registrazione in vivo multi-regione conveniente ed economico che fa luce sui processi neuronali attraverso le regioni nelle convulsioni indotte dall'accensione e in altri disturbi neuropsichiatrici.

Protocollo

Questo protocollo ha ricevuto l'approvazione dal Comitato per la cura e l'uso degli animali dell'Università di Fudan ed è stato condotto seguendo le linee guida e i regolamenti progettati dalla Guida del National Institutes of Health per la cura e l'uso degli animali da laboratorio. Sono state implementate tutte le misure possibili per ridurre al minimo il numero di animali utilizzati in questo studio. Il tempo necessario per eseguire ogni passaggio è incluso nei rispettivi passaggi.

1. Preparazione degli elettrodi (Figura 1)

1. Tagliare una lunghezza appropriata di filo di tungsteno (~20 mm) e bruciare lo strato isolante a un'estremità per esporre il filo di tungsteno (1,6-2 mm). Piegare l'altra estremità del filo a forma di "L" (vedere la Figura 1A, ~1 min)
2. Posizionare con cautela l'estremità a "L" del filo di tungsteno sulla fibra ottica (vedere Figura 1B, ~1 min).
   NOTA: Il filo di tungsteno deve essere 0,2-0,4 mm più lungo della punta della fibra ottica.
3. Immergere una goccia di adesivo e applicarlo all'interfaccia della fibra ottica e del filo di tungsteno (vedere Figura 1C, ~1 min). A causa della tensione superficiale del liquido, il filo di tungsteno si attaccherà alla fibra ottica.
4. Applicare l'adesivo una volta e lasciarlo asciugare. Quindi, applicare una seconda mano. Ciò rafforzerà ulteriormente il legame tra il filo di tungsteno e la fibra ottica (vedere Figura 1C, ~1 min).
   NOTA: Durante il processo di applicazione, è necessario prestare attenzione per evitare che l'adesivo scorra sulla punta della fibra ottica, poiché ciò potrebbe influire sulla sua trasmittanza.
5. All'angolo della forma a "L", utilizzare dell'adesivo per legare strettamente la base della fibra ottica e il filo di tungsteno (~1 min).
   NOTA: L'area di contatto aumentata e la solidificazione sferica della gocciolina di adesivo assicurano un legame saldo tra la fibra ottica e il filo di tungsteno.
6. Utilizzare la saldatura per stabilire un collegamento tra il filo di tungsteno e il pin del connettore femmina (vedere la Figura 1D, ~3 min per ciascuno)
   NOTA: Poiché il filo di tungsteno non è sensibile al calore, il tasso di successo della saldatura può essere aumentato fino a quasi il 100% da un manicotto metallico modellato tagliando la posizione della fessura del perno per unire fisicamente i due componenti. Successivamente, il riempimento a saldare del manicotto garantisce un collegamento stabile tra il filo di tungsteno inserito e il perno.
7. Secondo il disegno sperimentale, saldare il numero richiesto di optrodes (vedi Figura 1E, ~10 min)
   NOTA: In questo studio sono stati utilizzati tre optrodes.
8. Tagliare il filo smaltato alla lunghezza appropriata (~30 mm) e bruciare l'isolamento su entrambe le estremità. Avvolgere un'estremità del filo smaltato attorno alla base della vite e saldarla. Collegare l'altra estremità del filo smaltato ai pin del connettore femmina tramite un saldatore, che funge da registrazione EEG e collegamento a terra per l'elettrodo del cranio (vedere Figura 1F, ~5 min)
   NOTA: Grazie alla flessibilità del filo smaltato, è conveniente collegare il teschio e i pin del connettore femmina. La saldatura dopo l'avvolgimento del filo smaltato attorno a una vite è più affidabile della saldatura a montaggio superficiale.
9. Applicare l'adesivo hot-melt all'array di pin del connettore femmina per incapsulare il connettore femmina e assicurarsi che i giunti di saldatura siano completamente avvolti. Durante la solidificazione dell'adesivo hot-melt, modellare l'adesivo utilizzando un pannello di plastica per ridurre al minimo l'occupazione dello spazio durante l'impianto (vedere Figura 1F, ~3 min)
   NOTA: A causa dei potenziali rischi di ustione associati all'uso della colla hot-melt, l'adesivo AB è considerato un'alternativa più sicura.
10. Quindi, utilizzare un misuratore di intensità luminosa e un multimetro digitale per misurare la luminanza e la conducibilità. Dopo aver superato questi test, la configurazione è pronta per l'uso (vedere Figura 1G, ~2 min)
    NOTA: Quando si lavora con i laser, indossare sempre occhiali protettivi adatti alla lunghezza d'onda e alla potenza specifiche della luce laser. Sono necessarie fibre di alta qualità per trasmettere almeno l'80% della luce dall'estremità del cavo patch alla punta della fibra impiantabile. Inoltre, la resistenza dalla punta del filo di tungsteno alla fessura dell'intestazione del pin è stata misurata con un intervallo accettabile di 1-5 Ω.
11. Prima dell'uso, immergere gli elettrodi preparati in alcol al 75% per 15 minuti, quindi trasferirli in soluzione fisiologica sterile (~16 minuti).
    NOTA: Il peso totale del dispositivo a elettrodi incapsulati (0,6701 ± 0,01123 g, n = 4) non influisce sull'attività dei topi. Gli elettrodi vengono sterilizzati in anticipo mediante sterilizzazione al plasma.

2. Protocollo per l'impianto di elettrodi (Figura 2)

1. Anestetizzare i topi con isoflurano (2%-4%) e fissarli in un apparato stereotassico (vedi Figura 2A, ~2 min). Usa un unguento per gli occhi sugli occhi del topo per prevenire la secchezza durante l'anestesia. Applicare lidocaina sulla pelle attorno al perimetro dell'incisione cranica e un'iniezione sottocutanea di carprofene alla dose di 5 mg/kg.
   NOTA: Una corretta anestesia è confermata dall'assenza del riflesso di raddrizzamento e dalla perdita di risposta al pizzicamento delle dita. Per procedure chirurgiche prolungate, è più appropriato l'uso di un anestetico iniettabile.
2. Dopo aver assicurato l'animale nell'apparato stereotassico, tagliare via il cuoio capelluto lungo il bordo del cranio e pulire la superficie del cranio con alcol al 75% per esporre le posizioni del bregma e del lambda (vedi Figura 2B, ~3 min).
   NOTA: La procedura pre-chirurgica include il taglio dei capelli, la disinfezione del sito chirurgico, la pre-sterilizzazione degli strumenti e degli strumenti chirurgici.
3. Livellare il cervello e praticare dei fori (~0,8 mm) sopra le regioni di interesse (ROI) utilizzando un microdrill. Iniettare i virus pertinenti con una pompa a siringa (vedere Figura 2C - F, ~20 min).
   NOTA: Informazioni dettagliate sui virus e sul ROI in questo studio sono mostrate nella Tabella dei materiali e nella Figura 3.
4. Tenere gli optrodes con un supporto e spostare la punta verso il punto di bregma, impostando questa posizione su 'zero'. Utilizzando il punto bregma come coordinata di riferimento, spostare gli optrode verso le regioni target (vedi Figura 2G, ~3 min). Posizionare gli optrodes 0,3 mm sopra il sito di iniezione del virus.
   NOTA: Nella strategia di impianto verticale, la distanza minima tra i due elettrodi è di circa 2 mm, a seconda dello spessore del manicotto in fibra ottica e del diametro esterno della ghiera. Un metodo di inserimento angolato può essere utilizzato per la registrazione simultanea da regioni vicine.
5. Dopo aver inserito le fibre ottiche nelle aree cerebrali corrispondenti, applicare una piccola quantità di adesivo tissutale attorno ad esse per coprire il tessuto esposto. Quindi, applicare in sequenza altro adesivo e un po' di cemento dentale. Dopo che il cemento dentale si è solidificato, rilasciare con cautela il supporto (vedere Figura 2H, ~5 min).
6. Prima di ogni nuovo impianto di optrode, eseguire la ricalibrazione, che comporta la ripetizione del passaggio 2.4 (vedere Figura 2I).
   NOTA: Per ogni impianto, posizionare l'optrode in corrispondenza della bregma come punto "zero".
7. Dopo aver impiantato tutti gli optrodes, praticare i fori dietro il punto lambda per "Ground" e sopra la neocorteccia per "EEG" utilizzando un microtrapano (~1 min).
   NOTA: La dimensione del foro praticato (~1,1 mm) deve corrispondere al diametro della vite.
8. Inserire le viti del cranio nel foro sopra la corteccia e dietro il punto lambda (vedi Figura 2J, ~5 min).
   NOTA: Le viti del cranio vengono utilizzate rispettivamente per la registrazione EEG e la messa a terra.
9. Organizzare i fili di tungsteno e i fili smaltati in modo che siano posizionati sopra l'area di impianto e non esposti all'esterno del cranio. Fissare la posizione del connettore femmina utilizzando un supporto (vedere la Figura 2K, ~2 min).
10. Riempire il sito di impianto con cemento dentale per garantire una connessione stabile tra il dispositivo elettrodo e il cranio. Incapsulare i fili interni, lasciando esposti i fori di inserimento del connettore femmina per il collegamento all'headstage (vedere Figura 2L, ~6 min).
11. Dopo l'indurimento del cemento dentale, applicare lo iodio sulla pelle attorno al perimetro del cuoio capelluto esposto e quindi posizionare l'animale su un cuscinetto riscaldante (~1 min).
    NOTA: Assicurarsi che l'animale non venga lasciato incustodito fino a quando non ha riacquistato sufficiente coscienza per mantenere la decubito sternale. Le condizioni di sterilità devono essere mantenute durante l'intervento chirurgico di sopravvivenza.
12. Somministrare antibiotici e analgesici per supportare il recupero post-chirurgico.
    NOTA: Gli animali che hanno subito un intervento chirurgico non vengono reintrodotti in compagnia di altri animali fino a quando non si sono completamente ripresi. Agli animali sono state somministrate iniezioni intraperitoneali di ceftriaxone sodico (180 mg/kg) e iniezioni sottocutanee di carprofene (5 mg/kg) e il gel di lidocaina è stato applicato sulle ferite chirurgiche ogni giorno per 3 giorni. Gli animali sono tenuti a sopravvivere per un periodo designato per completare i test comportamentali. Successivamente, saranno soppressi utilizzando isoflurano al 4%-5%, seguiti da perfusione e sezionamento tissutale per valutare l'infezione virale e i siti di impianto degli elettrodi.

3. Protocollo per la registrazione del cervello in vivo

1. Prima di eseguire la registrazione del segnale e i test comportamentali (test in campo aperto)¹⁵, assicurarsi che il topo sia sottoposto a un periodo di manipolazione delicata di 3 giorni per acclimatarlo all'ambiente.
   NOTA: In questo studio, i topi sono stati posti in un campo aperto (42 cm × 42 cm) per muoversi liberamente, permettendoci di osservare il loro comportamento convulsivo.
2. Dopo aver anestetizzato i topi con isoflurano (2%-4%), collegare le fibre ottiche in sequenza nell'ordine del sito di registrazione prima di inserire l'headstage.
3. Impostare l'impulso luminoso a 635 nm con un ciclo di lavoro del 10% a 20 Hz. Impostare la stimolazione luminosa per 10 s (200 impulsi) durante la registrazione. Impostare l'intensità sulle punte della fibra ottica a 3 mW.
4. Utilizzare un sistema di fotometria in fibra per registrare il periodo di test comportamentale dei segnali Gcamp6m a una frequenza di campionamento di 30 Hz per canale LED a 470 nm.
5. Registrare simultaneamente i segnali del calcio, gli LFP e l'EEG sotto stimolazione optogenetica, insieme alle corrispondenti prestazioni comportamentali (vedi Figura 3).
6. Utilizza l'etichettatura di sincronizzazione del segnale TTL (transistor-transistor logic) per garantire la coerenza temporale dei dati registrati.

4. Trattamento dei dati

1. Carica i dati fotometrici sul software MATLAB. Quindi, utilizzare la codifica personalizzata (File supplementare 1) per detrendare il segnale del calcio.
2. Definisci le variazioni dell'intensità della fluorescenza con l'equazione (1):
   ΔF/F = (F_t - F₀)/ F₀ (1)
   Dove F_t rappresenta i valori di fluorescenza del segnale di calcio in tempo reale e F₀ denota l'intensità di fluorescenza media di base prima dell'evento.
3. Importa i dati elettrofisiologici, frequenza campionata di 1000 Hz, in MATLAB (File supplementare 2).
4. Coordinare la visualizzazione dei dati di segnalazione ed elettrofisiologici del calcio in allineamento con i marcatori sincronizzati.

Risultati

Abbiamo combinato l'optogenetica con la registrazione elettrofisiologica multiregionale e l'imaging del calcio per osservare l'attività neuronale in varie regioni del cervello durante le crisi optogenetiche. A questo scopo, un virus adeno-associato (AAV) che esprime ChrimsonR sotto il controllo del promotore CaMKIIα (AAV-CaMKIIα-ChrimsonR-mcherry)¹⁶ è stato iniettato in un sito epilettogeno classico, la corteccia piriforme (ROI 1)¹⁷, ne...

Discussione

Qui, abbiamo impiegato un dispositivo optrode autocostruito per la registrazione del segnale neurale in vivo in più regioni. La fattibilità di questo sistema per la stimolazione optogenetica simultanea, la registrazione del segnale del calcio e la registrazione elettrofisiologica è stata convalidata. Il metodo di preparazione degli elettrodi qui descritto è efficiente ed economico. Secondo il disegno sperimentale, potremmo registrare segnali da regioni cerebrali rilevanti. L...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
8-32 adapter	Plexon	Custom ordered	Connect the female connector and headstage
AAV-CaMKIIα-ChrimsonR-mcherry	Taitool Bioscience	S0371-9	4 x 1012 VG/mL
AAV-hsyn-Gcamp6m	Taitool Bioscience	S0471-9	4 x 1012 VG/mL
DAPI	Sigma	236276	Titered 1:500
Dental Cement	New Century Dental	430205
Electrophysiological recordings system	Plexon	Omniplex
Enameled wire	N/A	Custom ordered	Diameter = 0.2 mm
Female connector	N/A	Custom ordered	1.25 mm pitch
Glue	Loctite	45282
Laser	Changchun New Industries	BH81563	635 nm
MATLAB	MathWorks	R2021b
Microdrill	RWD	78001
Multichannel fiber photometry	ThinkerTech	FPS-SS-MC-LED
Optical fiber	Xi'an Bogao	L-200UM	Select the appropriate fiber length based on the depth of the targeted brain regions.
PFA-Coated Tungsten wire	A-M System	795500	Bare 0.002"; Coated 0.0040"
Power meter	Thorlabs	PM100D
Stereotaxic Fxrame	RWD	68807
Tissue adhesive	3M	1469SB