Острая одноединичная многоэлектродная запись из ствола мозга мышей с фиксированной головой

Резюме

Этот протокол описывает метод получения in vivo однонейронных записей высокой плотности из ствола мозга мышей с фиксированной головой. Этот подход используется для измерения потенциала активации нейронов в вентролатеральном периакведукальном сером состоянии - области ствола мозга, неактивной во время быстрого сна (REM) - до и во время общей анестезии.

Аннотация

Записи на основе кремния на основе нескольких электродов становятся все более популярными для изучения нейронной активности при временном разрешении потенциалов действия во многих областях мозга. Тем не менее, запись нейронной активности из глубоких каудальных структур, таких как ствол мозга, с помощью многоканальных зондов остается сложной задачей. Серьезной проблемой является поиск траектории введения зонда, которая позволяет избежать крупных кровеносных сосудов, таких как верхний сагиттальный венозный синус и поперечный венозный синус. Повреждение этих крупных вен может привести к обширному кровотечению, повреждению подлежащей ткани мозга и, возможно, к смерти. Этот подход описывает нацеливание на структуры ствола мозга путем сопряжения передних координат с угловым подходом, что позволяет записывающему зонду проникать в мозг ниже сосудистых структур высокого риска. По сравнению со строго вертикальным подходом, угловой подход максимизирует количество областей мозга, которые могут быть нацелены. Используя эту стратегию, можно воспроизводимо и надежно получить доступ к вентролатеральному периакведутокальному серому (vlPAG), области ствола мозга, связанной с быстрым сном, для получения однокомпонентных многоэлектродных записей у мышей с фиксированной головой до и во время анестезии севофлураном. Возможность регистрировать активность нейронов в vlPAG и окружающих ядрах с высоким временным разрешением является шагом вперед в понимании взаимосвязи между быстрым сном и анестезией.

Введение

Записи на основе кремниевых мультиэлектродов становятся все более популярными для измерения нейронной активности во многих областях мозга с разрешением потенциала одиночного действия 1,2,3,4. За последнее десятилетие технологии записи с высокой плотностью значительно выросли. Современные записывающие электроды на основе кремния могут работать с большим количеством каналов, оптическими волокнами и записывающими устройствами электрокортикографии (ЭКоГ) ^5,6. Более того, хроническая имплантация этих электродов позволяет проводить длительные записи ^7,8.

Несмотря на последние технологические достижения, воздействие на глубокие каудальные структуры, такие как ствол мозга, с помощью многоканальных зондов остается сложной задачей. При нацеливании на структуры ствола мозга, такие как вентролатеральный периакqueductal gray (vlPAG), одним из существенных препятствий является определение траектории зонда, которая избегает крупных кровеносных сосудов, например, верхнего сагиттального венозного синуса и поперечного венозного синуса. Повреждение этих крупных вен может вызвать обширное кровотечение, повреждение подлежащей ткани мозга и даже летальный исход ^9,10. Мы предлагаем нацеливаться на структуры ствола мозга от передних координат под углом, что позволяет записывающему зонду проникать в мозг ниже таких сосудистых структур высокого риска (см. рис. 1). Такой угловой подход, по сравнению с вертикальным, максимизирует количество областей мозга, доступных для записи. Кроме того, в экспериментальных условиях, когда желательны записи ЭКоГ, наклонный передний доступ обеспечивает большую поверхность черепа, доступную для имплантации гарнитуры ЭКоГ, поскольку краниотомическое окно для введения зонда расположено более кпередо^10,11.

Идентификация конкретных групп клеток и цепей, ответственных за вызванные анестезией изменения быстрого сна, остается основной целью исследований в области анестезии. Таким образом, целью здесь был воспроизводимый и надежный доступ к vlPAG - области ствола мозга, связанной с быстрым сном - для получения однокомпонентных многоэлектродных записей у мышей с фиксированной головой до и во время анестезии севофлураном^12,13. В предыдущих исследованиях использовались электрофизиологические измерения потенциала локального поля (LFP) vlPAG у бодрствующих мышей для выявления изменений состояния нейронов, связанных с анестезией^14,15. Тем не менее, измерения LFP в первую очередь чувствительны к синаптической активности, а не к потенциалам действия, в пределах регистрируемой области¹⁶. Следовательно, остается ограниченное понимание того, как анестетики напрямую влияют на паттерны нейронной активности, производимые нейронами vlPAG. В данной работе описан метод получения однонейронных записей высокой плотности из ствола мозга мышей с фиксированной головой. Этот метод также может быть адаптирован для регистрации активности одиночных нейронов из различных других глубоких и задних структур ствола мозга.

протокол

Все исследования были одобрены Комитетом по институциональному уходу за животными и их использованию в Университете Вирджинии (Шарлоттсвилль, штат Вирджиния). Использовали пять самцов мышей C57BL/6J в возрасте 3-7 месяцев массой 25-30 г. Подробная информация о реагентах и используемом оборудовании приведена в Таблице материалов.

1. Имплантация оголовья и гарнитуры

1. Изготовьте гарнитуру ECoG, припаяв провод из нержавеющей стали с покрытием перфторалкокси (PFA) к 3-контактному разъему разъема (рис. 2A).
2. Определение координат вставки на основе стереотаксического атласа^{мыши 17}. Использование теоремы Пифагора для расчета угла и глубины введения зонда, особенно когда в литературе мало информации, является разумной отправной точкой (Рисунок 1)¹⁸.
   ПРИМЕЧАНИЕ: В конечном счете, координаты будут корректироваться методом проб и ошибок. Для наведения на vlPAG у взрослых мышей использовали следующие координаты: переднезаднюю (AP) -3,6 мм, медиолатеральную (ML) +0,5 мм, дорсовентральную (DV) -4 мм. Щуп был введен под углом 20° (AP).
3. Вызвать общую анестезию, поместив мышь в индукционную камеру (1,5%-3% изофлурана в кислороде). После обезболивания поместите мышь в стереотаксическую рамку, поместив нос животного в носовой конус и стабилизируя голову с помощью перекладин для головы.
4. Нанесите офтальмологическую мазь на глаза, чтобы предотвратить повреждение роговицы. Используйте систему контроля температуры для поддержания температуры тела на уровне 37 °C.
5. Нанесите крем для эпиляции или сбрейте шерсть на кожу головы, затем продезинфицируйте повидон-йодом и 70% спиртом. Используйте асептическую технику «только наконечники» для поддержания стерильности операционного поля.
6. Проведите тест на защемление пальцев ног, чтобы проверить глубину анестезии.
7. Обезболивание: карпрофен 2,5 мг/кг, вводится подкожно в спину.
8. Сделайте разрез кожи головы диаметром 5 мм, чтобы удалить круглый участок кожи над теменной и затылочной костями. Аккуратно удалите мозговые оболочки, соскоблив их лезвием скальпеля.
9. С помощью лезвия скальпеля разрежьте мышечные прикрепления и обнажите теменные и затылочные кости¹⁹. Применяйте перекись водорода по мере необходимости, чтобы остановить кровотечение и высушить поверхность черепа. Очень важно нанести стоматологический цемент и смолу на сухой череп для достижения прочного соединения.
10. Во-первых, определите брегму и лямбду ориентиры на черепе²⁰. Затем отрегулируйте положение носового конуса, чтобы выровнять передне-заднее положение черепа, убедившись, что разница в высоте между двумя ориентирами не превышает 100 мкм.
11. Чтобы выровнять медиально-латеральное положение черепа, выберите две противоположные точки между брегмой и лямбдой, каждая из которых находится на расстоянии 1 мм от сагиттального шва, и проверьте их уровень. Если разница в высоте между ними превышает 100 мкм, отрегулируйте медиально-латеральное положение черепа, манипулируя головными брусьями.
12. Измерьте расстояние между брегмой и лямбдой и сравните его с расстоянием, указанным в стереотаксическом атласе Франклина-Паксиноса (обычно 4,2 мм)¹⁷. Используйте разницу между измеренным и сообщенным расстояниями для пропорционального масштабирования координаты точки доступа. Отметьте координаты трепанации черепа на черепе стерилизованным карандашом.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Если измеренное расстояние брегма-лямбда отличается от 4,2 мм, то координаты необходимо масштабировать пропорционально. Все координаты AP, указанные в стереотаксическом атласе, соответствуют стандартизированному расстоянию брегма-лямбда. Поскольку размер мышиного черепа вариален, важно соответствующим образом настроить свои координаты.
13. С помощью стереотаксического микроманипулятора расположите оголовье непосредственно поверх лямбда-шва и закрепите его на черепе, наложив стоматологический цемент на оголовье и вокруг него (рис. 3A, B). Дайте цементу высохнуть не менее 10 минут.
14. Просверлите отверстия для заусенцев (0,5 мм в диаметре) для двух кортикальных электродов (лобной и теменной коры) и для одного, который будет служить электродом сравнения (мозжечок). Поместите зачищенные концы (0,5 мм) электродов из серебряной проволоки с покрытием в отверстия для заусенцев и закрепите с помощью смолы, активируемой ультрафиолетовым светом.
15. Полностью покройте проволоку из нержавеющей стали с покрытием стоматологическим цементом, чтобы ни одна проволока не обнажалась. Покройте нижнюю и боковые стороны гарнитуры стоматологическим цементом, чтобы она надежно закрепилась на месте. Убедитесь, что шовные нити брегмы и лямбды остаются видимыми после того, как гарнитура будет закреплена на месте (рис. 2B).
16. Дайте мыши восстановиться в течение как минимум 7 дней, ежедневно осматривайте животное и место операции на предмет каких-либо нарушений. При необходимости вводите анальгетики (Карпрофен 2,5 мг/кг,/к).

2. Размещение и запись силиконового зонда

1. Приучите мышь к записывающему устройству и фиксации головы (не менее 1,5 ч в два отдельных дня) (Рисунок 2D).
2. В день записи поместите мышь в анестезиологическую камеру (изофлуран 1,5%-3% в кислороде).
3. Расположите мышь в стереотаксической рамке, отрегулируйте носовой обтекатель и перекладины головы, как описано в 1.3. Поддерживайте анестезию (изофлуран 1,5%-3% кислорода) на протяжении всей стереотаксической операции. Проведите тест на защемление пальцев ног, чтобы проверить глубину анестезии.
4. Наносите офтальмологическую мазь на глаза и поддерживайте достаточную температуру тела.
5. Определите брегму и лямбду, убедившись, что разница в высоте между двумя анатомическими ориентирами не превышает 100 мкм.
6. Найдите и отметьте вычисленные координаты на черепе стерильным карандашом, затем создайте контур окна трепанации черепа размером 2 мм х 2 мм вокруг координат.
7. Проведите тест на защемление пальцев ног, чтобы проверить глубину анестезии.
8. С помощью высокоскоростного сверла создайте окно для трепанации черепа размером 2 мм x 2 мм. Нанесите 0,5-1 мл физиологического раствора, чтобы предотвратить высыхание поверхности мозга. Удалите твердую мозговую оболочку с помощью иглы шприца и тонких щипцов.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Следите за крупными сосудами (верхний сагиттальный синус, поперечный синус), чтобы избежать чрезмерного кровотечения (Рисунок 3).
9. С помощью высокоскоростного сверла создайте отдельное отверстие для заусенцев для электрода сравнения силиконового зонда, обычно на расстоянии ~1-2 мм от краниального окна.
10. Нанесите 0,2 мл малотоксичного силиконового клея на череп, чтобы полностью закрыть трепанацию черепа, с помощью прилагаемого аппликатора.
11. Дайте мыши восстановиться в течение примерно 1 часа.
12. Прикрепите головку мыши к электрофизиологическому регистрирующему стенду с помощью оголовья и винтов (рис. 2D).
13. Покройте кремниевый хвостовик зонда флуоресцентным красителем DiI (1:4 DiI:Ethanol), чтобы траекторию зонда можно было реконструировать после эксперимента.
14. Установите щуп на манипулятор и установите нужный угол. Для наведения vlPAG применялся угол AP 15-20°.
15. Опустите записывающий зонд на поверхность мозга в центре черепного окна. Сначала вручную вставьте щуп на глубину ~300 мкм. После введения на эту глубину медленно опустите зонд автоматически (например, на 200 мкм/мин) на заданную глубину, чтобы свести к минимуму повреждение тканей²¹ (рисунок 2C).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Первоначально рекомендуется вводить щуп вручную. Ручное введение датчика обеспечивает возможность остановки и втягивания датчика в случае его изгиба при первоначальном введении. После того, как зонд полностью проникнет в ткань, как правило, безопасно продолжать опускание зонда в автоматическом режиме.
16. Нанесите минеральное масло на поверхность мозга в пределах окна трепанации черепа, чтобы предотвратить высыхание.
17. Дайте записывающему щупу отстояться в течение 10 минут после введения.
18. Записывайте данные с кремниевого зонда и ЭКГ на частоте 30 кГц с помощью записывающего контроллера Intan.
19. Через 1-2 ч после записи используйте технику транскардиальной перфузии для фиксации мозга в 4% параформальдегида²².
    ПРИМЕЧАНИЕ: Из-за цемента может быть трудно удалить ростральную часть черепа. Вот почему предпочтительнее иссекать мозг путем удаления дорсальных частей черепа.
20. Обезглавите мышь, разрежьте кожу по средней линии на спинной стороне, от шеи до нижней челюсти. Удалите мышцы и ткани, прикрепленные к черепу, отрежьте нижнюю челюсть для более легкого доступа к мозгу.
21. Если перфузия выполнена правильно, мозг должен немного сузиться, оставив достаточно места для вставки тонких ножниц в дорсальную часть большого затылочного отверстия. Сделайте один медиальный надрез, один боковой и один контралатеральный надрез размером около 1 мм в затылочной кости.
22. Аккуратно удалите тыльную часть черепа с помощью офтальмологических щипцов. Начните с затылочной кости, удалите все фрагменты черепа до тех пор, пока не обнажится вся дорсальная часть мозга.
23. Проведите микрошпателем под мозг, начиная с обонятельных луковиц, чтобы вычерпать мозг.
24. После перфузии и удаления мозг может храниться в 4% параформальдегиде при 4 °C в течение 24-48 часов.

3. Гистология для реконструкции траектории зонда

1. Разрез мозга на корональные участки по 70 мкм с помощью вибратома.
2. Закрепите секции на предметных стеклах с помощью монтажной среды DAPI, которая окрашивает ядра клеток. Закройте слайд и заклейте горки прозрачным лаком для ногтей.
3. Изобразите предметные стекла на флуоресцентном микроскопе. Отрегулируйте контрастность/яркость так, чтобы следы щупа были четко видны. Убедитесь, что размер результирующего файла изображения tiff меньше 10 МБ, чтобы коды MATLAB работали без проблем. Восстановите треки зонда с помощью кода MATLAB²³.

4. Анализ электрофизиологических данных

1. Анализируйте записанные нейронные сигналы от кремниевого зонда с помощью автономного программного обеспечения для обнаружения и автоматической сортировки (Kilosort)²⁴.
2. Классификация обнаруженных кластеров с помощью Phy вручную как много- или одиночных блоков²⁵. Классифицируйте кластеры как отдельные единицы, если они имеют физиологическую форму волны спайка, демонстрируют рефрактерный период в перекрестной коррелограмме и нормальное распределение амплитудного представления.
3. Импорт данных об отдельных единицах измерения в MATLAB и анализ²³.

Результаты

Пятерым мужчинам C57BL/6J были имплантированы ЭКоГ-гарнитура и оголовье (Рисунок 4A). После выздоровления мышей приучили к фиксации головы и электрофизиологической регистрирующей установке в течение двух сеансов по 1,5 часа в разные дни (рис. 4B

Обсуждение

Ядра ствола мозга опосредуют основные функции, такие как дыхание, сознание и сон 26,27,28. Расположение ствола мозга (глубоко и сзади) представляет собой проблему для изучения его нейронной активности in vivo с использо...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
1024 channel RHD Recording Controller	Intan Technologies, Los Angeles, California, USA	C3008	Silicon probe recording; recording hardware and software
24 mm x 50 mm No. 1.5 VWR coverslip	VWR, Radnor, Pennsylvania, USA	48393-081	Histology
4% PFA in PBS	ThermoFisher Scientific, Waltham, Massachusetts, USA	J61899.AK	Histology; perfusion solution
C&B metabond	Patterson Dental, Richmond, Virginia, USA	powder: 5533559, quick base: 5533492, catalyst: 55335007	Headplate &Headset Implantation
C57/6J mice 4-6 weeks, males	The Jackson Laboratory, Bar Harbor, Maine, USA	000664
Capnomac Ultima	Datex, Helsinki, Finland	ULT-SVi-27-07	Gas Analyzer; discontinued; alternative gas analyzer can be purchased from Bionet America
CM-DiI	ThermoFisher Scientific, Waltham, Massachusetts, USA	V22888	Red fluorescent dye for coating of the silicon probe
Connector Header	DigiKey, Thief River Falls, Minnesota, USA	1212-1788-ND	ECoG Headset
DAPI Fluoromount-G	SouthernBiotech, Birmingham, Alabama, USA	0100-20	Histology
iBOND Universal	Patterson Dental, Richmond, Virginia, USA	044-1113	Headplate &Headset Implantation; for  securing stainless steel wires to the skull
Low toxicity silicon adhesive	World Precision Instruments, Sarasota, Florida, USA	KWIK-SIL	Headplate
Micro-Manipulator System	New Scale Technologies, Victor, New York, USA	Multi-Probe Manipulator: XYZ Stage Assembly: 06464-0000, MPM System Kit: 06267-3-0001, MPM-Platform-360, MPM ring for MPM Manual Arms, MPM_Ring-72 DEG: 06262-3-0000	Silicon probe recording; inserting the probe into the brain
Microprobes	UCLA, Los Angeles, California, USA	256 ANS, 64M	Discontinued; alternative silicon probes can be purchased from Neuropixels
Mineral Oil	Sigma Aldrich, Saint Luis, Missouri, USA	M8410-100ML	Silicon probe recording; preventing the tissue from drying during the recording
Normal saline	ThermoFisher Scientific, Waltham, Massachusetts, USA	Z1376	Headplate &Headset Implantation; preventing the brain from drying during the surgery
PFA-Coated Stainless Steel Wire-Diameter 0.008 in. coated with striped ends	A-M systems, Sequim, Washington, USA	791400	ECoG Headset & reference electrode for ECoG
Platinum wire 24AWG	World Precision Instruments, Sarasota, Florida, USA	PTP201	Reference electrode for the silicon probe recording
Shandon Colorfrost Plus microscope slides	ThermoFisher Scientific, Waltham, Massachusetts, USA	99-910-01	Histology
Stainless steel Headplate	Star Rapid, China	custom made part	Headplate &Headset Implantation; design available upon request
Stereotaxic apparatus	KOPF, Tujunga, California, USA	Model 940 Small Animal Stereotaxic Instrument with Digital Display Console	Headplate &Headset Implantation