Une méthode intégrée pour la fabrication d’optrodes électrophysiologiques flexibles et pratiques pour l’enregistrement in vivo multi-régions

Résumé

Nous avons développé une approche simplifiée et rentable pour la fabrication d’électrodes et avons effectué des enregistrements de signaux dans plusieurs régions chez des souris se déplaçant librement. L’utilisation de l’optogénétique, associée à l’électrophysiologie multirégion et à l’enregistrement du signal calcique, a permis de révéler les activités neuronales dans toutes les régions du modèle d’allumage des crises.

Résumé

L’épilepsie est un trouble neurologique caractérisé par des décharges anormales synchronisées impliquant plusieurs régions du cerveau. Les lésions focales facilitent la propagation des signaux épileptiques à travers les circuits neuronaux associés. Par conséquent, l’enregistrement in vivo du potentiel de champ local (LFP) à partir des régions critiques du cerveau est essentiel pour déchiffrer les circuits impliqués dans la propagation des crises. Cependant, les méthodes actuelles de fabrication et d’implantation d’électrodes manquent de flexibilité. Ici, nous présentons un appareil pratique conçu pour les enregistrements électrophysiologiques (LFP et électroencéphalographie [EEG]) dans plusieurs régions. De plus, nous avons intégré de manière transparente la manipulation optogénétique et l’enregistrement de la signalisation calcique à l’enregistrement LFP. Des sécharges postérieures robustes ont été observées dans plusieurs régions distinctes pendant les crises d’épilepsie, accompagnées d’une augmentation de la signalisation calcique. L’approche utilisée dans cette étude offre une stratégie pratique et flexible pour les enregistrements neuronaux synchrones dans diverses régions du cerveau. Il a le potentiel de faire progresser la recherche sur les troubles neurologiques en fournissant des informations sur les profils neuronaux de plusieurs régions impliquées dans ces troubles.

Introduction

L’épilepsie est une affection neurologique courante caractérisée par des convulsions récurrentes, qui se manifestent par des convulsions, des troubles sensoriels et une perte de conscience¹. Les mécanismes physiopathologiques sous-jacents à l’épilepsie sont complexes et impliquent de multiples régions cérébrales interconnectées ^2,3. Les progrès récents de la neuroimagerie ont mis en lumière les réseaux à grande échelle impliqués dans l’épilepsie ^4,5. Cependant, la compréhension des circuits complexes et des mécanismes de réseau sous-jacents à la génération et à la propagation de l’épilepsie reste limitée, en partie à cause de l’application insuffisante des techniques d’enregistrement neuronal multi-régions⁶. Par conséquent, il est impératif de développer une méthode flexible et intégrée capable de surveiller simultanément l’activité neuronale dans des régions cérébrales disparates.

Des enregistrements électrophysiologiques sont effectués pour capturer les crises et déterminer la présence d’épilepsie⁷. À l’exception de l’enregistrement de l’activité électrophysiologique, l’accent est de plus en plus mis sur l’activité calcique précise de populations neuronales spécifiques dans les études sur l’épilepsie ^8,9. Les progrès de la synthèse d’indicateurs calciques et de diverses conceptions de sondes ont incité les chercheurs à adopter la photométrie à fibres pour capturer les changements dans l’activité neuronale et les substances neuronales dans le cerveau^10,11. Les deux méthodes indépendantes de détection de l’activité neuronale, à savoir l’électrophysiologie et l’enregistrement par photométrie de fibres, se complètent, facilitant une compréhension plus complète des processus neuronaux dynamiques.

De plus, l’enregistrement synchrone et la modulation de l’activité neuronale sont essentiels pour mieux comprendre le fonctionnement du cerveau aux niveaux réseau et cellulaire. Cette approche permet aux chercheurs d’observer et de manipuler les processus complexes du cerveau en temps réel. L’optogénétique est apparue comme un outil indispensable pour sonder la signalisation neuronale, en raison de sa capacité distinctive de stimulation sélective ou d’inhibition¹². Malgré les applications répandues de l’enregistrement électrophysiologique multisite en neurosciences¹³, l’intégration de l’enregistrement électrophysiologique multi-régions avec la photométrie sur fibre et la manipulation optogénétique reste limitée. Plus important encore, les méthodes actuelles de fabrication et d’implantation d’électrodes multirégions manquent de flexibilité¹⁴. Ces limitations entravent notre capacité à disséquer des fonctions de circuits spécifiques et des interactions dans plusieurs régions. Ici, nous présentons une approche d’enregistrement in vivo multi-régions rentable et pratique qui met en lumière les processus neuronaux dans toutes les régions des crises induites par l’allumage et d’autres troubles neuropsychiatriques.

Protocole

Ce protocole a reçu l’approbation du Comité de soin et d’utilisation des animaux de l’Université Fudan et a été mis en œuvre conformément aux directives et règlements conçus par le Guide des National Institutes of Health pour le soin et l’utilisation des animaux de laboratoire. Toutes les mesures possibles ont été mises en œuvre pour minimiser le nombre d’animaux utilisés dans cette étude. Le temps nécessaire à l’exécution de chaque étape est inclus dans les étapes respectives.

1. Préparation des électrodes (Figure 1)

1. Coupez une longueur appropriée de fil de tungstène (~20 mm) et brûlez la couche isolante à une extrémité pour exposer le fil de tungstène (1,6-2 mm). Pliez l’autre extrémité du fil en forme de « L » (voir Figure 1A, ~1 min)
2. Placez avec précaution l’extrémité « L » du fil de tungstène sur la fibre optique (voir Figure 1B, ~1 min).
   REMARQUE : Le fil de tungstène doit être 0,2 à 0,4 mm plus long que la pointe de la fibre optique.
3. Trempez une goutte d’adhésif et appliquez-la sur l’interface de la fibre optique et du fil de tungstène (voir Figure 1C, ~1 min). En raison de la tension superficielle du liquide, le fil de tungstène se fixera à la fibre optique.
4. Appliquez l’adhésif une fois et laissez-le sécher. Ensuite, appliquez une deuxième couche. Cela resserrera davantage la liaison entre le fil de tungstène et la fibre optique (voir Figure 1C, ~1 min).
   REMARQUE : Pendant le processus d’application, il faut veiller à ce que l’adhésif ne coule pas vers l’extrémité de la fibre optique, car cela peut affecter sa transmission.
5. Dans le coin de la forme en « L », utilisez un adhésif pour lier étroitement la base de la fibre optique et le fil de tungstène ensemble (~1 min).
   REMARQUE : La surface de contact accrue et la solidification sphérique de la gouttelette de colle assurent une liaison solide entre la fibre optique et le fil de tungstène.
6. Utilisez de la soudure pour établir une connexion entre le fil de tungstène et la broche du connecteur femelle (voir Figure 1D, ~3 min pour chacun)
   REMARQUE : Étant donné que le fil de tungstène n’est pas sensible à la chaleur, le taux de réussite de la soudure peut être augmenté à près de 100% par un manchon métallique façonné en coupant l’emplacement de la fente de la goupille pour unir physiquement les deux composants. Par la suite, le remplissage de soudure du manchon assure une connexion stable entre le fil de tungstène inséré et la broche.
7. Selon le plan expérimental, souder le nombre requis d’optrodes (voir Figure 1E, ~10 min)
   REMARQUE : Trois optrodes ont été utilisés dans cette étude.
8. Coupez le fil émaillé à la longueur appropriée (~30 mm) et brûlez l’isolant aux deux extrémités. Enroulez une extrémité du fil émaillé autour de la base de la vis et soudez-la. Connectez l’autre extrémité du fil émaillé aux broches du connecteur femelle à l’aide d’un fer à souder, servant d’enregistrement EEG et de connexion à la terre pour l’électrode du crâne (voir Figure 1F, ~5 min)
   REMARQUE : En raison de la flexibilité du fil émaillé, il est pratique de connecter le crâne et les broches du connecteur femelle. La soudure après avoir enroulé le fil émaillé autour d’une vis est plus fiable que la soudure en surface.
9. Appliquez un adhésif thermofusible sur le réseau de broches du connecteur femelle pour encapsuler le connecteur femelle et vous assurer que les joints de soudure sont entièrement enveloppés. Lors de la solidification de l’adhésif thermofusible, façonnez l’adhésif à l’aide d’un panneau de plastique pour minimiser l’occupation de l’espace lors de l’implantation (voir Figure 1F, ~3 min)
   REMARQUE : En raison des risques potentiels de brûlure associés à l’utilisation de colle thermofusible, l’adhésif AB est considéré comme une alternative plus sûre.
10. Ensuite, utilisez un compteur d’intensité lumineuse et un multimètre numérique pour mesurer la luminosité et la conductivité. Une fois ces tests réussis, la configuration est prête à l’emploi (voir Figure 1G, ~2 min)
    REMARQUE : Lorsque vous travaillez avec des lasers, portez toujours des lunettes de protection adaptées à la longueur d’onde et à la puissance spécifiques de la lumière laser. Des fibres de haute qualité sont nécessaires pour transmettre au moins 80 % de la lumière de l’extrémité du cordon de raccordement à l’extrémité de la fibre implantable. De plus, la résistance de l’extrémité du fil de tungstène à la fente de l’en-tête de la broche a été mesurée avec une plage acceptable de 1 à 5 Ω.
11. Avant utilisation, plongez les électrodes préparées dans de l’alcool à 75% pendant 15 min, puis transférez-les dans une solution saline stérile (~16 min).
    REMARQUE : Le poids total du dispositif à électrodes encapsulées (0,6701 ± 0,01123 g, n = 4) n’affecte pas l’activité des souris. Les électrodes sont stérilisées à l’avance par stérilisation au plasma.

2. Protocole d’implantation d’électrodes (Figure 2)

1. Anesthésier les souris avec de l’isoflurane (2 % à 4 %) et les fixer dans un appareil stéréotaxique (voir Figure 2A, ~2 min). Utilisez une pommade oculaire sur les yeux de souris pour prévenir la sécheresse sous anesthésie. Appliquez de la lidocaïne sur la peau autour du périmètre de l’incision crânienne et une injection sous-cutanée de carprofène à une dose de 5 mg / kg.
   REMARQUE : Une anesthésie correcte est confirmée par l’absence de réflexe de redressement et la perte de réponse au pincement des orteils. Pour les interventions chirurgicales prolongées, l’utilisation d’un anesthésique injectable est plus appropriée.
2. Après avoir fixé l’animal dans l’appareil stéréotaxique, coupez le cuir chevelu le long du bord du crâne et essuyez la surface du crâne avec de l’alcool à 75 % pour exposer les positions du bregma et du lambda (voir Figure 2B, ~3 min).
   REMARQUE : L’intervention préopératoire comprend la coupe des cheveux, la désinfection du site chirurgical, la pré-stérilisation des instruments et des outils chirurgicaux.
3. Nivelez le cerveau et percez des trous (~0,8 mm) au-dessus des régions d’intérêt (ROI) à l’aide d’une microperceuse. Injectez les virus concernés à l’aide d’un pousse-seringue (voir Figure 2C - F, ~20 min).
   REMARQUE : Des informations détaillées sur les virus et les zones d’intérêt dans cette étude sont présentées dans la table des matériaux et la figure 3.
4. Tenez les optrodes avec un support et déplacez leur pointe jusqu’au point de brégma, en réglant cette position sur « zéro ». En utilisant le point bregma comme coordonnée de référence, déplacez les optrodes vers les régions cibles (voir Figure 2G, ~3 min). Placez les optrodes à 0,3 mm au-dessus du site d’injection du virus.
   REMARQUE : Dans la stratégie d’implantation verticale, la distance minimale entre les deux électrodes est d’environ 2 mm, en fonction de l’épaisseur du manchon de fibre optique et du diamètre extérieur de la virole. Une méthode d’insertion angulaire peut être utilisée pour l’enregistrement simultané à partir de régions proches de l’image.
5. Après avoir inséré les fibres optiques dans les zones cérébrales correspondantes, appliquez une petite quantité d’adhésif tissulaire autour d’elles pour couvrir les tissus exposés. Ensuite, appliquez séquentiellement de l’adhésif supplémentaire et un peu de ciment dentaire. Une fois que le ciment dentaire s’est solidifié, relâchez le support avec précaution (voir Figure 2H, ~5 min).
6. Avant chaque nouvelle implantation d’optrode, effectuez un recalibrage, ce qui implique de répéter l’étape 2.4 (voir Figure 2I).
   REMARQUE : Pour chaque implantation, positionnez l’optrode au niveau de bregma comme le point « zéro ».
7. Après avoir implanté tous les optrodes, percez les trous derrière le point lambda pour 'Ground' et au-dessus du néocortex pour 'EEG' à l’aide d’une microdrill (~1 min).
   REMARQUE : La taille du trou percé (~1,1 mm) doit correspondre au diamètre de la vis.
8. Insérez les vis crâniennes dans le trou au-dessus du cortex et derrière le point lambda (voir Figure 2J, ~5 min).
   REMARQUE : Les vis crâniennes sont utilisées pour l’enregistrement EEG et la mise à la terre, respectivement.
9. Organisez les fils de tungstène et les fils émaillés de manière à ce qu’ils soient positionnés au-dessus de la zone d’implantation et non exposés à l’extérieur du crâne. Fixez la position du connecteur femelle à l’aide d’un support (voir Figure 2K, ~2 min).
10. Remplissez le site d’implantation avec du ciment dentaire pour assurer une connexion stable entre le dispositif d’électrode et le crâne. Encapsulez les fils internes, en laissant les trous d’insertion du connecteur femelle exposés pour la connexion à la tête (voir Figure 2L, ~6 min).
11. Après le durcissement du ciment dentaire, appliquez de l’iode sur la peau autour du pourtour du cuir chevelu exposé, puis placez l’animal sur un coussin chauffant (~1 min).
    REMARQUE : Assurez-vous que l’animal n’est pas laissé sans surveillance jusqu’à ce qu’il ait repris une conscience suffisante pour maintenir le décubitus sternal. Des conditions stériles doivent être maintenues tout au long de la chirurgie de survie.
12. Administrer des antibiotiques et des analgésiques pour favoriser la récupération post-chirurgicale.
    REMARQUE : Les animaux qui ont subi une intervention chirurgicale ne sont pas réintroduits dans la compagnie d’autres animaux tant qu’ils ne sont pas complètement rétablis. Les animaux ont reçu des injections intrapéritonéales de ceftriaxone sodique (180 mg/kg) et des injections sous-cutanées de carprofène (5 mg/kg), et du gel de lidocaïne a été appliqué quotidiennement sur les plaies chirurgicales pendant 3 jours. Les animaux doivent survivre pendant une période déterminée pour terminer les tests comportementaux. Par la suite, ils seront euthanasiés à l’aide de 4 à 5 % d’isoflurane, suivis d’une perfusion et d’une section tissulaire pour évaluer l’infection virale et les sites d’implantation des électrodes.

3. Protocole d’enregistrement du cerveau in vivo

1. Avant d’effectuer l’enregistrement du signal et les tests comportementaux (test en plein champ)¹⁵, assurez-vous que la souris subit une période de manipulation douce de 3 jours pour l’acclimater à l’environnement.
   REMARQUE : Dans cette étude, les souris ont été placées dans un champ ouvert (42 cm × 42 cm) pour se déplacer librement, ce qui nous a permis d’observer leur comportement de crise.
2. Après avoir anesthésié les souris avec de l’isoflurane (2%-4%), connectez les fibres optiques séquentiellement dans l’ordre du site d’enregistrement avant d’insérer la scène.
3. Réglez l’impulsion lumineuse de 635 nm avec un rapport cyclique de 10 % à 20 Hz. Réglez la stimulation lumineuse sur 10 s (200 impulsions) pendant l’enregistrement. Réglez l’intensité aux extrémités de la fibre optique à 3 mW.
4. Utilisez un système de photométrie à fibre pour enregistrer la période de test comportemental des signaux Gcamp6m à une fréquence d’échantillonnage de 30 Hz par un canal LED de 470 nm.
5. Enregistrez simultanément les signaux calciques, les LFP et l’EEG sous stimulation optogénétique, ainsi que les performances comportementales correspondantes (voir Figure 3).
6. Utilisez le marquage de synchronisation du signal TTL (Transistor-Transistor Logic) pour garantir la cohérence temporelle des données enregistrées.

4. Traitement des données

1. Chargez des données photométriques dans le logiciel MATLAB. Ensuite, utilisez le codage personnalisé (fichier supplémentaire 1) pour démouler le signal calcique.
2. Définir les variations de l’intensité de fluorescence à l’aide de l’équation (1) :
   ΔF/F = (F_t - F₀)/ F₀ (1)
   Où F_t représente les valeurs de fluorescence du signal calcique en temps réel, et F₀ désigne l’intensité de fluorescence de base moyenne avant l’événement.
3. Importez les données électrophysiologiques, à une fréquence d’échantillonnage de 1000 Hz, dans MATLAB (Fichier supplémentaire 2).
4. Coordonner l’affichage de la signalisation calcique et des données électrophysiologiques en alignement avec des marqueurs synchronisés.

Résultats

Nous avons combiné l’optogénétique avec l’enregistrement électrophysiologique multirégional et l’imagerie calcique pour observer l’activité neuronale dans diverses régions du cerveau pendant les crises optogénétiques. Dans ce but, un virus adéno-associé (AAV) exprimant ChrimsonR sous le contrôle du promoteur CaMKIIα (AAV-CaMKIIα-ChrimsonR-mcherry)¹⁶ a été injecté dans un site épileptogène classique, le cortex piriforme (ROI 1)

Discussion

Ici, nous avons utilisé un appareil optrode fabriqué par nos soins pour l’enregistrement de signaux neuronaux in vivo dans plusieurs régions. La faisabilité de ce système pour la stimulation optogénétique, l’enregistrement du signal calcique et l’enregistrement électrophysiologique simultanés a été validée. La méthode de préparation des électrodes décrite dans le présent document est efficace et rentable. Selon la conception expérimentale, nous avons pu e...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
8-32 adapter	Plexon	Custom ordered	Connect the female connector and headstage
AAV-CaMKIIα-ChrimsonR-mcherry	Taitool Bioscience	S0371-9	4 x 1012 VG/mL
AAV-hsyn-Gcamp6m	Taitool Bioscience	S0471-9	4 x 1012 VG/mL
DAPI	Sigma	236276	Titered 1:500
Dental Cement	New Century Dental	430205
Electrophysiological recordings system	Plexon	Omniplex
Enameled wire	N/A	Custom ordered	Diameter = 0.2 mm
Female connector	N/A	Custom ordered	1.25 mm pitch
Glue	Loctite	45282
Laser	Changchun New Industries	BH81563	635 nm
MATLAB	MathWorks	R2021b
Microdrill	RWD	78001
Multichannel fiber photometry	ThinkerTech	FPS-SS-MC-LED
Optical fiber	Xi'an Bogao	L-200UM	Select the appropriate fiber length based on the depth of the targeted brain regions.
PFA-Coated Tungsten wire	A-M System	795500	Bare 0.002"; Coated 0.0040"
Power meter	Thorlabs	PM100D
Stereotaxic Fxrame	RWD	68807
Tissue adhesive	3M	1469SB