Um método integrado para criar otérios eletrofisiológicos flexíveis e convenientes para gravação in vivo em várias regiões

Resumo

Desenvolvemos uma abordagem simplificada e econômica para a fabricação de eletrodos e realizamos gravações de sinais em várias regiões em camundongos em movimento livre. A utilização da optogenética, juntamente com a eletrofisiologia multirregional e o registro do sinal de cálcio, permitiu a revelação de atividades neuronais em todas as regiões do modelo de acendimento de convulsões.

Resumo

A epilepsia é um distúrbio neurológico caracterizado por descargas anormais sincronizadas envolvendo várias regiões do cérebro. As lesões focais facilitam a propagação de sinais epilépticos através de circuitos neurais associados. Portanto, o registro in vivo do potencial de campo local (LFP) das regiões críticas do cérebro é essencial para decifrar os circuitos envolvidos na propagação das convulsões. No entanto, os métodos atuais para fabricação e implantação de eletrodos carecem de flexibilidade. Aqui, apresentamos um dispositivo útil projetado para registros eletrofisiológicos (LFPs e eletroencefalografia [EEG]) em várias regiões. Além disso, integramos perfeitamente a manipulação optogenética e o registro de sinalização de cálcio com o registro LFP. Pós-descargas robustas foram observadas em várias regiões separadas durante crises epilépticas, acompanhadas por aumento da sinalização de cálcio. A abordagem usada neste estudo oferece uma estratégia conveniente e flexível para gravações neurais síncronas em diversas regiões do cérebro. Ele tem o potencial de avançar na pesquisa sobre distúrbios neurológicos, fornecendo insights sobre os perfis neurais de várias regiões envolvidas nesses distúrbios.

Introdução

A epilepsia é uma condição neurológica comum caracterizada por convulsões recorrentes, que se manifestam como convulsões, distúrbios sensoriais e perda de consciência¹. Os mecanismos fisiopatológicos subjacentes à epilepsia são complexos e envolvem múltiplas regiões cerebrais interconectadas ^2,3. Avanços recentes em neuroimagem lançaram luz sobre as redes de grande escala envolvidas na epilepsia ^4,5. No entanto, a compreensão dos intrincados circuitos e mecanismos de rede subjacentes à geração e propagação da epilepsia permanece limitada, em parte devido à aplicação insuficiente de técnicas de registro neural multirregional⁶. Portanto, é imperativo desenvolver um método flexível e integrado capaz de monitorar simultaneamente a atividade neural em regiões cerebrais díspares.

Registros eletrofisiológicos são realizados para capturar convulsões e determinar a presença de epilepsia⁷. Exceto para registrar a atividade eletrofisiológica, há uma ênfase crescente na atividade precisa do cálcio de populações neurais específicas em estudos de epilepsia ^8,9. Avanços na síntese de indicadores de cálcio e vários projetos de sondas levaram os pesquisadores a adotar a fotometria de fibra para capturar mudanças na atividade neuronal e substâncias neurais dentro do cérebro^10,11. Os dois métodos independentes de detecção da atividade neuronal, ou seja, eletrofisiologia e registro de fotometria de fibra, complementam-se, facilitando uma compreensão mais abrangente dos processos neuronais dinâmicos.

Além disso, o registro síncrono e a modulação da atividade neural são fundamentais para obter insights sobre o funcionamento do cérebro nos níveis de rede e celular. Essa abordagem permite que os pesquisadores observem e manipulem os processos complexos do cérebro em tempo real. A optogenética emergiu como uma ferramenta indispensável para sondar a sinalização neural, devido à sua capacidade distinta de estimulação ou inibição seletiva¹². Apesar das aplicações generalizadas de registro eletrofisiológico em vários locais na neurociência¹³, a integração do registro eletrofisiológico multirregional com fotometria de fibra e manipulação optogenética permanece limitada. Mais importante, os métodos atuais para fabricar e implantar eletrodos multirregionais carecem de flexibilidade¹⁴. Essas limitações dificultam nossa capacidade de dissecar funções e interações específicas do circuito em várias regiões. Aqui, apresentamos uma abordagem de gravação in vivo multirregional econômica e conveniente que lança luz sobre os processos neuronais em todas as regiões em convulsões induzidas por kindling e outros distúrbios neuropsiquiátricos.

Protocolo

Este protocolo recebeu aprovação do Comitê de Cuidados e Uso de Animais da Universidade de Fudan e foi conduzido seguindo as diretrizes e regulamentos elaborados pelo Guia de Cuidados e Uso de Animais de Laboratório dos Institutos Nacionais de Saúde. Todas as medidas possíveis foram implementadas para minimizar o número de animais utilizados neste estudo. O tempo necessário para executar cada etapa está incluído nas respectivas etapas.

1. Preparação dos eletrodos (Figura 1)

1. Corte um comprimento apropriado de fio de tungstênio (~ 20 mm) e queime a camada de isolamento em uma extremidade para expor o fio de tungstênio (1,6-2 mm). Dobre a outra extremidade do fio em forma de "L" (veja a Figura 1A, ~ 1 min)
2. Coloque cuidadosamente a extremidade "L" do fio de tungstênio na fibra óptica (consulte a Figura 1B, ~ 1 min).
   NOTA: O fio de tungstênio deve ser 0,2-0,4 mm mais longo que a ponta da fibra óptica.
3. Mergulhe uma gota de adesivo e aplique-a na interface da fibra óptica e do fio de tungstênio (veja a Figura 1C, ~ 1 min). Devido à tensão superficial do líquido, o fio de tungstênio se conectará à fibra óptica.
4. Aplique o adesivo uma vez e deixe secar. Em seguida, aplique uma segunda camada. Isso apertará ainda mais a ligação entre o fio de tungstênio e a fibra óptica (consulte a Figura 1C, ~ 1 min).
   NOTA: Durante o processo de aplicação, deve-se tomar cuidado para evitar que o adesivo escorra para a ponta da fibra óptica, pois isso pode afetar sua transmitância.
5. No canto da forma de "L", use adesivo para unir a base da fibra óptica e o fio de tungstênio (~ 1 min).
   NOTA: O aumento da área de contato e a solidificação esférica da gota adesiva garantem uma ligação firme entre a fibra óptica e o fio de tungstênio.
6. Use solda para estabelecer uma conexão entre o fio de tungstênio e o pino do conector fêmea (consulte a Figura 1D, ~ 3 min para cada)
   NOTA: Como o fio de tungstênio não é sensível ao calor, a taxa de sucesso da soldagem pode ser aumentada para quase 100% por uma luva de metal formada cortando a localização do slot do pino para unir fisicamente os dois componentes. Posteriormente, o preenchimento da luva pela solda garante uma conexão estável entre o fio de tungstênio inserido e o pino.
7. De acordo com o projeto experimental, solde o número necessário de optrodes (veja a Figura 1E, ~ 10 min)
   NOTA: Três optrodes foram utilizados neste estudo.
8. Corte o fio esmaltado no comprimento apropriado (~30 mm) e queime o isolamento em ambas as extremidades. Enrole uma extremidade do fio esmaltado ao redor da base do parafuso e solde-o. Conecte a outra extremidade do fio esmaltado aos pinos do conector fêmea por meio de um ferro de solda, servindo como registro de EEG e conexão de aterramento para o eletrodo do crânio (consulte a Figura 1F, ~ 5 min)
   NOTA: Devido à flexibilidade do fio esmaltado, é conveniente conectar o crânio e os pinos do conector fêmea. A soldagem após enrolar o fio esmaltado em torno de um parafuso é mais confiável do que a soldagem de montagem em superfície.
9. Aplique adesivo hot-melt na matriz de pinos do conector fêmea para encapsular o conector fêmea e garantir que as juntas de solda estejam totalmente envolvidas. Durante a solidificação do adesivo hot-melt, molde o adesivo usando uma placa plástica para minimizar a ocupação do espaço durante a implantação (consulte a Figura 1F, ~ 3 min)
   NOTA: Devido aos riscos potenciais de queimadura associados ao uso de cola termofusível, o adesivo AB é considerado uma alternativa mais segura.
10. Em seguida, use um medidor de intensidade de luz e um multímetro digital para medir a luminosidade e a condutividade. Ao passar nesses testes, a configuração está pronta para uso (consulte a Figura 1G, ~2 min)
    NOTA: Ao trabalhar com lasers, use sempre óculos de proteção adequados ao comprimento de onda e potência específicos da luz laser. Fibras de alta qualidade são necessárias para transmitir pelo menos 80% da luz da extremidade do patch cord para a ponta da fibra implantável. Além disso, a resistência da ponta do fio de tungstênio até a ranhura do cabeçalho do pino foi medida com uma faixa aceitável de 1-5 Ω.
11. Antes de usar, mergulhe os eletrodos preparados em álcool 75% por 15 min e, em seguida, transfira-os para solução salina estéril (~ 16 min).
    NOTA: O peso total do dispositivo de eletrodo encapsulado (0,6701 ± 0,01123 g, n = 4) não afeta a atividade dos camundongos. Os eletrodos são esterilizados antecipadamente usando esterilização por plasma.

2. Protocolo para implante de eletrodos (Figura 2)

1. Anestesiar os camundongos com isoflurano (2%-4%) e prendê-los em um aparelho estereotáxico (ver Figura 2A, ~ 2 min). Use pomada para os olhos dos olhos do camundongo para evitar o ressecamento durante a anestesia. Aplique lidocaína na pele ao redor do perímetro da incisão craniana e uma injeção subcutânea de carprofeno na dose de 5 mg / kg.
   NOTA: A anestesia adequada é confirmada pela ausência do reflexo de endireitamento e pela perda de resposta ao beliscão do dedo do pé. Para procedimentos cirúrgicos prolongados, o uso de um anestésico injetável é mais apropriado.
2. Depois de prender o animal no aparelho estereotáxico, apare o couro cabeludo ao longo da borda do crânio e limpe a superfície do crânio com álcool 75% para expor as posições do bregma e lambda (ver Figura 2B, ~ 3 min).
   NOTA: O procedimento pré-cirúrgico inclui cortar o cabelo, desinfetar o local da cirurgia, pré-esterilizar os instrumentos e ferramentas cirúrgicas.
3. Nivele o cérebro e faça furos (~ 0,8 mm) acima das regiões de interesse (ROI) usando uma microbroca. Injete os vírus relevantes com uma bomba de seringa (ver Figura 2C - F, ~ 20 min).
   NOTA: Informações detalhadas sobre os vírus e ROIs neste estudo são mostradas na Tabela de Materiais e na Figura 3.
4. Segure os optrodes com um suporte e mova sua ponta para o ponto bregma, definindo esta posição como 'zero'. Usando o ponto bregma como coordenada de referência, mova os optrodes para as regiões alvo (veja a Figura 2G, ~ 3 min). Posicione os optrodes 0,3 mm acima do local de injeção do vírus.
   NOTA: Na estratégia de implantação vertical, a distância mínima entre os dois eletrodos é de aproximadamente 2 mm, dependendo da espessura da luva de fibra óptica e do diâmetro externo da ponteira. Um método de inserção angular pode ser usado para gravação simultânea de regiões próximas.
5. Depois de inserir as fibras ópticas nas áreas cerebrais correspondentes, aplique uma pequena quantidade de adesivo tecidual ao redor delas para cobrir o tecido exposto. Em seguida, aplique sequencialmente adesivo adicional e um pouco de cimento dental. Depois que o cimento dentário solidificar, solte o suporte com cuidado (veja a Figura 2H, ~5 min).
6. Antes de cada novo implante de optrodo, execute a recalibração, que envolve a repetição da etapa 2.4 (consulte a Figura 2I).
   NOTA: Para cada implante, posicione o optrodo no bregma como o ponto 'zero'.
7. Depois de implantar todos os optrodes, faça os furos atrás do ponto lambda para 'Terra' e acima do neocórtex para 'EEG' usando uma microbroca (~ 1 min).
   NOTA: O tamanho do furo perfurado (~1.1 mm) precisa corresponder ao diâmetro do parafuso.
8. Insira os parafusos do crânio no orifício acima do córtex e atrás do ponto lambda (ver Figura 2J, ~ 5 min).
   NOTA: Os parafusos de caveira são usados para gravação e aterramento de EEG, respectivamente.
9. Organize os fios de tungstênio e os fios esmaltados para que fiquem posicionados acima da área de implantação e não expostos fora do crânio. Fixe a posição do conector fêmea usando um suporte (consulte a Figura 2K, ~2 min).
10. Preencha o local de implantação com cimento dentário para garantir uma conexão estável entre o dispositivo de eletrodo e o crânio. Encapsule os fios internos, deixando os orifícios de inserção do conector fêmea expostos para conexão ao headstage (consulte a Figura 2L, ~ 6 min).
11. Após o endurecimento do cimento dentário, aplique iodo na pele ao redor do perímetro do couro cabeludo exposto e, em seguida, coloque o animal em uma almofada de aquecimento (~1 min).
    NOTA: Certifique-se de que o animal não seja deixado sem vigilância até que tenha recuperado a consciência suficiente para manter a decúbito esternal. Condições estéreis devem ser mantidas durante toda a cirurgia de sobrevivência.
12. Administre antibióticos e analgésicos para apoiar a recuperação pós-cirúrgica.
    NOTA: Os animais que foram submetidos a cirurgia não são reintroduzidos na companhia de outros animais até que estejam totalmente recuperados. Os animais receberam injeções intraperitoneais de ceftriaxona sódica (180 mg/kg) e injeções subcutâneas de carprofeno (5 mg/kg), e gel de lidocaína foi aplicado nas feridas cirúrgicas diariamente por 3 dias. Os animais são obrigados a sobreviver por um período designado para completar o teste comportamental. Posteriormente, serão eutanasiados com isoflurano a 4%-5%, seguido de perfusão e secção tecidual para avaliação da infecção viral e dos locais de implantação do eletrodo.

3. Protocolo para registro de cérebro in vivo

1. Antes de realizar o registro de sinais e testes comportamentais (teste de campo aberto)¹⁵, certifique-se de que o mouse seja submetido a um período de 3 dias de manuseio suave para aclimatá-lo ao ambiente.
   NOTA: Neste estudo, os camundongos foram colocados em campo aberto (42 cm × 42 cm) para se movimentarem livremente, permitindo observar seu comportamento convulsivo.
2. Após anestesiar os camundongos com isoflurano (2%-4%), conecte as fibras ópticas sequencialmente na ordem do local de gravação antes de inserir o headstage.
3. Defina o pulso de luz de 635 nm com um ciclo de trabalho de 10% a 20 Hz. Configure a estimulação de luz por 10 s (200 pulsos) durante a gravação. Defina a intensidade nas pontas da fibra óptica em 3 mW.
4. Use um sistema de fotometria de fibra para registrar o período de teste comportamental dos sinais Gcamp6m a uma taxa de amostragem de 30 Hz por canal de LED de 470 nm.
5. Registre simultaneamente sinais de cálcio, LFPs e EEG sob estimulação optogenética, juntamente com os desempenhos comportamentais correspondentes (ver Figura 3).
6. Empregue a marcação de sincronização de sinal da lógica transistor-transistor (TTL) para garantir a consistência temporal nos dados registrados.

4. Processamento de dados

1. Carregue os dados de fotometria no software MATLAB. Em seguida, use a codificação personalizada (Arquivo Suplementar 1) para reduzir a tendência do sinal de cálcio.
2. Defina as mudanças na intensidade de fluorescência com a equação (1):
   ΔF/F = (F_t - F₀)/ F₀ (1)
   Onde F_t representa os valores de fluorescência do sinal de cálcio em tempo real e F₀ denota a intensidade média de fluorescência basal antes do evento.
3. Importe os dados eletrofisiológicos, taxa amostrada de 1000 Hz, para o MATLAB (Arquivo Suplementar 2).
4. Coordene a exibição de sinalização de cálcio e dados eletrofisiológicos em alinhamento com marcadores sincronizados.

Resultados

Combinamos optogenética com registro eletrofisiológico multirregional e imagens de cálcio para observar a atividade neuronal em várias regiões do cérebro durante convulsões optogenéticas. Para isso, um vírus adeno-associado (AAV) expressando ChrimsonR sob o controle do promotor CaMKIIα (AAV-CaMKIIα-ChrimsonR-mcherry)¹⁶ foi injetado em um sítio epileptogênico clássico, o córtex piriforme (ROI 1)¹⁷, em roedores. Além disso, AA...

Discussão

Aqui, empregamos um dispositivo optrode feito por nós mesmos para gravação de sinais neurais in vivo em várias regiões. A viabilidade deste sistema para estimulação optogenética simultânea, registro de sinal de cálcio e registro eletrofisiológico foi validada. O método de preparação do eletrodo aqui descrito é eficiente e econômico. De acordo com o projeto experimental, poderíamos registrar sinais de regiões cerebrais relevantes. O arranjo estratégico de optro...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
8-32 adapter	Plexon	Custom ordered	Connect the female connector and headstage
AAV-CaMKIIα-ChrimsonR-mcherry	Taitool Bioscience	S0371-9	4 x 1012 VG/mL
AAV-hsyn-Gcamp6m	Taitool Bioscience	S0471-9	4 x 1012 VG/mL
DAPI	Sigma	236276	Titered 1:500
Dental Cement	New Century Dental	430205
Electrophysiological recordings system	Plexon	Omniplex
Enameled wire	N/A	Custom ordered	Diameter = 0.2 mm
Female connector	N/A	Custom ordered	1.25 mm pitch
Glue	Loctite	45282
Laser	Changchun New Industries	BH81563	635 nm
MATLAB	MathWorks	R2021b
Microdrill	RWD	78001
Multichannel fiber photometry	ThinkerTech	FPS-SS-MC-LED
Optical fiber	Xi'an Bogao	L-200UM	Select the appropriate fiber length based on the depth of the targeted brain regions.
PFA-Coated Tungsten wire	A-M System	795500	Bare 0.002"; Coated 0.0040"
Power meter	Thorlabs	PM100D
Stereotaxic Fxrame	RWD	68807
Tissue adhesive	3M	1469SB