Gravações agudas de vários eletrodos de unidade única do tronco encefálico de camundongos com cabeça fixa

Resumo

Este protocolo descreve um método para obter gravações in vivo de neurônio único de alta densidade do tronco cerebral de camundongos com cabeça fixa. Essa abordagem é implantada para medir o potencial de ação disparado de neurônios no cinza periaquedutal ventrolateral - uma região do tronco encefálico inativa durante o sono REM (Rapid Eye Movement) - antes e durante a anestesia geral.

Resumo

As gravações baseadas em multieletrodos de silício são cada vez mais populares para estudar a atividade neuronal na resolução temporal dos potenciais de ação em muitas regiões do cérebro. No entanto, o registro da atividade neuronal de estruturas caudais profundas, como o tronco encefálico, usando sondas multicanal continua sendo um desafio. Uma preocupação significativa é encontrar uma trajetória para a inserção da sonda que evite grandes vasos sanguíneos, como o seio venoso sagital superior e o seio venoso transverso. Ferir essas veias grandes pode causar sangramento extenso, danos ao tecido cerebral subjacente e potencialmente a morte. Essa abordagem descreve o direcionamento de estruturas do tronco encefálico acoplando coordenadas anteriores com uma abordagem angular, permitindo que a sonda de registro penetre no cérebro abaixo de estruturas vasculares de alto risco. Em comparação com uma abordagem estritamente vertical, a abordagem angular maximiza o número de regiões cerebrais que podem ser direcionadas. Usando essa estratégia, o cinza periaquedutal ventrolateral (vlPAG), uma região do tronco encefálico associada ao sono REM, pode ser acessado de forma reprodutível e confiável para obter registros de unidade única e vários eletrodos em camundongos com cabeça fixa antes e durante a anestesia com sevoflurano. A capacidade de registrar a atividade neuronal no vlPAG e nos núcleos circundantes com alta resolução temporal é um passo à frente no avanço da compreensão da relação entre o sono REM e a anestesia.

Introdução

As gravações baseadas em multieletrodos de silício estão se tornando cada vez mais populares para medir a atividade neuronal em muitas regiões do cérebro com resolução de potencial de ação única 1,2,3,4. Na última década, a tecnologia de gravação de alta densidade cresceu consideravelmente. Os eletrodos de registro atuais à base de silício podem acomodar altas contagens de canais, fibras ópticas e dispositivos de registro de eletrocorticografia (ECoG) ^5,6<....

Protocolo

Todos os estudos foram aprovados pelo Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais da Universidade da Virgínia (Charlottesville, Virgínia). Foram utilizados cinco camundongos C57BL/6J machos, com idade entre 3 e 7 meses, pesando 25-30 g. Os detalhes dos reagentes e do equipamento usado aqui estão listados na Tabela de Materiais.

1. Implantação de placa de cabeça e fone de ouvido

1. Faça um fone de ouvido ECoG soldando fio de aço inoxidável revestido com perfluoroalcoxi (PFA) a um conector de 3 pinos (Figura 2A).
2. Identifiqu....

Discussão

Os núcleos do tronco encefálico medeiam funções fundamentais como respiração, consciência e sono 26,27,28. A localização do tronco cerebral (profundo e posterior) apresenta um desafio no estudo de sua atividade neuronal in vivo usando técnicas padrão. Aqui, uma abordagem anterior angular é apresentada para permitir o registro reprodutível de unidade única em camundongos co.......

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
1024 channel RHD Recording Controller	Intan Technologies, Los Angeles, California, USA	C3008	Silicon probe recording; recording hardware and software
24 mm x 50 mm No. 1.5 VWR coverslip	VWR, Radnor, Pennsylvania, USA	48393-081	Histology
4% PFA in PBS	ThermoFisher Scientific, Waltham, Massachusetts, USA	J61899.AK	Histology; perfusion solution
C&B metabond	Patterson Dental, Richmond, Virginia, USA	powder: 5533559, quick base: 5533492, catalyst: 55335007	Headplate &Headset Implantation
C57/6J mice 4-6 weeks, males	The Jackson Laboratory, Bar Harbor, Maine, USA	000664
Capnomac Ultima	Datex, Helsinki, Finland	ULT-SVi-27-07	Gas Analyzer; discontinued; alternative gas analyzer can be purchased from Bionet America
CM-DiI	ThermoFisher Scientific, Waltham, Massachusetts, USA	V22888	Red fluorescent dye for coating of the silicon probe
Connector Header	DigiKey, Thief River Falls, Minnesota, USA	1212-1788-ND	ECoG Headset
DAPI Fluoromount-G	SouthernBiotech, Birmingham, Alabama, USA	0100-20	Histology
iBOND Universal	Patterson Dental, Richmond, Virginia, USA	044-1113	Headplate &Headset Implantation; for  securing stainless steel wires to the skull
Low toxicity silicon adhesive	World Precision Instruments, Sarasota, Florida, USA	KWIK-SIL	Headplate
Micro-Manipulator System	New Scale Technologies, Victor, New York, USA	Multi-Probe Manipulator: XYZ Stage Assembly: 06464-0000, MPM System Kit: 06267-3-0001, MPM-Platform-360, MPM ring for MPM Manual Arms, MPM_Ring-72 DEG: 06262-3-0000	Silicon probe recording; inserting the probe into the brain
Microprobes	UCLA, Los Angeles, California, USA	256 ANS, 64M	Discontinued; alternative silicon probes can be purchased from Neuropixels
Mineral Oil	Sigma Aldrich, Saint Luis, Missouri, USA	M8410-100ML	Silicon probe recording; preventing the tissue from drying during the recording
Normal saline	ThermoFisher Scientific, Waltham, Massachusetts, USA	Z1376	Headplate &Headset Implantation; preventing the brain from drying during the surgery
PFA-Coated Stainless Steel Wire-Diameter 0.008 in. coated with striped ends	A-M systems, Sequim, Washington, USA	791400	ECoG Headset & reference electrode for ECoG
Platinum wire 24AWG	World Precision Instruments, Sarasota, Florida, USA	PTP201	Reference electrode for the silicon probe recording
Shandon Colorfrost Plus microscope slides	ThermoFisher Scientific, Waltham, Massachusetts, USA	99-910-01	Histology
Stainless steel Headplate	Star Rapid, China	custom made part	Headplate &Headset Implantation; design available upon request
Stereotaxic apparatus	KOPF, Tujunga, California, USA	Model 940 Small Animal Stereotaxic Instrument with Digital Display Console	Headplate &Headset Implantation