АВТОРЫ
СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

Войдите в систему

Для просмотра этого контента требуется подписка на Jove Войдите в систему или начните бесплатную пробную версию.

В этой статье

  • Резюме
  • Аннотация
  • Введение
  • протокол
  • Результаты
  • Обсуждение
  • Раскрытие информации
  • Благодарности
  • Материалы
  • Ссылки
  • Перепечатки и разрешения

Резюме

Мы разработали упрощенный и экономичный подход к изготовлению электродов и провели запись сигналов в нескольких областях у свободно движущихся мышей. Использование оптогенетики, наряду с многорегиональной электрофизиологией и регистрацией сигналов кальция, позволило выявить активность нейронов в разных областях в модели разжигания судорог.

Аннотация

Эпилепсия — это неврологическое расстройство, характеризующееся синхронизированными аномальными разрядами, затрагивающими несколько областей мозга. Очаговые поражения способствуют распространению эпилептических сигналов по связанным нейронным цепям. Таким образом, регистрация in vivo потенциала локального поля (LFP) из критических областей мозга имеет важное значение для расшифровки цепей, участвующих в распространении судорог. Тем не менее, современные методы изготовления и имплантации электродов не являются гибкими. В этой статье мы представляем удобное устройство, предназначенное для электрофизиологической записи (LFP и электроэнцефалографии [ЭЭГ]) в нескольких регионах. Кроме того, мы бесшовно интегрировали оптогенетические манипуляции и запись кальциевой сигнализации с записью LFP. Во время эпилептических припадков в нескольких отдельных областях наблюдались устойчивые послевыходные, сопровождающиеся усилением передачи сигналов кальция. Подход, использованный в этом исследовании, предлагает удобную и гибкую стратегию синхронной нейронной записи в различных областях мозга. Он обладает потенциалом для продвижения исследований неврологических расстройств, предоставляя представление о нейронных профилях нескольких областей, участвующих в этих расстройствах.

Введение

Эпилепсия является распространенным неврологическим заболеванием, характеризующимся повторяющимися припадками, которые проявляются в виде судорог, сенсорных нарушений и потери сознания1. Патофизиологические механизмы, лежащие в основе эпилепсии, сложны и включают в себя множество взаимосвязанных областей мозга 2,3. Последние достижения в области нейровизуализации пролили свет на крупномасштабные сети, участвующие в эпилепсии 4,5. Тем не менее, понимание сложных схемотехнических и сетевых механизмов, лежащих в основе возникновения и распространения эпилепсии, остается ограниченным, отчасти из-за недостаточногоприменения методов многорегиональной нейронной записи. Поэтому крайне важно разработать гибкий, интегрированный метод, способный одновременно контролировать нейронную активность в разрозненных областях мозга.

Электрофизиологическая запись проводится для фиксации припадков и определения наличия эпилепсии7. За исключением регистрации электрофизиологической активности,в исследованиях эпилепсии все больше внимания уделяется точной активности кальция в конкретных нервных популяциях 8,9. Достижения в области синтеза кальциевых индикаторов и различных конструкций зондов побудили исследователей использовать волоконную фотометрию для фиксации изменений в нейронной активности и нейронных веществахв мозге. Два независимых метода регистрации активности нейронов, а именно электрофизиология и запись волоконной фотометрии, дополняют друг друга, способствуя более полному пониманию динамических нейронных процессов.

Кроме того, синхронная запись и модулирование нейронной активности имеют решающее значение для получения информации о функционировании мозга как на сетевом, так и на клеточном уровнях. Такой подход позволяет исследователям наблюдать и манипулировать сложными процессами в мозге в режиме реального времени. Оптогенетика стала незаменимым инструментом для исследования нейронной сигнализации благодаря своей отличительной способности к избирательной стимуляции или торможению. Несмотря на широкое применение многосайтовой электрофизиологической записи в нейронауке13, интеграция многозональной электрофизиологической записи с волоконной фотометрией и оптогенетическими манипуляциями остается ограниченной. Что еще более важно, современные методы изготовления и имплантации многорегиональных электродов не обладают достаточной гибкостью14. Эти ограничения ограничивают нашу способность анализировать конкретные функции цепей и взаимодействия в нескольких областях. В этой статье мы представляем экономически эффективный и удобный подход к многорегиональной записи in vivo, который проливает свет на нейронные процессы в разных областях при судорогах, вызванных разжиганием, и других нервно-психических расстройствах.

протокол

Этот протокол получил одобрение Комитета по уходу за животными и их использованию в Фуданьском университете и был проведен в соответствии с руководящими принципами и правилами, разработанными Руководством Национальных институтов здравоохранения по уходу и использованию лабораторных животных. Были приняты все возможные меры для минимизации количества животных, используемых в данном исследовании. Время, необходимое для выполнения каждого этапа, включено в соответствующие этапы.

1. Подготовка электродов (Рисунок 1)

  1. Отрежьте вольфрамовую проволоку соответствующей длины (~20 мм) и сожгите изоляционный слой с одного конца, чтобы обнажить вольфрамовую проволоку (1,6-2 мм). Согните другой конец провода в форме буквы «L» (см. Рисунок 1A, ~1 мин)
  2. Осторожно поместите L-образный конец вольфрамовой проволоки на оптическое волокно (см. рисунок 1B, ~1 мин).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Вольфрамовая проволока должна быть на 0,2-0,4 мм длиннее кончика оптического волокна.
  3. Опустите каплю клея и нанесите ее на границу раздела оптического волокна и вольфрамовой проволоки (см. Рисунок 1C, ~1 мин). Из-за поверхностного натяжения жидкости вольфрамовая проволока будет прикрепляться к оптическому волокну.
  4. Нанесите клей один раз и дайте ему высохнуть. Затем нанесите второй слой. Это еще больше укрепит связь между вольфрамовым проводом и оптическим волокном (см. Рисунок 1C, ~1 мин).
    ПРИМЕЧАНИЕ: В процессе нанесения следует следить за тем, чтобы клей не стекал на кончик оптического волокна, так как это может повлиять на его коэффициент пропускания.
  5. В углу формы буквы «L» с помощью клея плотно склейте основание оптического волокна и вольфрамовую проволоку вместе (~1 минута).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Увеличенная площадь контакта и сферическое затвердевание адгезивной капли обеспечивают прочное соединение между оптическим волокном и вольфрамовой проволокой.
  6. С помощью пайки установите соединение между вольфрамовым проводом и контактом гнездового разъема (см. Рисунок 1D, ~3 минуты для каждого)
    ПРИМЕЧАНИЕ: Поскольку вольфрамовая проволока не чувствительна к нагреву, вероятность успеха пайки может быть увеличена почти до 100% с помощью металлической втулки, изготовленной путем вырезания контактного слота для физического соединения двух компонентов. Впоследствии, наполнение гильзы припоем обеспечивает стабильное соединение между вставленной вольфрамовой проволокой и штифтом.
  7. Согласно экспериментальному плану, припаять необходимое количество оптродов (см. рисунок 1E, ~10 мин)
    ПРИМЕЧАНИЕ: В этом исследовании были использованы три оптрода.
  8. Отрежьте эмалированный провод до нужной длины (~30 мм) и сожгите изоляцию с обоих концов. Оберните один конец эмалированной проволоки вокруг основания винта и припаяйте его. Подключите другой конец эмалированного провода к контактам гнездового разъема с помощью паяльника, служащего для записи ЭЭГ и заземления для электрода черепа (см. Рисунок 1F, ~5 мин)
    ПРИМЕЧАНИЕ: Благодаря гибкости эмалированного провода удобно подключать череп и контакты гнездового разъема. Пайка после намотки эмалированного провода на винт более надежна, чем пайка поверхностного монтажа.
  9. Нанесите термоплавкий клей на матрицу контактов гнездового разъема, чтобы герметизировать гнездовой разъем и убедиться, что паяные соединения полностью закрыты. Во время затвердевания клея-расплава придайте клею форму с помощью пластиковой платы, чтобы свести к минимуму занимаемое пространство во время имплантации (см. Рисунок 1F, ~3 мин)
    ПРИМЕЧАНИЕ: Из-за потенциального риска ожога, связанного с использованием клея-расплава, клей AB считается более безопасной альтернативой.
  10. Затем используйте измеритель интенсивности света и цифровой мультиметр для измерения яркости и проводимости. После прохождения этих тестов установка готова к использованию (см. Рисунок 1G, ~2 мин)
    ПРИМЕЧАНИЕ: При работе с лазерами всегда надевайте защитные очки, подходящие для конкретной длины волны и мощности лазерного света. Высококачественные волокна необходимы для пропускания не менее 80% света от конца патч-корда к кончику имплантируемого волокна. Кроме того, сопротивление от наконечника вольфрамовой проволоки до отверстия контактного разъема измерялось в допустимом диапазоне 1-5 Ω.
  11. Перед применением подготовленные электроды погрузить в 75% спирт на 15 минут, затем переложить в стерильный физиологический раствор (~16 минут).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Общий вес инкапсулированного электродного устройства (0,6701 ± 0,01123 г, n = 4) не влияет на активность мышей. Электроды предварительно стерилизуются с помощью плазменной стерилизации.

2. Протокол имплантации электродов (Рисунок 2)

  1. Обезболите мышей изофлураном (2%-4%) и закрепите их в стереотаксическом аппарате (см. рисунок 2A, ~2 мин). Используйте глазную мазь на глазах мышей, чтобы предотвратить сухость во время анестезии. Нанести лидокаин на кожу по периметру черепного разреза и подкожно ввести карпрофен в дозе 5 мг/кг.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Правильная анестезия подтверждается отсутствием выпрямляющего рефлекса и потерей реакции на защемление пальца ноги. Для длительных хирургических манипуляций более целесообразно использование инъекционного анестетика.
  2. После закрепления животного в стереотаксическом аппарате срежьте скальп по краю черепа и протрите поверхность черепа 75% спиртом, чтобы обнажить положения брегмы и лямбды (см. рис. 2B, ~3 мин).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Предоперационная процедура включает в себя стрижку волос, дезинфекцию места операции, предварительную стерилизацию инструментов и хирургических инструментов.
  3. Выровняйте мозг и просверлите отверстия (~0,8 мм) над областями интереса (ROI) с помощью микродрели. Введите соответствующие вирусы с помощью шприцевого насоса (см. рисунок 2C - F, ~20 мин).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Подробная информация о вирусах и ROI в этом исследовании показана в Таблице материалов и Рисунке 3.
  4. Удерживайте оптроды держателем и переместите их наконечник в точку брегмы, установив это положение как «ноль». Используя точку брегмы в качестве координаты отсчета, переместите оптроды в целевые области (см. рис. 2G, ~3 мин). Расположите оптроды на расстоянии 0,3 мм над местом инъекции вируса.
    ПРИМЕЧАНИЕ: При вертикальной имплантации минимальное расстояние между двумя электродами составляет примерно 2 мм, в зависимости от толщины оптоволоконной втулки и внешнего диаметра наконечника. Метод угловой вставки может быть использован для одновременной записи из близко расположенных областей.
  5. После введения оптических волокон в соответствующие участки мозга нанесите небольшое количество тканевого клея вокруг них, чтобы покрыть открытые ткани. Затем последовательно нанесите дополнительный клей и немного стоматологического цемента. После того как стоматологический цемент застынет, осторожно отпустите держатель (см. Рисунок 2H, ~5 мин).
  6. Перед каждой имплантацией нового оптрода выполняйте повторную калибровку, которая включает в себя повторение шага 2.4 (см. рисунок 2I).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Для каждой имплантации располагайте оптрод в брегме как «нулевую» точку.
  7. После имплантации всех оптродов просверлите отверстия за лямбда-точкой для «Земли» и над неокортексом для «ЭЭГ» с помощью микросверла (~1 мин).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Размер просверленного отверстия (~1,1 мм) должен соответствовать диаметру винта.
  8. Вставьте винты черепа в отверстие над корой головного мозга и за лямбда-точкой (см. Рисунок 2J, ~5 мин).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Винты с черепом используются для записи ЭЭГ и заземления соответственно.
  9. Организуйте вольфрамовые проволоки и эмалированные провода так, чтобы они располагались над зоной имплантации и не обнажались за пределами черепа. Закрепите положение гнездового разъема с помощью держателя (см. рис. 2K, ~2 мин).
  10. Заполните место имплантации стоматологическим цементом, чтобы обеспечить стабильное соединение между электродным устройством и черепом. Герметизируйте внутренние провода, оставив вставные отверстия гнездового разъема открытыми для подключения к головному устройству (см. Рисунок 2L, ~6 мин).
  11. После затвердевания стоматологического цемента нанесите йод на кожу по периметру открытой кожи головы, а затем положите животное на греющую подушку (~1 мин).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Следите за тем, чтобы животное не оставляли без присмотра до тех пор, пока оно не придет в сознание, достаточное для поддержания лежачего положения за грудиной. Стерильные условия должны поддерживаться на протяжении всей операции по выживанию.
  12. Вводите антибиотики и анальгетики для поддержки послеоперационного восстановления.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Животные, перенесшие операцию, не возвращаются в компанию других животных до тех пор, пока они полностью не выздоровеют. Животным вводили внутрибрюшинные инъекции цефтриаксона натрия (180 мг/кг) и подкожные инъекции карпрофена (5 мг/кг), а также ежедневно в течение 3 дней в операционные раны наносили гель с лидокаином. Животные должны выжить в течение определенного периода времени, чтобы завершить поведенческое тестирование. Впоследствии они будут усыплены с использованием 4-5% изофлурана с последующей перфузией и срезом тканей для оценки вирусной инфекции и мест имплантации электродов.

3. Протокол записи in vivo мозга

  1. Перед проведением записи сигнала и поведенческого тестирования (испытания в открытом поле)15 убедитесь, что мышь подвергается 3-дневному бережному обращению, чтобы акклиматизировать ее к окружающей среде.
    Примечание: В этом исследовании мышей поместили в открытое поле (42 см × 42 см) для свободного передвижения, что позволило нам наблюдать за их судорожным поведением.
  2. После обезболивания мышей изофлураном (2%-4%) соедините оптические волокна последовательно в порядке места записи перед тем, как вставить головной сценарий.
  3. Установите световой импульс с длиной волны 635 нм с рабочим циклом 10% на частоту 20 Гц. Настройте световую стимуляцию на 10 с (200 импульсов) во время записи. Установите интенсивность на концах оптического волокна на 3 мВт.
  4. Используйте оптоволоконную фотометрическую систему для записи периода поведенческого тестирования сигналов Gcamp6m с частотой дискретизации 30 Гц по светодиодному каналу 470 нм.
  5. Одновременная запись сигналов кальция, LFP и ЭЭГ под оптогенетической стимуляцией вместе с соответствующими поведенческими характеристиками (см. рис. 3).
  6. Используйте теги синхронизации сигналов транзисторно-транзисторной логики (TTL) для обеспечения временной согласованности записанных данных.

4. Обработка данных

  1. Загрузите данные фотометрии в программное обеспечение MATLAB. Затем используйте пользовательское кодирование (Дополнительный файл 1) для детрендинга кальциевого сигнала.
  2. Определим изменения интенсивности флуоресценции с помощью уравнения (1):
    ΔF/F = (Ft - F0)/ F0 (1)
    Где Ft представляет значения флуоресценции кальциевого сигнала в реальном времени, а F0 обозначает усредненную базовую интенсивность флуоресценции до события.
  3. Импортируйте электрофизиологические данные с частотой дискретизации 1000 Гц в MATLAB (Дополнительный файл 2).
  4. Координируйте отображение кальциевых сигнальных и электрофизиологических данных в соответствии с синхронизированными маркерами.

Результаты

Мы объединили оптогенетику с мультирегиональной электрофизиологической регистрацией и визуализацией кальция для наблюдения за нейронной активностью в различных областях мозга во время оптогенетических припадков. С этой целью у грызунов в классический эпилептоге?...

Обсуждение

Здесь мы использовали самодельное устройство optrode для записи нейронных сигналов in vivo в нескольких областях. Доказана возможность использования этой системы для одновременной оптогенетической стимуляции, регистрации кальциевого сигнала и электрофизиологическ...

Раскрытие информации

Авторы заявляют об отсутствии конкурирующих финансовых интересов.

Благодарности

Это исследование было поддержано Национальным фондом естественных наук Китая (31871085), Фондом естественных наук Шанхая (21ZR1407300), Шанхайским муниципальным проектом науки и технологий (2018SHZDZX01), ZJ Lab и Шанхайским центром науки о мозге и технологий, вдохновленных мозгом.

Материалы

NameCompanyCatalog NumberComments
8-32 adapterPlexonCustom orderedConnect the female connector and headstage
AAV-CaMKIIα-ChrimsonR-mcherryTaitool BioscienceS0371-94 x 1012 VG/mL 
AAV-hsyn-Gcamp6mTaitool BioscienceS0471-94 x 1012 VG/mL 
DAPISigma236276Titered 1:500
Dental CementNew Century Dental430205
Electrophysiological recordings systemPlexonOmniplex
Enameled wireN/ACustom orderedDiameter = 0.2 mm
Female connectorN/ACustom ordered1.25 mm pitch
GlueLoctite45282
LaserChangchun New IndustriesBH81563635 nm 
MATLABMathWorksR2021b
MicrodrillRWD78001
Multichannel fiber photometryThinkerTechFPS-SS-MC-LED
Optical fiberXi'an BogaoL-200UMSelect the appropriate fiber length based on the depth of the targeted brain regions.
PFA-Coated Tungsten wireA-M System795500Bare 0.002"; Coated 0.0040"
Power meterThorlabsPM100D
Stereotaxic FxrameRWD68807
Tissue adhesive3M1469SB

Ссылки

  1. Devinsky, O., et al. Epilepsy. Nat Rev Dis Primers. 4, 18024 (2018).
  2. Piper, R. J., et al. Towards network-guided neuromodulation for epilepsy. Brain. 145 (10), 3347-3362 (2022).
  3. Bertram, E. H. Neuronal circuits in epilepsy: Do they matter. Exp Neurol. 244, 67-74 (2013).
  4. Goodman, A. M., Szaflarski, J. P. Recent advances in neuroimaging of epilepsy. Neurotherapeutics. 18 (2), 811-826 (2021).
  5. Caciagli, L., Bernhardt, B. C., Hong, S. J., Bernasconi, A., Bernasconi, N. Functional network alterations and their structural substrate in drug-resistant epilepsy. Front Neurosci. 8, 411 (2014).
  6. Dai, Y., et al. In vivo microelectrode arrays for detecting multi-region epileptic activities in the hippocampus in the latent period of rat model of temporal lobe epilepsy. Micromachines (Basel). 12 (6), 659 (2021).
  7. Staba, R. J., Stead, M., Worrell, G. A. Electrophysiological biomarkers of epilepsy. Neurotherapeutics. 11 (2), 334-346 (2014).
  8. Grienberger, C., Giovannucci, A., Zeiger, W., Portera-Cailliau, C. Two-photon calcium imaging of neuronal activity. Nat Rev Methods Primers. 2 (1), 67 (2022).
  9. Akerboom, J., et al. Optimization of a gcamp calcium indicator for neural activity imaging. J Neurosci. 32 (40), 13819-13840 (2012).
  10. Zhang, Y., et al. Fast and sensitive gcamp calcium indicators for imaging neural populations. Nature. 615 (7954), 884-891 (2023).
  11. Wu, Z., Lin, D., Li, Y. Pushing the frontiers: Tools for monitoring neurotransmitters and neuromodulators. Nat Rev Neurosci. 23 (5), 257-274 (2022).
  12. Vierock, J., et al. Bipoles is an optogenetic tool developed for bidirectional dual-color control of neurons. Nat Commun. 12 (1), 4527 (2021).
  13. Luo, W., et al. Acquiring new memories in neocortex of hippocampal-lesioned mice. Nat Commun. 13 (1), 1601 (2022).
  14. Armstrong, C., Krook-Magnuson, E., Oijala, M., Soltesz, I. Closed-loop optogenetic intervention in mice. Nat Protoc. 8 (8), 1475-1493 (2013).
  15. Kraeuter, A. K., Guest, P. C., Sarnyai, Z. The open field test for measuring locomotor activity and anxiety-like behavior. Methods Mol Biol. 1916, 99-103 (2019).
  16. Klapoetke, N. C., et al. Independent optical excitation of distinct neural populations. Nat Methods. 11 (3), 338-346 (2014).
  17. Vismer, M. S., Forcelli, P. A., Skopin, M. D., Gale, K., Koubeissi, M. Z. The piriform, perirhinal, and entorhinal cortex in seizure generation. Front Neural Circuits. 9, 27 (2015).
  18. Chen, T. W., et al. Ultrasensitive fluorescent proteins for imaging neuronal activity. Nature. 499 (7458), 295-300 (2013).
  19. Birling, M. C., Dierich, A., Jacquot, S., Herault, Y., Pavlovic, G. Highly-efficient, fluorescent, locus directed cre and flpo deleter mice on a pure c57bl/6n genetic background. Genesis. 50 (6), 482-489 (2012).
  20. Huang, T., et al. Identifying the pathways required for coping behaviours associated with sustained pain. Nature. 565 (7737), 86-90 (2019).
  21. Likhtik, E., Stujenske, J. M., Topiwala, M. A., Harris, A. Z., Gordon, J. A. Prefrontal entrainment of amygdala activity signals safety in learned fear and innate anxiety. Nat Neurosci. 17 (1), 106-113 (2014).
  22. Tavares, L. C. S., Tort, A. B. L. Hippocampal-prefrontal interactions during spatial decision-making. Hippocampus. 32 (1), 38-54 (2022).
  23. Lu, Y., et al. Optogenetic dissection of ictal propagation in the hippocampal-entorhinal cortex structures. Nat Commun. 7, 10962 (2016).
  24. Liu, Q., Wu, Y., Wang, H., Jia, F., Xu, F. Viral tools for neural circuit tracing. Neurosci Bull. 38 (12), 1508-1518 (2022).
  25. Christenson Wick, Z., Krook-Magnuson, E. Specificity, versatility, and continual development: The power of optogenetics for epilepsy research. Front Cell Neurosci. 12, 151 (2018).
  26. Paschen, E., et al. Hippocampal low-frequency stimulation prevents seizure generation in a mouse model of mesial temporal lobe epilepsy. Elife. 9, e54518 (2020).
  27. Gummadavelli, A., Zaveri, H. P., Spencer, D. D., Gerrard, J. L. Expanding brain-computer interfaces for controlling epilepsy networks: Novel thalamic responsive neurostimulation in refractory epilepsy. Front Neurosci. 12, 474 (2018).
  28. Vandekerckhove, B., et al. Technological challenges in the development of optogenetic closed-loop therapy approaches in epilepsy and related network disorders of the brain. Micromachines (Basel). 12 (1), 38 (2020).
  29. Li, Z. J., Zhang, L. B., Chen, Y. X., Hu, L. Advancements and challenges in neuromodulation technology: Interdisciplinary opportunities and collaborative endeavors. Sci Bull (Beijing). 68 (18), 1978-1982 (2023).
  30. Zhang, Q., et al. A prototype closed-loop brain-machine interface for the study and treatment of pain. Nat Biomed Eng. 7 (4), 533-545 (2023).
  31. Varela, C., Wilson, M. A. Mpfc spindle cycles organize sparse thalamic activation and recently active ca1 cells during non-rem sleep. Elife. 9, e48881 (2020).
  32. Adaikkan, C., et al. Gamma entrainment binds higher-order brain regions and offers neuroprotection. Neuron. 102 (5), 929-943.e8 (2019).
  33. Muthmann, J. O., et al. Spike detection for large neural populations using high density multielectrode arrays. Front Neuroinform. 9, 28 (2015).

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на использование текста или рисунков этого JoVE статьи

Запросить разрешение

Смотреть дополнительные статьи

213

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Конфиденциальность

Условия эксплуатации

Политика

СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

РЕКОМЕНДОВАТЬ БИБЛИОТЕКЕ

НОВОСТИ JoVE

Исследования

Образование

АВТОРЫ

Библиотекарь

О JoVE

Авторские права © 2025 MyJoVE Corporation. Все права защищены