Eine integrierte Methode zur Herstellung flexibler und komfortabler elektrophysiologischer Optroden für die In-vivo-Aufzeichnung in mehreren Regionen

Zusammenfassung

Wir haben einen vereinfachten und kostengünstigen Ansatz für die Elektrodenherstellung entwickelt und Aufzeichnungen von Signalen über mehrere Regionen hinweg in frei beweglichen Mäusen durchgeführt. Die Verwendung der Optogenetik in Verbindung mit der Multiregionen-Elektrophysiologie und der Kalziumsignalaufzeichnung ermöglichte die Aufdeckung neuronaler Aktivitäten über Regionen hinweg im Anfallskindling-Modell.

Zusammenfassung

Epilepsie ist eine neurologische Störung, die durch synchronisierte abnormale Entladungen gekennzeichnet ist, an denen mehrere Gehirnregionen beteiligt sind. Fokale Läsionen erleichtern die Ausbreitung epileptischer Signale durch assoziierte neuronale Schaltkreise. Daher ist die in vivo Aufzeichnung des lokalen Feldpotentials (LFP) aus den kritischen Hirnregionen unerlässlich, um die Schaltkreise zu entschlüsseln, die an der Anfallsausbreitung beteiligt sind. Den derzeitigen Methoden zur Elektrodenherstellung und -implantation mangelt es jedoch an Flexibilität. Hier stellen wir ein handliches Gerät vor, das für elektrophysiologische Aufzeichnungen (LFPs und Elektroenzephalographie [EEG]) über mehrere Regionen hinweg konzipiert wurde. Darüber hinaus haben wir die optogenetische Manipulation und die Aufzeichnung von Kalziumsignalen nahtlos mit der LFP-Aufzeichnung integriert. Robuste Nachentladungen wurden während epileptischer Anfälle in mehreren verschiedenen Regionen beobachtet, begleitet von einer zunehmenden Kalziumsignalisierung. Der in dieser Studie verwendete Ansatz bietet eine bequeme und flexible Strategie für synchrone neuronale Aufzeichnungen über verschiedene Regionen des Gehirns hinweg. Es birgt das Potenzial, die Forschung zu neurologischen Erkrankungen voranzutreiben, indem es Einblicke in die neuronalen Profile mehrerer Regionen bietet, die an diesen Erkrankungen beteiligt sind.

Einleitung

Epilepsie ist eine häufige neurologische Erkrankung, die durch wiederkehrende Anfälle gekennzeichnet ist, die sich als Krämpfe, Sensibilitätsstörungen und Bewusstlosigkeit äußern¹. Die pathophysiologischen Mechanismen, die der Epilepsie zugrunde liegen, sind komplex und betreffen mehrere miteinander verbundene Hirnregionen ^2,3. Jüngste Fortschritte in der Neurobildgebung haben Licht auf die großräumigen Netzwerke geworfen, die an Epilepsie beteiligt sind ^4,5. Das Verständnis der komplizierten Schaltkreise und Netzwerkmechanismen, die der Entstehung und Ausbreitung von Epilepsie zugrunde liegen, ist jedoch nach wie vor begrenzt, was zum Teil auf die unzureichende Anwendung von multiregionalen neuronalen Aufzeichnungstechniken^{zurückzuführen ist 6}. Daher ist die Entwicklung einer flexiblen, integrierten Methode, die in der Lage ist, die neuronale Aktivität über unterschiedliche Gehirnregionen hinweg gleichzeitig zu überwachen, unerlässlich.

Elektrophysiologische Aufzeichnungen werden durchgeführt, um Anfälle zu erfassen und das Vorhandensein von Epilepsie^{zu bestimmen 7}. Abgesehen von der Aufzeichnung der elektrophysiologischen Aktivität wird in Epilepsiestudien zunehmend Wert auf die genaue Kalziumaktivität spezifischer neuronaler Populationen gelegt ^8,9. Fortschritte bei der Synthese von Kalziumindikatoren und verschiedenen Sondendesigns haben Forscher dazu veranlasst, die Faserphotometrie einzusetzen, um Veränderungen der neuronalen Aktivität und der neuronalen Substanzen im Gehirn zu erfassen^10,11. Die beiden unabhängigen Methoden zum Nachweis neuronaler Aktivität, nämlich die Elektrophysiologie und die Faserphotometrie-Aufzeichnung, ergänzen sich gegenseitig und ermöglichen ein umfassenderes Verständnis dynamischer neuronaler Prozesse.

Darüber hinaus sind die synchrone Aufzeichnung und Modulation der neuronalen Aktivität von entscheidender Bedeutung, um Einblicke in die Funktionsweise des Gehirns sowohl auf Netzwerk- als auch auf zellulärer Ebene zu gewinnen. Dieser Ansatz ermöglicht es Forschern, die komplexen Prozesse des Gehirns in Echtzeit zu beobachten und zu manipulieren. Die Optogenetik hat sich aufgrund ihrer ausgeprägten Fähigkeit zur selektiven Stimulation oder Hemmung zu einem unverzichtbaren Werkzeug für die Untersuchung der neuronalen Signalübertragung entwickelt¹². Trotz weit verbreiteter Anwendungen der elektrophysiologischen Aufzeichnung an mehreren Standorten in den Neurowissenschaften¹³ ist die Integration der elektrophysiologischen Aufzeichnung in mehreren Regionen mit Faserphotometrie und optogenetischer Manipulation nach wie vor begrenzt. Noch wichtiger ist, dass es den derzeitigen Methoden zur Herstellung und Implantation von Elektroden mit mehreren Regionen an Flexibilität mangelt¹⁴. Diese Einschränkungen behindern unsere Fähigkeit, spezifische Schaltkreisfunktionen und Wechselwirkungen über mehrere Regionen hinweg zu analysieren. Hier stellen wir einen kostengünstigen und praktischen multiregionalen In-vivo-Aufzeichnungsansatz vor, der Licht auf neuronale Prozesse in verschiedenen Regionen bei Kindling-induzierten Anfällen und anderen neuropsychiatrischen Erkrankungen wirft.

Protokoll

Dieses Protokoll wurde vom Animal Care and Use Committee der Fudan-Universität genehmigt und gemäß den Richtlinien und Vorschriften des National Institutes of Health Guide for Care and Use of Laboratory Animals durchgeführt. Es wurden alle möglichen Maßnahmen ergriffen, um die Anzahl der in dieser Studie verwendeten Tiere zu minimieren. Die Zeit, die für die Durchführung der einzelnen Schritte benötigt wird, ist in den jeweiligen Schritten enthalten.

1. Vorbereitung der Elektroden (Abbildung 1)

1. Schneiden Sie eine geeignete Länge des Wolframdrahtes (~20 mm) ab und brennen Sie die Isolationsschicht an einem Ende ab, um den Wolframdraht (1,6-2 mm) freizulegen. Biegen Sie das andere Ende des Drahtes in eine "L"-Form (siehe Abbildung 1A, ~1 min)
2. Platzieren Sie das "L"-Ende des Wolframdrahtes vorsichtig auf der optischen Faser (siehe Abbildung 1B, ~1 min).
   HINWEIS: Der Wolframdraht sollte 0,2 bis 0,4 mm länger sein als die Spitze der optischen Faser.
3. Tauchen Sie einen Tropfen Klebstoff ein und tragen Sie ihn auf die Schnittstelle zwischen der optischen Faser und dem Wolframdraht auf (siehe Abbildung 1C, ~1 min). Aufgrund der Oberflächenspannung der Flüssigkeit haftet der Wolframdraht an der optischen Faser.
4. Tragen Sie den Kleber einmal auf und lassen Sie ihn trocknen. Tragen Sie dann eine zweite Schicht auf. Dadurch wird die Verbindung zwischen dem Wolframdraht und der optischen Faser weiter gefestigt (siehe Abbildung 1C, ~1 min).
   HINWEIS: Während des Auftragens sollte darauf geachtet werden, dass der Klebstoff nicht an die Spitze der optischen Faser fließt, da dies die Durchlässigkeit beeinträchtigen kann.
5. Verwenden Sie an der Ecke der "L"-Form Klebstoff, um die Basis der optischen Faser und den Wolframdraht fest miteinander zu verbinden (~1 min).
   HINWEIS: Die vergrößerte Kontaktfläche und die sphärische Erstarrung des Klebetropfens sorgen für einen festen Verbund zwischen der optischen Faser und dem Wolframdraht.
6. Stellen Sie durch Löten eine Verbindung zwischen dem Wolframdraht und dem Stift der Buchse her (siehe Abbildung 1D, jeweils ~3 min)
   HINWEIS: Da Wolframdraht nicht hitzeempfindlich ist, kann die Erfolgsrate des Lötens durch eine Metallhülse, die durch Schneiden der Position des Stiftschlitzes geformt wird, auf nahezu 100 % erhöht werden, um die beiden Komponenten physisch zu vereinen. Anschließend sorgt das Befüllen der Hülse durch Lot für eine stabile Verbindung zwischen dem eingelegten Wolframdraht und dem Stift.
7. Löten Sie entsprechend dem Versuchsaufbau die erforderliche Anzahl von Optroden (siehe Abbildung 1E, ~10 min)
   HINWEIS: In dieser Studie wurden drei Optroden verwendet.
8. Schneiden Sie den Lackdraht auf die entsprechende Länge (~30 mm) ab und brennen Sie die Isolierung an beiden Enden ab. Wickeln Sie ein Ende des Lackdrahtes um den Fuß der Schraube und löten Sie ihn. Verbinden Sie das andere Ende des Lackdrahtes über einen Lötkolben mit den Pins der Buchse, die als EEG-Aufzeichnung und Masseverbindung für die Schädelelektrode dient (siehe Abbildung 1F, ~5 min)
   HINWEIS: Aufgrund der Flexibilität des Lackdrahtes ist es bequem, den Schädel und die Stifte der Buchse zu verbinden. Das Löten nach dem Aufwickeln des Lackdrahtes um eine Schraube ist zuverlässiger als das Oberflächenlöten.
9. Tragen Sie Schmelzklebstoff auf das Pin-Array der Buchse auf, um die Buchse zu verkapseln und sicherzustellen, dass die Lötstellen vollständig umhüllt sind. Während der Erstarrung des Schmelzklebstoffs den Klebstoff mit einer Kunststoffplatte formen, um die Platzbelegung während der Implantation zu minimieren (siehe Abbildung 1F, ~3 min)
   HINWEIS: Aufgrund der potenziellen Verbrennungsrisiken, die mit der Verwendung von Schmelzkleber verbunden sind, gilt AB-Klebstoff als sicherere Alternative.
10. Verwenden Sie als Nächstes ein Lichtintensitätsmessgerät und ein Digitalmultimeter, um Leuchtkraft und Leitfähigkeit zu messen. Nach Bestehen dieser Tests ist das Setup einsatzbereit (siehe Abbildung 1G, ~2 min)
    HINWEIS: Tragen Sie bei der Arbeit mit Lasern immer eine Schutzbrille, die für die jeweilige Wellenlänge und Leistung des Laserlichts geeignet ist. Hochwertige Fasern sind erforderlich, um mindestens 80 % des Lichts vom Ende des Patchkabels bis zur Spitze der implantierbaren Faser zu übertragen. Zusätzlich wurde der Widerstand von der Spitze des Wolframdrahtes bis zur Stiftleistenschlitz mit einem akzeptablen Bereich von 1-5 Ω gemessen.
11. Tauchen Sie die vorbereiteten Elektroden vor dem Gebrauch 15 Minuten lang in 75%igen Alkohol und geben Sie sie dann in sterile Kochsalzlösung (~16 min).
    HINWEIS: Das Gesamtgewicht der verkapselten Elektrode (0,6701 ± 0,01123 g, n = 4) hat keinen Einfluss auf die Aktivität der Mäuse. Die Elektroden werden vorab mittels Plasmasterilisation sterilisiert.

2. Protokoll für die Elektrodenimplantation (Abbildung 2)

1. Betäuben Sie die Mäuse mit Isofluran (2%-4%) und sichern Sie sie in einem stereotaktischen Apparat (siehe Abbildung 2A, ~2 min). Verwenden Sie Augensalbe auf den Augen der Maus, um Trockenheit während der Narkose zu verhindern. Tragen Sie Lidocain auf die Haut um den Umfang des Schädelschnitts auf und injizieren Sie Carprofen subkutan in einer Dosis von 5 mg/kg.
   HINWEIS: Die richtige Anästhesie wird durch das Fehlen des Aufrichtreflexes und den Verlust der Reaktion auf das Einklemmen der Zehen bestätigt. Bei längeren chirurgischen Eingriffen ist die Verwendung eines injizierbaren Anästhetikums besser geeignet.
2. Nachdem Sie das Tier in der stereotaktischen Apparatur gesichert haben, schneiden Sie die Kopfhaut entlang des Schädelrandes ab und wischen Sie die Schädeloberfläche mit 75%igem Alkohol ab, um die Positionen von Bregma und Lambda freizulegen (siehe Abbildung 2B, ~3 min).
   HINWEIS: Der präoperative Eingriff umfasst das Schneiden der Haare, die Desinfektion der Operationsstelle, die Vorsterilisation der Instrumente und chirurgischen Instrumente.
3. Nivellieren Sie das Gehirn und bohren Sie die Löcher (~0,8 mm) mit einem Mikrobohrer über die Regions of Interest (ROI). Injizieren Sie die relevanten Viren mit einer Spritzenpumpe (siehe Abbildung 2C - F, ~20 min).
   HINWEIS: Detaillierte Informationen zu den Viren und ROIs in dieser Studie sind in der Materialtabelle und in Abbildung 3 aufgeführt.
4. Halten Sie die Optroden mit einer Halterung fest und bewegen Sie ihre Spitze zum Bregma-Punkt, wobei Sie diese Position auf "Null" setzen. Mit dem Bregma-Punkt als Referenzkoordinate verschieben Sie die Optroden in die Zielregionen (siehe Abbildung 2G, ~3 min). Positionieren Sie die Optroden 0,3 mm über der Virusinjektionsstelle.
   HINWEIS: Bei der vertikalen Implantationsstrategie beträgt der Mindestabstand zwischen den beiden Elektroden ca. 2 mm, abhängig von der Dicke der faseroptischen Hülse und dem Außendurchmesser der Ferrule. Eine abgewinkelte Einfügemethode kann für die gleichzeitige Aufnahme aus nahe gelegenen Bereichen verwendet werden.
5. Nachdem Sie die optischen Fasern in die entsprechenden Hirnareale eingeführt haben, tragen Sie eine kleine Menge Gewebekleber um sie herum auf, um das freiliegende Gewebe zu bedecken. Tragen Sie dann nacheinander zusätzlichen Kleber und etwas Zahnzement auf. Nachdem der Zahnzement erstarrt ist, lösen Sie den Halter vorsichtig (siehe Abbildung 2H, ~5 min).
6. Vor jeder neuen Optrode-Implantation ist eine Rekalibrierung durchzuführen, bei der Schritt 2.4 wiederholt wird (siehe Abbildung 2I).
   HINWEIS: Bei jeder Implantation ist die optrode am Bregma als Nullpunkt zu positionieren.
7. Nach der Implantation aller Optroden werden die Löcher hinter dem Lambdapunkt für "Ground" und oberhalb des Neokortex für "EEG" mit einem Mikrobohrer (~1 min) gebohrt.
   HINWEIS: Die Größe des Bohrlochs (~1,1 mm) muss mit dem Durchmesser der Schraube übereinstimmen.
8. Setzen Sie Schädelschrauben in das Loch oberhalb des Kortex und hinter dem Lambdapunkt ein (siehe Abbildung 2J, ~5 min).
   HINWEIS: Schädelschrauben werden für die EEG-Aufzeichnung bzw. die Erdung verwendet.
9. Ordnen Sie die Wolframdrähte und Lackdrähte so an, dass sie über dem Implantationsbereich positioniert sind und nicht außerhalb des Schädels freiliegen. Sichern Sie die Position der Buchse mit einer Halterung (siehe Abbildung 2K, ~2 min).
10. Füllen Sie die Implantationsstelle mit Zahnzement, um eine stabile Verbindung zwischen der Elektrode und dem Schädel zu gewährleisten. Verkapseln Sie die internen Drähte und lassen Sie die Einstecklöcher der Buchse für den Anschluss an den Kopftisch frei (siehe Abbildung 2L, ~6 min).
11. Tragen Sie nach dem Aushärten des Zahnzementes Jod auf die Haut um den Umfang der freiliegenden Kopfhaut auf und legen Sie das Tier dann auf ein wärmendes Kissen (~1 min).
    HINWEIS: Stellen Sie sicher, dass das Tier nicht unbeaufsichtigt gelassen wird, bis es wieder ausreichend Bewusstsein erlangt hat, um das Brustbein aufrecht zu erhalten. Während der gesamten Überlebensoperation sollten sterile Bedingungen eingehalten werden.
12. Verabreichen Sie Antibiotika und Analgetika, um die postoperative Genesung zu unterstützen.
    HINWEIS: Tiere, die operiert wurden, werden erst wieder in die Gesellschaft anderer Tiere eingeführt, wenn sie sich vollständig erholt haben. Den Tieren wurden intraperitoneale Injektionen von Ceftriaxon-Natrium (180 mg/kg) und subkutane Injektionen von Carprofen (5 mg/kg) verabreicht, und Lidocain-Gel wurde 3 Tage lang täglich auf die Operationswunden aufgetragen. Die Tiere müssen einen bestimmten Zeitraum überleben, um die Verhaltenstests abzuschließen. Anschließend werden sie mit 4 % bis 5 % Isofluran euthanasiert, gefolgt von Perfusion und Gewebeschnitten, um die Virusinfektion und die Stellen der Elektrodenimplantation zu beurteilen.

3. Protokoll zur Aufzeichnung des In-vivo-Gehirns

1. Stellen Sie vor der Signalaufzeichnung und Verhaltenstests (Freifeldtest)¹⁵ sicher, dass die Maus 3 Tage lang schonend behandelt wird, um sie an die Umgebung zu gewöhnen.
   HINWEIS: In dieser Studie wurden die Mäuse auf ein offenes Feld (42 cm × 42 cm) gesetzt, um sich frei zu bewegen, was uns ermöglichte, ihr Anfallsverhalten zu beobachten.
2. Nach der Betäubung der Mäuse mit Isofluran (2%-4%) verbinden Sie die optischen Fasern nacheinander in der Reihenfolge der Aufnahmestelle, bevor Sie den Kopftisch einsetzen.
3. Stellen Sie den Lichtimpuls von 635 nm mit einer Einschaltdauer von 10 % auf 20 Hz ein. Stellen Sie die Lichtstimulation während der Aufnahme auf 10 s (200 Impulse) ein. Stellen Sie die Intensität an den Glasfaserspitzen auf 3 mW ein.
4. Verwenden Sie ein Faserphotometriesystem, um den Verhaltenstestzeitraum von Gcamp6m-Signalen mit einer Abtastrate von 30 Hz x 470 nm LED-Kanal aufzuzeichnen.
5. Erfassen Sie gleichzeitig Kalziumsignale, LFPs und EEG unter optogenetischer Stimulation sowie entsprechende Verhaltensleistungen (siehe Abbildung 3).
6. Verwenden Sie TTL-Signalsynchronisations-Tagging (Transistor-Transistor-Logik), um die zeitliche Konsistenz der aufgezeichneten Daten sicherzustellen.

4. Datenverarbeitung

1. Laden Sie Photometriedaten in die MATLAB-Software. Verwenden Sie dann eine benutzerdefinierte Codierung (Ergänzende Datei 1), um den Trend des Kalziumsignals zu verringern.
2. Definieren Sie die Änderungen der Fluoreszenzintensität mit Gleichung (1):
   ΔF/F = (F_t - F₀)/ F₀ (1)
   Dabei steht_{F t} für die Echtzeit-Fluoreszenzwerte des Kalziumsignals und F₀ für die gemittelte Fluoreszenzintensität der Basislinie vor dem Ereignis.
3. Importieren Sie die elektrophysiologischen Daten, mit einer Abtastrate von 1000 Hz, in MATLAB (Ergänzende Datei 2).
4. Koordinieren Sie die Anzeige von Kalziumsignalen und elektrophysiologischen Daten in Übereinstimmung mit synchronisierten Markern.

Ergebnisse

Wir kombinierten Optogenetik mit multiregionaler elektrophysiologischer Aufzeichnung und Kalziumbildgebung, um die neuronale Aktivität in verschiedenen Hirnregionen während optogenetischer Anfälle zu beobachten. Zu diesem Zweck wurde ein Adeno-assoziiertes Virus (AAV), das ChrimsonR unter der Kontrolle des CaMKIIα-Promotors (AAV-CaMKIIα-ChrimsonR-mcherry)¹⁶ exprimiert, in Nagetieren in eine klassische epileptogene Stelle, den piriformen Kortex (ROI 1)

Diskussion

Hier haben wir ein selbstgebautes optrode-Gerät zur in vivo neuronalen Signalaufzeichnung über mehrere Regionen hinweg eingesetzt. Die Machbarkeit dieses Systems für die gleichzeitige optogenetische Stimulation, Kalziumsignalaufzeichnung und elektrophysiologische Aufzeichnung wurde validiert. Das hierin beschriebene Elektrodenvorbereitungsverfahren ist effizient und kostengünstig. Dem Versuchsdesign zufolge konnten wir Signale aus relevanten Hirnregionen aufzeichnen. Die str...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
8-32 adapter	Plexon	Custom ordered	Connect the female connector and headstage
AAV-CaMKIIα-ChrimsonR-mcherry	Taitool Bioscience	S0371-9	4 x 1012 VG/mL
AAV-hsyn-Gcamp6m	Taitool Bioscience	S0471-9	4 x 1012 VG/mL
DAPI	Sigma	236276	Titered 1:500
Dental Cement	New Century Dental	430205
Electrophysiological recordings system	Plexon	Omniplex
Enameled wire	N/A	Custom ordered	Diameter = 0.2 mm
Female connector	N/A	Custom ordered	1.25 mm pitch
Glue	Loctite	45282
Laser	Changchun New Industries	BH81563	635 nm
MATLAB	MathWorks	R2021b
Microdrill	RWD	78001
Multichannel fiber photometry	ThinkerTech	FPS-SS-MC-LED
Optical fiber	Xi'an Bogao	L-200UM	Select the appropriate fiber length based on the depth of the targeted brain regions.
PFA-Coated Tungsten wire	A-M System	795500	Bare 0.002"; Coated 0.0040"
Power meter	Thorlabs	PM100D
Stereotaxic Fxrame	RWD	68807
Tissue adhesive	3M	1469SB