Registros agudos de electrodos múltiples de una sola unidad del tronco encefálico de ratones con cabeza fija

Resumen

Este protocolo describe un método para obtener grabaciones in vivo de una sola neurona de alta densidad a partir del tronco encefálico de ratones con cabeza fija. Este enfoque se implementa para medir el potencial de acción de las neuronas en el gris periacueductal ventrolateral, una región del tronco encefálico inactiva durante el sueño de movimiento ocular rápido (REM), antes y durante la anestesia general.

Resumen

Las grabaciones basadas en multielectrodos de silicio son cada vez más populares para estudiar la actividad neuronal en la resolución temporal de los potenciales de acción en muchas regiones del cerebro. Sin embargo, el registro de la actividad neuronal de las estructuras caudales profundas, como el tronco encefálico, mediante sondas multicanal sigue siendo un reto. Una preocupación importante es encontrar una trayectoria para la inserción de la sonda que evite los vasos sanguíneos grandes, como el seno venoso sagital superior y el seno venoso transverso. Lesionar estas venas grandes puede causar sangrado extenso, daño al tejido cerebral subyacente y potencialmente la muerte. Este enfoque describe el objetivo de las estructuras del tronco encefálico mediante el acoplamiento de las coordenadas anteriores con un enfoque en ángulo, lo que permite que la sonda de registro penetre en el cerebro por debajo de las estructuras vasculares de alto riesgo. En comparación con un enfoque estrictamente vertical, el enfoque en ángulo maximiza el número de regiones del cerebro que se pueden objetivo. Con esta estrategia, se puede acceder de forma reproducible y fiable al gris periacueductal ventrolateral (vlPAG), una región del tronco encefálico asociada con el sueño REM, para obtener registros de múltiples electrodos de una sola unidad en ratones con cabeza fijada antes y durante la anestesia con sevoflurano. La capacidad de registrar la actividad neuronal en el vlPAG y los núcleos circundantes con alta resolución temporal es un paso adelante en la comprensión de la relación entre el sueño REM y la anestesia.

Introducción

Las grabaciones basadas en múltiples electrodos de silicio se están volviendo cada vez más populares para medir la actividad neuronal en muchas regiones del cerebro con una resolución de potencial de acción única 1,2,3,4. En la última década, la tecnología de grabación de alta densidad ha crecido considerablemente. Los electrodos de registro actuales basados en silicio pueden acomodar grandes recuentos de canales, fibras ópticas y dispositivos de registro de electrocorticografía (ECoG) ^5,6. Además, la implantación crónica de estos electrodos permite registros a largo plazo ^7,8.

A pesar de los recientes avances tecnológicos, seguir apuntando a las estructuras caudales profundas, como el tronco encefálico, con sondas multicanal sigue siendo un reto. Cuando se dirigen a las estructuras del tronco encefálico, como el gris periacueductal ventrolateral (vlPAG), un obstáculo importante es identificar una trayectoria de sonda que evite los vasos sanguíneos principales, por ejemplo, el seno venoso sagital superior y el seno venoso transverso. Las lesiones en estas venas grandes pueden causar sangrado extenso, daño al tejido cerebral subyacente e incluso la muerte ^9,10. Proponemos apuntar a las estructuras del tronco encefálico desde las coordenadas anteriores en un ángulo, permitiendo que la sonda de registro penetre en el cerebro por debajo de estas estructuras vasculares de alto riesgo (ver Figura 1). Este enfoque en ángulo, en comparación con uno vertical, maximiza el número de regiones cerebrales accesibles para el registro. Además, en circunstancias experimentales en las que se desean registros de ECoG, el abordaje anterior en ángulo proporciona más superficie craneal disponible para la implantación de auriculares ECoG, ya que la ventana de craneotomía para la inserción de la sonda se coloca más anteriormente^10,11.

La identificación de los grupos celulares y circuitos específicos responsables de los cambios en el sueño REM inducidos por la anestesia sigue siendo un objetivo importante de la investigación sobre anestesia. Por lo tanto, el objetivo fue acceder de manera reproducible y confiable al vlPAG, una región del tronco encefálico asociada con el sueño REM, para obtener registros de electrodos individuales y múltiples electrodos en ratones con cabeza fijada antes y durante la anestesia con sevoflurano^12,13. Estudios previos han utilizado mediciones electrofisiológicas del potencial de campo local (LFP) del vlPAG en ratones despiertos para identificar los cambios de estado neuronal asociados con la anestesia^14,15. Sin embargo, las mediciones de LFP son principalmente sensibles a la actividad sináptica, no a los potenciales de acción, dentro del área registrada¹⁶. En consecuencia, sigue habiendo una comprensión limitada de cómo los anestésicos afectan directamente a los patrones de actividad neuronal producidos por las neuronas vlPAG. Aquí, se describe un método para obtener grabaciones de una sola neurona de alta densidad a partir del tronco encefálico de ratones con cabeza fija. Este método también se puede adaptar para registrar la actividad de una sola neurona de varias otras estructuras profundas y posteriores del tronco encefálico.

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Protocolo

Todos los estudios fueron aprobados por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales de la Universidad de Virginia (Charlottesville, Virginia). Se utilizaron cinco ratones machos C57BL/6J, de 3 a 7 meses de edad, con un peso de 25 a 30 g. Los detalles de los reactivos y el equipo utilizado aquí se enumeran en la Tabla de materiales.

1. Implantación de la placa de cabeza y la dirección

1. Fabrica un auricular ECoG soldando un cable de acero inoxidable recubierto de perfluoroalcoxi (PFA) a un conector de 3 pines (Figura 2A).
2. Identifique las coordenadas de inserción a partir de un atlas estereotáxico de ratón¹⁷. El uso del teorema de Pitágoras para calcular el ángulo y la profundidad de inserción de la sonda, particularmente cuando hay poca información en la literatura, es un punto de partida razonable (Figura 1⁾¹⁸.
   NOTA: En última instancia, las coordenadas se ajustarán por ensayo y error. En ratones adultos se utilizaron las siguientes coordenadas: anteroposterior (AP) -3,6 mm, mediolateral (ML) +0,5 mm, dorsoventral (DV) -4 mm. La sonda se insertó en un ángulo de 20° (AP).
3. Inducir anestesia general colocando al ratón en la cámara de inducción (1,5%-3% de isoflurano en oxígeno). Una vez anestesiado, coloque el ratón en el marco estereotáxico, colocando la nariz del animal en el cono de la nariz y estabilizando la cabeza con barras de cabeza.
4. Aplique ungüento oftálmico en los ojos para prevenir el daño de la córnea. Utilice un sistema de control de temperatura para mantener la temperatura corporal a 37 °C.
5. Aplique crema depilatoria o afeitar el pelo sobre el cuero cabelludo, luego desinfecte con povidona yodada y alcohol al 70%. Utilice la técnica aséptica de "solo puntas" para mantener un campo quirúrgico estéril.
6. Realice una prueba de pellizco en los dedos del pie para verificar la profundidad de la anestesia.
7. Administrar analgesia: carprofeno 2,5 mg/kg, administrado por vía subcutánea en la espalda.
8. Haga una incisión de 5 mm en el cuero cabelludo para eliminar un parche circular de piel por encima de los huesos parietal y occipital. Retire suavemente las meninges raspándolas con la hoja del bisturí.
9. Utilice la hoja del bisturí para cortar las inserciones musculares y exponer los huesos parietal y occipital¹⁹. Aplique peróxido de hidrógeno según sea necesario para controlar el sangrado y secar la superficie del cráneo. Es crucial aplicar cemento dental y resina sobre el cráneo seco para lograr una unión fuerte.
10. Primero, identifique los puntos de referencia bregma y lambda en el cráneo²⁰. A continuación, ajuste la posición del cono de la nariz para nivelar la posición anteroposterior del cráneo, asegurándose de que no exista una diferencia de altura de más de 100 μm entre los dos puntos de referencia.
11. Para nivelar la posición medial-lateral del cráneo, elija dos puntos opuestos entre bregma y lambda, cada uno a 1 mm de la sutura sagital y verifique su nivel. Si hay más de 100 μm de diferencia de altura entre ellos, ajuste la posición medial-lateral del cráneo manipulando las barras de la cabeza.
12. Mida la distancia entre bregma y lambda y compárela con la distancia reportada en el atlas estereotáxico de Franklin-Paxinos (usualmente 4,2 mm)¹⁷. Utilice la diferencia entre las distancias medidas e informadas para escalar proporcionalmente la coordenada AP. Marque las coordenadas de la craneotomía en el cráneo con un lápiz esterilizado.
    NOTA: Si la distancia bregma-lambda medida difiere de 4,2 mm, entonces las coordenadas deben escalarse proporcionalmente. Todas las coordenadas AP reportadas en un atlas estereotáxico corresponden a una distancia bregma-lambda estandarizada. Debido a que el tamaño del cráneo de un ratón es variable, es importante ajustar sus coordenadas en consecuencia.
13. Con un micromanipulador estereotáxico, coloque la placa de la cabeza directamente encima de la sutura lambda y asegúrela al cráneo aplicando cemento dental en la placa de la cabeza y alrededor de ella (Figura 3A, B). Espere al menos 10 minutos para que el cemento se seque.
14. Taladre orificios de rebaba (0,5 mm de diámetro) para dos electrodos corticales (corteza frontal y parietal) y para uno que servirá como electrodo de referencia (cerebelo). Coloque los extremos pelados (0,5 mm) de los electrodos de alambre de plata recubiertos dentro de los orificios de las rebabas y asegúrelos con resina activada con luz ultravioleta.
15. Cubra completamente los alambres de acero inoxidable recubiertos con cemento dental para que no quede expuesto ningún alambre. Cubra la parte inferior y los lados del auricular con cemento dental para que quede firmemente en su lugar. Asegúrese de que las suturas bregma y lambda permanezcan visibles una vez que el auricular esté asegurado en su lugar (Figura 2B).
16. Deje que el ratón se recupere durante un mínimo de 7 días, examine el animal y el sitio quirúrgico diariamente para detectar cualquier irregularidad. Administrar analgésicos (Carprofeno 2,5 mg/kg, SC) según sea necesario.

2. Colocación y registro de la sonda de silicio

1. Habitúe el ratón al equipo de grabación y a la fijación de la cabeza (al menos 1,5 h en dos días distintos) (Figura 2D).
2. El día de la grabación, coloque el ratón en la cámara de anestesia (Isoflurano 1,5%-3% en oxígeno).
3. Coloque el ratón en un marco estereotáxico, ajuste el cono de la nariz y las barras de la cabeza como se describe en 1.3. Mantener la anestesia (Isoflurano 1,5%-3% en oxígeno) durante toda la cirugía estereotáxica. Realice una prueba de pellizco en los dedos del pie para verificar la profundidad de la anestesia.
4. Aplique ungüento oftálmico en los ojos y mantenga una temperatura corporal adecuada.
5. Identifique bregma y lambda, asegurándose de que no exista una diferencia de altura de más de 100 μm entre los dos puntos de referencia anatómicos.
6. Encuentre y marque las coordenadas calculadas en el cráneo con un lápiz estéril, luego cree un contorno de la ventana de craneotomía de 2 mm x 2 mm alrededor de las coordenadas.
7. Realice una prueba de pellizco en los dedos del pie para verificar la profundidad de la anestesia.
8. Use un taladro de alta velocidad para crear una ventana de craneotomía de 2 mm x 2 mm. Aplique 0,5-1 mL de solución salina normal para evitar que la superficie del cerebro se seque. Retire la duramadre con una aguja de jeringa y pinzas finas.
   NOTA: Esté atento a los vasos principales (seno sagital superior, seno transverso) para evitar sangrado excesivo (Figura 3).
9. Utilice un taladro de alta velocidad para crear un orificio de rebaba separado para el electrodo de referencia de la sonda de silicona, generalmente a ~ 1-2 mm de la ventana craneal.
10. Aplique 0,2 mL de adhesivo de silicona de baja toxicidad en el cráneo para sellar completamente la craneotomía, utilizando el aplicador adjunto.
11. Deje que el mouse se recupere durante aproximadamente 1 h.
12. Fije la cabeza del ratón al equipo de registro de electrofisiología utilizando la placa de cabeza y los tornillos (Figura 2D).
13. Cubra el vástago de la sonda de silicona con el colorante fluorescente DiI (1:4 DiI:Etanol) para que la trayectoria de la sonda pueda reconstruirse después del experimento.
14. Monte la sonda en el manipulador y ajuste el ángulo deseado. Para apuntar al vlPAG, se aplicó un ángulo AP de 15-20°.
15. Baje la sonda de grabación a la superficie del cerebro dentro del centro de la ventana craneal. Primero, inserte manualmente la sonda a una profundidad de ~300 μm. Una vez insertada a esta profundidad, baje lentamente la sonda automáticamente (por ejemplo, 200 μm/min) a la profundidad objetivo para minimizar el daño tisular²¹ (Figura 2C).
    NOTA: Inicialmente se recomienda la inserción manual de la sonda. La inserción manual de la sonda garantiza la capacidad de detener y retraer la sonda en caso de que se doble durante la inserción inicial. Una vez que la sonda penetra completamente en el tejido, generalmente es seguro continuar descendiendo la sonda en modo automático.
16. Aplique aceite mineral a la superficie del cerebro dentro de la ventana de la craneotomía para evitar que se seque.
17. Deje que la sonda de grabación se asiente durante 10 minutos después de la inserción.
18. Registre los datos de la sonda de silicio y ECoG a 30 kHz mediante un controlador de grabación Intan.
19. 1-2 h después del registro, utilice la técnica de perfusión transcárdica para fijar el cerebro en paraformaldehído²² al 4%.
    NOTA: Debido al cemento, puede ser difícil extirpar la parte rostral del cráneo. Es por eso que es preferible extirpar el cerebro extirpando las partes dorsales del cráneo.
20. Decapitar al ratón, cortar la piel siguiendo la línea media en el lado dorsal, desde el cuello hasta la mandíbula inferior. Extirpar los músculos y el tejido adheridos al cráneo, cortar la mandíbula inferior para facilitar el acceso al cerebro.
21. Si la perfusión se realiza correctamente, el cerebro debería encogerse un poco, dejando espacio suficiente para insertar unas finas tijeras en la parte dorsal del foramen magnum. Realice una incisión medial, una corte lateral y una incisión contralateral, de alrededor de 1 mm de tamaño, en el hueso occipital.
22. Retire con cuidado la parte dorsal del cráneo con pinzas oftálmicas. Comience en el hueso occipital, retire todos los fragmentos de cráneo hasta que toda la parte dorsal del cerebro quede expuesta.
23. Deslice una microespátula debajo del cerebro, comenzando en los bulbos olfativos para extraer el cerebro.
24. Una vez perfundido y extraído, el cerebro puede almacenarse en paraformaldehído al 4% a 4 °C durante 24-48 h.

3. Histología para la reconstrucción de la trayectoria de la sonda

1. Secciona el cerebro en secciones coronales de 70 μm usando un vibrátomo.
2. Monte las secciones en portaobjetos utilizando un medio de montaje DAPI que tiñe los núcleos celulares. Cubra y selle los portaobjetos con esmalte de uñas transparente.
3. Tome imágenes de los portaobjetos en un microscopio de fluorescencia. Ajuste el contraste/brillo para que las pistas de la sonda sean claramente visibles. Asegúrese de que el tamaño de los archivos de imagen tiff resultantes sea inferior a 10 MB, de modo que los códigos de MATLAB se ejecuten sin problemas. Reconstruya las pistas de la sonda utilizando un código²³ de MATLAB.

4. Análisis de datos electrofisiológicos

1. Analice las señales neuronales registradas de la sonda de silicio utilizando un software de detección fuera de línea y clasificación automática (Kilosort)²⁴.
2. Clasificar manualmente los clústeres detectados con Phy como unidades múltiples o individuales²⁵. Clasifique los clústeres como unidades individuales cuando tienen una forma de onda de pico fisiológico, muestran un período refractario en el correlacionografía cruzada y una distribución normal de la vista de amplitud.
3. Importe datos unitarios a MATLAB y analice²³.

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Resultados

A cinco machos C57BL/6J se les implantó un auricular ECoG y una placa frontal (Figura 4A). Después de la recuperación, los ratones se habituaron a la fijación de la cabeza y a la plataforma de registro electrofisiológico durante dos sesiones de 1,5 h en días separados (Figura 4B). A continuación, se creó una ventana de craneotomía de 2 mm x 2 mm (Figura 4C) y se insertó una sonda de silico...

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Discusión

Los núcleos del tronco encefálico median funciones fundamentales como la respiración, la conciencia y el sueño 26,27,28. La localización del tronco encefálico (profunda y posterior) presenta un reto a la hora de estudiar su actividad neuronal in vivo utilizando técnicas estándar. Aquí se presenta un abordaje anterior en ángulo para permitir el registro reproducible de una sola...

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Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
1024 channel RHD Recording Controller	Intan Technologies, Los Angeles, California, USA	C3008	Silicon probe recording; recording hardware and software
24 mm x 50 mm No. 1.5 VWR coverslip	VWR, Radnor, Pennsylvania, USA	48393-081	Histology
4% PFA in PBS	ThermoFisher Scientific, Waltham, Massachusetts, USA	J61899.AK	Histology; perfusion solution
C&B metabond	Patterson Dental, Richmond, Virginia, USA	powder: 5533559, quick base: 5533492, catalyst: 55335007	Headplate &Headset Implantation
C57/6J mice 4-6 weeks, males	The Jackson Laboratory, Bar Harbor, Maine, USA	000664
Capnomac Ultima	Datex, Helsinki, Finland	ULT-SVi-27-07	Gas Analyzer; discontinued; alternative gas analyzer can be purchased from Bionet America
CM-DiI	ThermoFisher Scientific, Waltham, Massachusetts, USA	V22888	Red fluorescent dye for coating of the silicon probe
Connector Header	DigiKey, Thief River Falls, Minnesota, USA	1212-1788-ND	ECoG Headset
DAPI Fluoromount-G	SouthernBiotech, Birmingham, Alabama, USA	0100-20	Histology
iBOND Universal	Patterson Dental, Richmond, Virginia, USA	044-1113	Headplate &Headset Implantation; for  securing stainless steel wires to the skull
Low toxicity silicon adhesive	World Precision Instruments, Sarasota, Florida, USA	KWIK-SIL	Headplate
Micro-Manipulator System	New Scale Technologies, Victor, New York, USA	Multi-Probe Manipulator: XYZ Stage Assembly: 06464-0000, MPM System Kit: 06267-3-0001, MPM-Platform-360, MPM ring for MPM Manual Arms, MPM_Ring-72 DEG: 06262-3-0000	Silicon probe recording; inserting the probe into the brain
Microprobes	UCLA, Los Angeles, California, USA	256 ANS, 64M	Discontinued; alternative silicon probes can be purchased from Neuropixels
Mineral Oil	Sigma Aldrich, Saint Luis, Missouri, USA	M8410-100ML	Silicon probe recording; preventing the tissue from drying during the recording
Normal saline	ThermoFisher Scientific, Waltham, Massachusetts, USA	Z1376	Headplate &Headset Implantation; preventing the brain from drying during the surgery
PFA-Coated Stainless Steel Wire-Diameter 0.008 in. coated with striped ends	A-M systems, Sequim, Washington, USA	791400	ECoG Headset & reference electrode for ECoG
Platinum wire 24AWG	World Precision Instruments, Sarasota, Florida, USA	PTP201	Reference electrode for the silicon probe recording
Shandon Colorfrost Plus microscope slides	ThermoFisher Scientific, Waltham, Massachusetts, USA	99-910-01	Histology
Stainless steel Headplate	Star Rapid, China	custom made part	Headplate &Headset Implantation; design available upon request
Stereotaxic apparatus	KOPF, Tujunga, California, USA	Model 940 Small Animal Stereotaxic Instrument with Digital Display Console	Headplate &Headset Implantation