שיטה משולבת ליצירת אופטרודים אלקטרופיזיולוגיים גמישים ונוחים להקלטה רב-אזורית in vivo

Summary

פיתחנו גישה פשוטה וחסכונית לייצור אלקטרודות וערכנו הקלטות של אותות באזורים מרובים בעכברים הנעים בחופשיות. שימוש באופטוגנטיקה, לצד אלקטרופיזיולוגיה רב-אזורית ורישום אותות סידן, איפשר גילוי של פעילויות עצביות באזורים שונים במודל הצתת ההתקפים.

Abstract

אפילפסיה היא הפרעה נוירולוגית המאופיינת בהפרשות חריגות מסונכרנות המערבות אזורי מוח מרובים. נגעים מוקדיים מאפשרים התפשטות של אותות אפילפטיים דרך מעגלים עצביים קשורים. לכן, רישום in vivo של פוטנציאל שדה מקומי (LFP) מאזורי המוח הקריטיים חיוני לפענוח המעגלים המעורבים בהתפשטות התקפים. עם זאת, השיטות הנוכחיות לייצור אלקטרודות והשתלתן חסרות גמישות. כאן, אנו מציגים מכשיר שימושי המיועד לרישומים אלקטרופיזיולוגיים (LFPs ואלקטרואנצפלוגרפיה [EEG]) באזורים מרובים. בנוסף, שילבנו בצורה חלקה מניפולציה אופטוגנטית ורישום איתות סידן עם רישום LFP. הפרשות חזקות לאחר מכן נצפו במספר אזורים נפרדים במהלך התקפים אפילפטיים, מלווים באיתות סידן מוגבר. הגישה המשמשת במחקר זה מציעה אסטרטגיה נוחה וגמישה להקלטות עצביות סינכרוניות באזורים שונים במוח. הוא טומן בחובו פוטנציאל לקידום המחקר על הפרעות נוירולוגיות על ידי מתן תובנות לגבי הפרופילים העצביים של אזורים מרובים המעורבים בהפרעות אלה.

Introduction

אפילפסיה היא מצב נוירולוגי שכיח המאופיין בהתקפים חוזרים, המתבטאים בעוויתות, הפרעות חושיות ואובדן הכרה¹. המנגנונים הפתופיזיולוגיים העומדים בבסיס האפילפסיה מורכבים וכוללים אזורי מוח מרובים המחוברים זה לזה ^2,3. ההתקדמות האחרונה בדימות מוחי שפכה אור על רשתות בקנה מידה גדול המעורבות באפילפסיה ^4,5. עם זאת, ההבנה של המעגלים החשמליים ומנגנוני הרשת המורכבים העומדים בבסיס הייצור וההפצה של אפילפסיה נותרה מוגבלת, בין היתר בשל יישום לא מספיק של טכניקות רישום עצבי רב-אזורי⁶. לכן, פיתוח....

Protocol

פרוטוקול זה קיבל את אישור הוועדה לטיפול ושימוש בבעלי חיים באוניברסיטת פודאן ונערך בהתאם להנחיות ולתקנות שעוצבו על ידי מדריך המכונים הלאומיים לבריאות לטיפול ושימוש בחיות מעבדה. כל האמצעים האפשריים יושמו כדי למזער את מספר בעלי החיים שנוצלו במחקר זה. הזמן הדרוש לביצוע כל שלב נכלל בשלבים המתאימים.

1. הכנת אלקטרודות (איור 1)

1. חותכים אורך מתאים של חוט טונגסטן (~ 20 מ"מ) ושורפים את שכבת הבידוד בקצה אחד כדי לחשוף את חוט הטונגסטן (1.6-2 מ"מ). כופפו את הקצה השני של החוט לצורת "L" (ראו איור 1A, ~1 דקות)
2. הני....

תוצאות

שילבנו אופטוגנטיקה עם רישום אלקטרופיזיולוגי רב-אזורי והדמיית סידן כדי לצפות בפעילות העצבית באזורים שונים במוח במהלך התקפים אופטוגנטיים. למטרה זו, וירוס הקשור לאדנו (AAV) המבטא ChrimsonR תחת שליטתו של מקדם CaMKIIα (AAV-CaMKIIα-ChrimsonR-mcherry)¹⁶ הוזרק לאתר אפילפטוגני קלאסי, קליפ.......

Discussion

כאן, השתמשנו במכשיר optrode מתוצרת עצמית עבור הקלטת אותות עצביים in vivo על פני אזורים מרובים. ההיתכנות של מערכת זו לגירוי אופטוגנטי סימולטני, רישום אות סידן ורישום אלקטרופיזיולוגי אומתה. שיטת הכנת האלקטרודות המתוארת כאן היא יעילה וחסכונית. על פי תכנון הניסוי, אנו יכולים ?.......

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
8-32 adapter	Plexon	Custom ordered	Connect the female connector and headstage
AAV-CaMKIIα-ChrimsonR-mcherry	Taitool Bioscience	S0371-9	4 x 1012 VG/mL
AAV-hsyn-Gcamp6m	Taitool Bioscience	S0471-9	4 x 1012 VG/mL
DAPI	Sigma	236276	Titered 1:500
Dental Cement	New Century Dental	430205
Electrophysiological recordings system	Plexon	Omniplex
Enameled wire	N/A	Custom ordered	Diameter = 0.2 mm
Female connector	N/A	Custom ordered	1.25 mm pitch
Glue	Loctite	45282
Laser	Changchun New Industries	BH81563	635 nm
MATLAB	MathWorks	R2021b
Microdrill	RWD	78001
Multichannel fiber photometry	ThinkerTech	FPS-SS-MC-LED
Optical fiber	Xi'an Bogao	L-200UM	Select the appropriate fiber length based on the depth of the targeted brain regions.
PFA-Coated Tungsten wire	A-M System	795500	Bare 0.002"; Coated 0.0040"
Power meter	Thorlabs	PM100D
Stereotaxic Fxrame	RWD	68807
Tissue adhesive	3M	1469SB