Multi-Region In vivo Recording을 위한 유연하고 편리한 전기생리학적 Optrodes를 제작하기 위한 통합 방법

요약

우리는 전극 제조를 위한 간단하고 비용 효율적인 접근 방식을 개발했으며 자유롭게 움직이는 마우스에서 여러 영역에 걸쳐 신호를 기록했습니다. 다중 지역 전기 생리학 및 칼슘 신호 기록과 함께 광유전학을 활용하면 발작 점화 모델에서 여러 지역의 신경 활동을 밝힐 수 있었습니다.

초록

간질은 여러 뇌 영역과 관련된 동기화된 비정상 방전을 특징으로 하는 신경 장애입니다. 국소 병변은 관련 신경 회로를 통해 간질 신호의 전파를 촉진합니다. 따라서 중요한 뇌 영역의 국소 전위(LFP)를 생체 내에서 기록하는 것은 발작 전파와 관련된 회로를 해독하는 데 필수적입니다. 그러나 현재의 전극 제조 및 주입 방법은 유연성이 부족합니다. 여기에서는 여러 지역에서 전기생리학적 기록(LFP 및 뇌파[EEG])을 위해 설계된 편리한 장치를 소개합니다. 또한 광유전학적 조작 및 칼슘 신호 기록을 LFP 기록과 원활하게 통합했습니다. 간질 발작 동안 여러 개별 영역에서 강력한 배출 후 방출이 관찰되었으며, 칼슘 신호 전달이 증가했습니다. 이 연구에서 사용된 접근 방식은 뇌의 다양한 영역에서 동기 신경 기록을 위한 편리하고 유연한 전략을 제공합니다. 이는 신경 장애와 관련된 여러 영역의 신경 프로필에 대한 통찰력을 제공함으로써 신경 장애에 대한 연구를 발전시킬 수 있는 잠재력을 가지고 있습니다.

서문

간질은 경련, 감각 장애, 의식 상실로 나타나는 반복적인 발작을 특징으로 하는 흔한 신경학적 상태이다¹. 간질의 기저에 있는 병태생리학적 기전은 복잡하며 여러 개의 상호 연결된 뇌 영역을 포함한다 ^2,3. 최근 신경영상학의 발전은 뇌전증 ^4,5에 관여하는 대규모 네트워크에 대한 실마리를 제공했다. 그러나 간질의 생성과 전파의 기저에 있는 복잡한 회로와 네트워크 메커니즘에 대한 이해는 여전히 제한적인 상태로 남아 있으며, 이는 부분적으로는 다중 지역 신경 기록 기법의 불충분한 적용에 기인한다⁶. 따라서 서로 다른 뇌 영역에서 신경 활동을 동시에 모니터링할 수 있는 유연하고 통합된 방법을 개발하는 것이 필수적입니다.

발작을 포착하고 간질의 존재를 확인하기 위해 전기생리학적 기록이 수행된다⁷. 전기생리학적 활동을 기록하는 것을 제외하고, 간질 연구에서 특정 신경 집단의 정확한 칼슘 활성에 대한 강조가 증가하고 있다 ^8,9. 칼슘 지시자 합성 및 다양한 프로브 설계의 발전으로 인해 연구자들은 뇌 내 신경 활동 및 신경 물질의 변화를 포착하기 위해 섬유 측광법을 채택하게 되었습니다^10,11. 신경 세포 활동을 감지하는 두 가지 독립적인 방법, 즉 전기 생리학과 광섬유 측광 기록은 서로를 보완하여 동적 신경 세포 과정에 대한 보다 포괄적인 이해를 용이하게 합니다.

또한 동기 기록 및 신경 활동 조절은 네트워크 및 세포 수준 모두에서 뇌 기능에 대한 통찰력을 얻는 데 중추적인 역할을 합니다. 이 접근 방식을 통해 연구원들은 뇌의 복잡한 과정을 실시간으로 관찰하고 조작할 수 있습니다. 광유전학(Optogenetics)은 선택적 자극 또는 억제에 대한 독특한 능력 때문에 신경 신호전달을 조사하는 데 없어서는 안 될 도구로 부상했다¹². 신경과학 분야에서 다중 부위 전기생리학적 기록이 널리 적용되고 있음에도 불구하고¹³, 섬유 광도계 및 광유전학적 조작과 다중 지역 전기생리학적 기록의 통합은 여전히 제한적이다. 더 중요한 것은, 다지역 전극을 제작하고 이식하는 현재의 방법은 유연성이 부족하다는 것이다¹⁴. 이러한 한계는 여러 지역에 걸쳐 특정 회로 기능과 상호 작용을 분석하는 능력을 방해합니다. 여기에서는 점화 유발 발작 및 기타 신경 정신 장애에서 지역 간 신경 과정을 조명하는 비용 효율적이고 편리한 다중 지역 in vivo 기록 접근 방식을 제시합니다.

프로토콜

이 프로토콜은 Fudan University의 Animal Care and Use Committee의 승인을 받았으며 National Institutes of Health Guide for Care and Use of Laboratory Animals에서 고안한 지침 및 규정에 따라 수행되었습니다. 이 연구에서 사용된 동물의 수를 최소화하기 위해 가능한 모든 조치를 취했습니다. 각 단계를 수행하는 데 필요한 시간은 해당 단계에 포함됩니다.

1. 전극 준비(그림 1)

1. 적절한 길이의 텅스텐 와이어 (~ 20mm)를 자르고 한쪽 끝의 절연층을 태워 텅스텐 와이어 (1.6-2mm)를 노출시킵니다. 와이어의 다른 쪽 끝을 "L" 모양으로 구부립니다( 그림 1A, ~1분 참조).
2. 텅스텐 와이어의 "L"끝을 광섬유에 조심스럽게 놓습니다 ( 그림 1B, ~ 1 분 참조).
   참고 : 텅스텐 와이어는 광섬유 끝보다 0.2-0.4mm 길어야합니다.
3. 접착제 한 방울을 담그고 광섬유와 텅스텐 와이어의 계면에 바릅니다( 그림 1C, ~1분 참조). 액체의 표면 장력으로 인해 텅스텐 와이어가 광섬유에 부착됩니다.
4. 접착제를 한 번 바르고 건조시키십시오. 그런 다음 두 번째 코팅을 적용합니다. 이렇게하면 텅스텐 와이어와 광섬유 사이의 결합이 더욱 강화됩니다 ( 그림 1C, ~ 1 분 참조).
   알림: 적용 과정에서 접착제가 광섬유 끝으로 흐르지 않도록 주의해야 합니다., 투과율에 영향을 미칠 수 있으므로.
5. "L"모양의 모서리에서 접착제를 사용하여 광섬유베이스와 텅스텐 와이어를 단단히 결합합니다 (~ 1 분).
   참고 : 증가 된 접촉 면적과 접착 방울의 구형 응고는 광섬유와 텅스텐 와이어 사이의 견고한 결합을 보장합니다.
6. 납땜을 사용하여 텅스텐 와이어와 암 커넥터의 핀을 연결합니다 ( 그림 1D 참조, 각각에 대해 ~ 3 분)
   참고 : 텅스텐 와이어는 열에 민감하지 않기 때문에, 물리적으로 두 구성 요소를 결합하기 위해 핀 슬롯 위치를 절단하여 만든 금속 슬리브에 의해 납땜의 성공률을 거의 100 %까지 높일 수 있습니다. 그 후, 슬리브를 채우는 솔더는 삽입 된 텅스텐 와이어와 핀 사이의 안정적인 연결을 보장합니다.
7. 실험 설계에 따라 필요한 수의 옵트로드를 납땜합니다( 그림 1E, ~10분 참조).
   참고: 이 연구에서는 세 가지 옵트로드가 사용되었습니다.
8. 에나멜 와이어를 적절한 길이(~30mm)로 자르고 양쪽 끝의 절연체를 태웁니다. 에나멜 와이어의 한쪽 끝을 나사 바닥에 감고 납땜합니다. 두개골 전극의 EEG 기록 및 접지 연결 역할을 하는 납땜 인두를 통해 에나멜 와이어의 다른 쪽 끝을 암 커넥터의 핀에 연결합니다( 그림 1F, ~5분 참조).
   알림: 에나멜 와이어의 유연성으로 인해 두개골과 암 커넥터의 핀을 연결하는 것이 편리합니다. 나사 주위에 에나멜 와이어를 감은 후 납땜하는 표면 실장 납땜보다 신뢰할 수 있습니다.
9. 암 커넥터의 핀 어레이에 핫멜트 접착제를 도포하여 암 커넥터를 캡슐화하고 솔더 조인트가 완전히 감싸졌는지 확인합니다. 핫멜트 접착제를 응고하는 동안 주입 중 공간 점유를 최소화하기 위해 플라스틱 보드를 사용하여 접착제를 성형합니다( 그림 1F, ~3분 참조).
   알림: 핫멜트 접착제 사용과 관련된 잠재적인 화상 위험으로 인해 AB 접착제가 더 안전한 대안으로 간주됩니다.
10. 다음으로, 광도계와 디지털 멀티미터를 사용하여 광도와 전도도를 측정합니다. 이 테스트를 통과하면 설정을 사용할 준비가 된 것입니다( 그림 1G, ~2분 참조).
    알림: 레이저로 작업할 때는 항상 레이저 광의 특정 파장과 출력에 적합한 보호 안경을 착용하십시오. 패치 코드 끝에서 이식 가능한 섬유의 끝까지 빛의 최소 80%를 투과시키려면 고품질 섬유가 필요합니다. 또한, 텅스텐 와이어의 끝에서 핀 헤더 슬롯까지의 저항은 1-5 Ω의 허용 범위로 측정되었습니다.
11. 사용하기 전에 준비된 전극을 75% 알코올에 15분 동안 담근 다음 멸균 식염수(~16분)로 옮깁니다.
    참고: 캡슐화된 전극 장치의 총 중량(0.6701 ± 0.01123g, n = 4)은 마우스의 활성에 영향을 미치지 않습니다. 전극은 플라즈마 멸균을 사용하여 미리 멸균됩니다.

2. 전극 이식을 위한 프로토콜(그림 2)

1. 이소플루란(2%-4%)으로 마우스를 마취하고 입체 장치에 고정합니다( 그림 2A, ~2분 참조). 마취 상태에서 건조함을 방지하기 위해 쥐 눈에 눈 연고를 사용하십시오. 두개골 절개 부위 주변 피부에 리도카인을 바르고 5mg/kg의 용량으로 카프로펜을 피하 주사합니다.
   참고: 적절한 마취는 오른쪽 반사의 부재와 발가락 꼬집음에 대한 반응 상실을 통해 확인됩니다. 장시간 수술의 경우 주사용 마취제를 사용하는 것이 더 적합합니다.
2. 동물을 입체 장치에 고정한 후 두개골 가장자리를 따라 두피를 자르고 두개골 표면을 75% 알코올로 닦아 브레그마와 람다의 위치를 노출시킵니다( 그림 2B, ~3분 참조).
   참고: 수술 전 절차에는 머리 깎기, 수술 부위 소독, 기구 및 수술 도구 사전 소독이 포함됩니다.
3. 브레인을 평평하게 하고 마이크로드릴을 사용하여 관심 영역(ROI) 위로 구멍(~0.8mm)을 뚫습니다. 주사기 펌프로 관련 바이러스를 주입합니다( 그림 2C - F, ~20분 참조).
   참고: 이 연구의 바이러스 및 ROI에 대한 자세한 정보는 재료 표 와 그림 3에 나와 있습니다.
4. 홀더로 옵트로데를 잡고 팁을 브레그마 점으로 이동하여 이 위치를 '0'으로 설정합니다. bregma 점을 참조 좌표로 사용하여 optrodes를 대상 영역으로 이동합니다( 그림 2G, ~3분 참조). 옵트로드를 바이러스 주입 부위에서 0.3mm 위에 위치시킵니다.
   참고: 수직 주입 전략에서 두 전극 사이의 최소 거리는 광섬유 슬리브의 두께와 페룰의 외경에 따라 약 2mm입니다. 앵글 삽입 방법을 사용하여 가까운 위치에서 동시에 기록할 수 있습니다.
5. 해당 뇌 부위에 시신경을 삽입한 후 노출된 조직을 덮기 위해 그 주위에 소량의 조직 접착제를 도포합니다. 그런 다음 추가 접착제와 약간의 치과용 시멘트를 순차적으로 바릅니다. 치과용 시멘트가 응고된 후 홀더를 조심스럽게 풉니다( 그림 2H, ~5분 참조).
6. 각각의 새로운 옵트로드 주입 전에 2.4단계를 반복하는 재보정을 수행합니다( 그림 2I 참조).
   참고: 각 이식에 대해 bregma의 otrode를 '영점'으로 배치합니다.
7. 모든 옵트로를 이식한 후 마이크로드릴을 사용하여 'Ground'의 람다 포인트 뒤와 'EEG'의 신피질 위에 구멍을 뚫습니다(~1분).
   알림: 뚫린 구멍의 크기(~1.1mm)는 나사의 직경과 일치해야 합니다.
8. 두개골 나사를 피질 위와 람다 포인트 뒤의 구멍에 삽입합니다( 그림 2J, ~5분 참조).
   알림: 두개골 나사는 각각 EEG 기록 및 접지에 사용됩니다.
9. 텅스텐 와이어와 에나멜 와이어를 정리하여 이식 부위 위에 위치하고 두개골 외부로 노출되지 않도록 합니다. 홀더를 사용하여 암 커넥터의 위치를 고정합니다( 그림 2K, ~2분 참조).
10. 전극 장치와 두개골 사이의 안정적인 연결을 보장하기 위해 이식 부위를 치과용 시멘트로 채웁니다. 헤드s에 연결하기 위해 암 커넥터의 삽입 구멍을 노출시킨 상태로 내부 와이어를 캡슐화합니다.tage( 그림 2L, ~6분 참조).
11. 치과용 시멘트 경화 후 노출된 두피 둘레 피부에 요오드를 도포한 다음 동물을 보온 패드에 올려 놓습니다(~1분).
    알림: 동물이 흉골 누운 상태를 유지하기에 충분한 의식을 회복할 때까지 동물을 방치하지 않도록 하십시오. 생존 수술 내내 멸균 상태를 유지해야 합니다.
12. 수술 후 회복을 지원하기 위해 항생제와 진통제를 투여합니다.
    참고: 수술을 받은 동물은 완전히 회복될 때까지 다른 동물과 함께 다시 소개되지 않습니다. 동물에게 세프트리악손 나트륨(180mg/kg)의 복강내 주사와 카프로펜(5mg/kg)의 피하 주사를 투여하고, 리도카인 겔을 3일 동안 매일 수술 상처에 도포하였다. 동물은 행동 테스트를 완료하기 위해 지정된 기간 동안 생존해야 합니다. 그 후, 4%-5% 이소플루란을 사용하여 안락사시킨 다음 바이러스 감염과 전극 이식 부위를 평가하기 위해 관류 및 조직 절편을 실시합니다.

3. in vivo brain 녹화를 위한 프로토콜

1. 신호 기록 및 동작 테스트(오픈 필드 테스트)¹⁵를 수행하기 전에 마우스가 환경에 적응할 수 있도록 3일 동안 부드럽게 다루어야 합니다.
   참고: 이 연구에서는 쥐를 개방된 들판(42cm × 42cm)에 놓아 자유롭게 움직일 수 있도록 하여 발작 행동을 관찰할 수 있었습니다.
2. 마우스를 이소플루란(2%-4%)으로 마취한 후 헤드스테이지를 삽입하기 전에 녹음 부위의 순서대로 광섬유를 순차적으로 연결합니다.
3. 635Hz에서 10% 듀티 사이클로 20nm 광 펄스를 설정합니다. 녹화 중에 광 자극을 10초(200펄스)로 설정합니다. 광섬유 팁의 강도를 3mW로 설정합니다.
4. 광섬유 측광 시스템을 사용하여 6nm LED 채널로 30Hz의 샘플링 속도로 Gcamp470m 신호 동작 테스트 기간을 기록합니다.
5. 광유전학 자극 하에서 칼슘 신호, LFP 및 EEG를 해당 행동 성능과 함께 동시에 기록합니다( 그림 3 참조).
6. TTL(Transistor-Transistor Logic) 신호 동기화 태깅을 사용하여 기록된 데이터의 시간적 일관성을 보장합니다.

4. 데이터 처리

1. 측광 데이터를 MATLAB으로 불러옵니다. 그런 다음 사용자 정의 코딩(보충 파일 1)을 사용하여 칼슘 신호의 추세를 제거합니다.
2. 방정식 (1)으로 형광 강도의 변화를 정의합니다.
   ΔF/F = (_{F t} - F₀)/ F₀ (1)
   여기서_Ft 는 실시간 칼슘 신호 형광 값을 나타내고, F₀ 는 이벤트 전의 평균 기준선 형광 강도를 나타냅니다.
3. 1000Hz의 샘플링 속도인 전기생리학적 데이터를 MATLAB으로 가져옵니다(보충 파일 2).
4. 칼슘 신호 전달 및 전기생리학적 데이터의 표시를 동기화된 마커에 맞춰 조정합니다.

결과

우리는 광유전학을 다지역 전기생리학적 기록 및 칼슘 영상과 결합하여 광유전학 발작 동안 다양한 뇌 영역에서 신경 세포 활동을 관찰했습니다. 이를 위해, CaMKIIα 프로모터(AAV-CaMKIIα-ChrimsonR-mcherry)¹⁶ 의 제어 하에 ChrimsonR을 발현하는 아데노 관련 바이러스(AAV)를 설치류의 고전적인 간질 부위인 이상근 피질(ROI 1)¹⁷에 주입했습니다. 또?...

토론

여기에서 우리는 여러 지역에 걸쳐 생체 내 신경 신호 기록을 위해 자체 제작한 optrode 장치를 사용했습니다. 동시 광유전학적 자극, 칼슘 신호 기록 및 전기생리학적 기록에 대한 이 시스템의 타당성이 검증되었습니다. 본원에 설명된 전극 제조 방법은 효율적이고 비용 효율적이다. 실험 설계에 따르면, 우리는 관련 뇌 영역의 신호를 기록할 수 있었다. 옵트로데스?...

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
8-32 adapter	Plexon	Custom ordered	Connect the female connector and headstage
AAV-CaMKIIα-ChrimsonR-mcherry	Taitool Bioscience	S0371-9	4 x 1012 VG/mL
AAV-hsyn-Gcamp6m	Taitool Bioscience	S0471-9	4 x 1012 VG/mL
DAPI	Sigma	236276	Titered 1:500
Dental Cement	New Century Dental	430205
Electrophysiological recordings system	Plexon	Omniplex
Enameled wire	N/A	Custom ordered	Diameter = 0.2 mm
Female connector	N/A	Custom ordered	1.25 mm pitch
Glue	Loctite	45282
Laser	Changchun New Industries	BH81563	635 nm
MATLAB	MathWorks	R2021b
Microdrill	RWD	78001
Multichannel fiber photometry	ThinkerTech	FPS-SS-MC-LED
Optical fiber	Xi'an Bogao	L-200UM	Select the appropriate fiber length based on the depth of the targeted brain regions.
PFA-Coated Tungsten wire	A-M System	795500	Bare 0.002"; Coated 0.0040"
Power meter	Thorlabs	PM100D
Stereotaxic Fxrame	RWD	68807
Tissue adhesive	3M	1469SB