Akute Einzel-Multi-Elektroden-Ableitungen aus dem Hirnstamm von Mäusen mit fixiertem Kopf

Zusammenfassung

Dieses Protokoll beschreibt eine Methode, um in vivo Einzelneuronen-Aufzeichnungen mit hoher Dichte aus dem Hirnstamm von kopffixierten Mäusen zu erhalten. Dieser Ansatz wird eingesetzt, um das Aktionspotentialfeuer von Neuronen im ventrolateralen periaquäduktalen Grau - einer Hirnstammregion, die während des REM-Schlafs (Rapid Eye Movement) inaktiv ist - vor und während der Vollnarkose zu messen.

Zusammenfassung

Silizium-Multielektroden-basierte Aufzeichnungen werden immer beliebter, um die neuronale Aktivität bei der zeitlichen Auflösung von Aktionspotentialen in vielen Hirnregionen zu untersuchen. Die Aufzeichnung der neuronalen Aktivität von tiefen kaudalen Strukturen wie dem Hirnstamm mit Mehrkanalsonden bleibt jedoch eine Herausforderung. Ein wesentliches Anliegen ist es, einen Pfad für das Einführen der Sonde zu finden, der große Blutgefäße wie den oberen sagittalen Venensinus und den transversalen Venensinus vermeidet. Eine Verletzung dieser großen Venen kann zu starken Blutungen, Schäden am darunter liegenden Hirngewebe und möglicherweise zum Tod führen. Dieser Ansatz beschreibt das Targeting von Hirnstammstrukturen, indem anteriore Koordinaten mit einem abgewinkelten Ansatz gekoppelt werden, wodurch die Aufzeichnungssonde das Gehirn unterhalb von Gefäßstrukturen mit hohem Risiko durchdringen kann. Im Vergleich zu einem streng vertikalen Ansatz maximiert der abgewinkelte Ansatz die Anzahl der Gehirnregionen, die anvisiert werden können. Mit dieser Strategie kann reproduzierbar und zuverlässig auf das ventrolaterale periaquäduktale Grau (vlPAG), eine Hirnstammregion, die mit dem REM-Schlaf assoziiert ist, zugegriffen werden, um Einzel-, Mehrelektroden-Aufzeichnungen bei Mäusen mit fixiertem Kopf vor und während der Sevofluran-Anästhesie zu erhalten. Die Möglichkeit, die neuronale Aktivität im vlPAG und den umgebenden Kernen mit hoher zeitlicher Auflösung aufzuzeichnen, ist ein Schritt nach vorne, um das Verständnis der Beziehung zwischen REM-Schlaf und Anästhesie zu verbessern.

Einleitung

Silizium-Multielektroden-basierte Aufzeichnungen werden immer beliebter, um die neuronale Aktivität in vielen Gehirnregionen mit einer Auflösung von Einzelaktionspotentialen^{zu messen 1,2,3,4}. In den letzten zehn Jahren hat die High-Density-Recording-Technologie erheblich zugenommen. Aktuelle Aufzeichnungselektroden auf Silizium können hohe Kanalzahlen, optische Fasern und Elektrokortikographie-Aufzeichnungsgeräte (ECoG) aufnehmen ^5,6. Darüber hinaus ermöglicht die chronische Implantation dieser Elektroden Langzeitaufzeichnungen ^7,8.

Trotz der jüngsten technologischen Fortschritte bleibt es eine Herausforderung, tiefe kaudale Strukturen wie den Hirnstamm mit Mehrkanalsonden zu erreichen. Bei der Ausrichtung auf Hirnstammstrukturen wie das ventrolaterale periakquäduktale Grau (vlPAG) besteht ein wesentliches Hindernis darin, eine Sondentrajektorie zu identifizieren, die wichtige Blutgefäße vermeidet, z. B. den Sinus sagittalis superior und den venösen Sinus transversal. Eine Verletzung dieser großen Venen kann zu starken Blutungen, Schäden am darunter liegenden Hirngewebe und sogar zum Tod führen ^9,10. Wir schlagen vor, Hirnstammstrukturen von anterioren Koordinaten aus in einem Winkel anzuvisieren, so dass die Aufzeichnungssonde das Gehirn unterhalb solcher hochriskanten Gefäßstrukturen durchdringen kann (siehe Abbildung 1). Dieser abgewinkelte Ansatz maximiert im Vergleich zu einem vertikalen Ansatz die Anzahl der Gehirnregionen, die für die Aufzeichnung zugänglich sind. Darüber hinaus bietet der abgewinkelte anteriore Zugang unter experimentellen Bedingungen, in denen ECoG-Aufzeichnungen gewünscht sind, mehr Schädeloberfläche für die Implantation des ECoG-Headsets, da das Kraniotomiefenster für das Einführen der Sonde weiter nach vorne positioniert ist^10,11.

Die Identifizierung der spezifischen Zellgruppen und Schaltkreise, die für anästhesieinduzierte REM-Schlafveränderungen verantwortlich sind, bleibt ein wichtiges Ziel der Anästhesieforschung. Daher bestand das Ziel darin, reproduzierbar und zuverlässig auf das vlPAG - eine Hirnstammregion, die mit dem REM-Schlaf assoziiert ist - zuzugreifen, um Einzel-Mehrelektroden-Aufzeichnungen in Maus mit fixiertem Kopf vor und während der Sevofluran-Anästhesie zu erhalten^12,13. Frühere Studien haben elektrophysiologische LFP-Messungen (Local Field Potential) des vlPAG bei wachen Mäusen verwendet, um Veränderungen des neuronalen Zustands im Zusammenhang mit der Anästhesie zu identifizieren^14,15. LFP-Messungen sind jedoch in erster Linie empfindlich gegenüber synaptischer Aktivität, nicht auf Aktionspotentialen, innerhalb des aufgezeichneten Bereichs¹⁶. Folglich gibt es nach wie vor ein begrenztes Verständnis darüber, wie Anästhetika die von vlPAG-Neuronen produzierten neuronalen Aktivitätsmuster direkt beeinflussen. Hier wird ein Verfahren beschrieben, um High-Density-Einzelneuronen-Ableitungen aus dem Hirnstamm von kopffixierten Mäusen zu erhalten. Diese Methode kann auch angepasst werden, um die Aktivität einzelner Neuronen aus verschiedenen anderen tiefen und hinteren Hirnstammstrukturen aufzuzeichnen.

Protokoll

Alle Studien wurden vom Institutional Animal Care and Use Committee der University of Virginia (Charlottesville, Virginia) genehmigt. Es wurden fünf männliche C57BL/6J-Mäuse im Alter von 3-7 Monaten mit einem Gewicht von 25-30 g verwendet. Die Details zu den hier verwendeten Reagenzien und Geräten sind in der Materialtabelle aufgeführt.

1. Implantation der Kopfplatte und des Headsets

1. Stellen Sie ein ECoG-Headset her, indem Sie einen mit Perfluoralkoxy (PFA) beschichteten Edelstahldraht an eine 3-polige Steckerleiste löten (Abbildung 2A).
2. Identifizieren Sie die Einfügekoordinaten anhand eines stereotaktischen Atlas¹⁷ der Maus. Die Verwendung des Satzes des Pythagoras zur Berechnung des Winkels und der Tiefe der Sondeneinführung - insbesondere wenn es nur wenige Informationen in der Literatur gibt - ist ein vernünftiger Ausgangspunkt (Abbildung 1)¹⁸.
   HINWEIS: Letztendlich werden die Koordinaten durch Versuch und Irrtum angepasst. Um den vlPAG zu bestimmen, wurden bei adulten Mäusen die folgenden Koordinaten verwendet: anteroposterior (AP) -3,6 mm, mediolateral (ML) +0,5 mm, dorsoventral (DV) -4 mm. Die Sonde wurde in einem Winkel von 20° (AP) eingeführt.
3. Induzieren Sie eine Vollnarkose, indem Sie die Maus in die Induktionskammer legen (1,5%-3% Isofluran in Sauerstoff). Nach der Betäubung positionieren Sie die Maus im stereotaktischen Rahmen, platzieren Sie die Nase des Tieres im Nasenkegel und stabilisieren Sie den Kopf mit Kopfstangen.
4. Tragen Sie eine Augensalbe auf die Augen auf, um Hornhautschäden zu vermeiden. Verwenden Sie ein Temperaturkontrollsystem, um die Körpertemperatur auf 37 °C zu halten.
5. Tragen Sie Haarentfernungscreme oder Rasierfell auf die Kopfhaut auf und desinfizieren Sie sie mit Povidon, Jod und 70% Alkohol. Verwenden Sie die aseptische Technik "Nur Spitzen", um ein steriles Operationsfeld zu erhalten.
6. Führen Sie einen Zehenquetschtest durch, um die Tiefe der Anästhesie zu überprüfen.
7. Analgesie verabreichen: Carprofen 2,5 mg/kg, subkutan in den Rücken verabreicht.
8. Machen Sie einen 5 mm großen Schnitt an der Kopfhaut, um einen kreisförmigen Hautfleck über dem Scheitel- und Hinterhauptbein zu entfernen. Entfernen Sie vorsichtig die Hirnhäute, indem Sie sie mit der Skalpellklinge abkratzen.
9. Mit der Skalpellklinge Muskelansätze durchtrennen und die Scheitel- und Hinterhauptknochen freilegen¹⁹. Tragen Sie bei Bedarf Wasserstoffperoxid auf, um Blutungen zu kontrollieren und die Schädeloberfläche zu trocknen. Es ist wichtig, Zahnzement und Harz auf den trockenen Schädel aufzutragen, um eine starke Verbindung zu erreichen.
10. Identifizieren Sie zunächst die Bregma- und Lambda-Landmarken auf dem Schädel²⁰. Passen Sie dann die Position des Nasenkonus an, um die anterior-hintere Position des Schädels zu nivellieren, wobei Sie sicherstellen, dass zwischen den beiden Landmarken kein Höhenunterschied von mehr als 100 μm besteht.
11. Um die medial-laterale Position des Schädels zu nivellieren, wählen Sie zwei gegenüberliegende Punkte zwischen Bregma und Lambda, die jeweils 1 mm von der sagittalen Naht entfernt sind, und überprüfen Sie deren Höhe. Wenn zwischen ihnen ein Höhenunterschied von mehr als 100 μm besteht, passen Sie die medial-laterale Position des Schädels an, indem Sie die Kopfstangen manipulieren.
12. Messen Sie den Abstand zwischen Bregma und Lambda und vergleichen Sie ihn mit dem im stereotaktischen Atlas von Franklin-Paxinos angegebenen Abstand (normalerweise 4,2 mm)¹⁷. Verwenden Sie die Differenz zwischen den gemessenen und den gemeldeten Entfernungen, um Ihre AP-Koordinate proportional zu skalieren. Markieren Sie die Kraniotomie-Koordinaten mit einem sterilisierten Bleistift auf dem Schädel.
    HINWEIS: Wenn der gemessene Bregma-Lambda-Abstand von 4,2 mm abweicht, müssen die Koordinaten proportional skaliert werden. Alle AP-Koordinaten, die in einem stereotaktischen Atlas angegeben sind, entsprechen einer standardisierten Bregma-Lambda-Entfernung. Da die Größe eines Mäuseschädels variabel ist, ist es wichtig, dass Sie Ihre Koordinaten entsprechend anpassen.
13. Positionieren Sie die Kopfplatte mit einem stereotaktischen Mikromanipulator direkt auf der Lambda-Naht und befestigen Sie sie am Schädel, indem Sie Zahnzement auf die Kopfplatte und um sie herum auftragen (Abbildung 3A, B). Lassen Sie den Zement mindestens 10 Minuten trocknen.
14. Bohren Sie Bohrlöcher (0,5 mm Durchmesser) für zwei kortikale Elektroden (frontaler und parietaler Kortex) und für eine, die als Referenzelektrode dient (Kleinhirn). Legen Sie die abisolierten Enden (0,5 mm) der beschichteten Silberdrahtelektroden in die Gratlöcher und befestigen Sie sie mit UV-Licht-aktiviertem Harz.
15. Decken Sie die beschichteten Edelstahldrähte vollständig mit Zahnzement ab, so dass kein Draht freiliegt. Decken Sie die Unterseite und die Seiten des Steuersatzes mit Zahnzement ab, damit er fest sitzt. Stellen Sie sicher, dass die Bregma- und Lambda-Nähte sichtbar bleiben, sobald das Headset befestigt ist (Abbildung 2B).
16. Lassen Sie die Maus mindestens 7 Tage lang genesen, untersuchen Sie das Tier und die Operationsstelle täglich auf Unregelmäßigkeiten. Verabreichen Sie bei Bedarf Analgetika (Carprofen 2,5 mg/kg, SC).

2. Platzierung und Aufzeichnung der Silikonsonde

1. Gewöhnen Sie die Maus an das Aufnahme-Rig und die Kopffixierung (mindestens 1,5 Stunden an zwei verschiedenen Tagen) (Abbildung 2D).
2. Legen Sie die Maus am Tag der Aufzeichnung in die Anästhesiekammer (Isofluran 1,5%-3% in Sauerstoff).
3. Positionieren Sie die Maus in einem stereotaktischen Rahmen, passen Sie den Nasenkonus und die Kopfstangen wie in 1.3 beschrieben an. Halten Sie die Anästhesie (Isofluran 1,5 % -3 % Sauerstoff) während der gesamten stereotaktischen Operation aufrecht. Führen Sie einen Zehenquetschtest durch, um die Tiefe der Anästhesie zu überprüfen.
4. Tragen Sie eine Augensalbe auf die Augen auf und halten Sie eine angemessene Körpertemperatur aufrecht.
5. Identifizieren Sie Bregma und Lambda und stellen Sie sicher, dass zwischen den beiden anatomischen Orientierungspunkten kein Höhenunterschied von mehr als 100 μm besteht.
6. Suchen und markieren Sie die berechneten Koordinaten mit einem sterilen Bleistift auf dem Schädel und erstellen Sie dann einen Umriss des 2 mm x 2 mm großen Kraniotomiefensters um die Koordinaten.
7. Führen Sie einen Zehenquetschtest durch, um die Narkosetiefe zu überprüfen.
8. Verwenden Sie einen Hochgeschwindigkeitsbohrer, um ein 2 mm x 2 mm großes Kraniotomiefenster zu erstellen. Tragen Sie 0,5-1 ml normale Kochsalzlösung auf, um ein Austrocknen der Gehirnoberfläche zu verhindern. Entfernen Sie die Dura mit einer Spritzennadel und einer feinen Pinzette.
   HINWEIS: Achten Sie auf große Gefäße (Sinus sagittalis superior, Sinus transversax), um übermäßige Blutungen zu vermeiden (Abbildung 3).
9. Verwenden Sie einen Hochgeschwindigkeitsbohrer, um ein separates Bohrloch für die Referenzelektrode der Siliziumsonde zu erstellen, in der Regel ~1-2 mm vom Schädelfenster entfernt.
10. Tragen Sie 0,2 ml Silikonkleber mit geringer Toxizität auf den Schädel auf, um die Kraniotomie mit dem beigefügten Applikator vollständig zu versiegeln.
11. Lassen Sie die Maus ca. 1 Stunde lang erholen.
12. Befestigen Sie den Kopf der Maus mit der Kopfplatte und den Schrauben an der elektrophysiologischen Aufzeichnungsanlage (Abbildung 2D).
13. Beschichten Sie den Sondenschaft aus Silikon mit dem Fluoreszenzfarbstoff DiI (1:4 DiI:Ethanol), damit die Sondenbahn nach dem Experiment rekonstruiert werden kann.
14. Montieren Sie die Sonde am Manipulator und stellen Sie den gewünschten Winkel ein. Um den vlPAG anzuvisieren, wurde ein AP-Winkel von 15-20° angewendet.
15. Senken Sie die Aufnahmesonde auf die Gehirnoberfläche in der Mitte des Schädelfensters ab. Führen Sie zunächst die Sonde manuell bis zu einer Tiefe von ~300 μm ein. Nach dem Einführen in diese Tiefe senken Sie die Sonde langsam automatisch (z. B. 200 μm/min) auf die Zieltiefe ab, um Gewebeschäden zu minimieren²¹ (Abbildung 2C).
    HINWEIS: Es wird zunächst empfohlen, die Sonde manuell einzuführen. Das manuelle Einführen der Sonde stellt sicher, dass die Sonde gestoppt und zurückgezogen werden kann, falls sie sich beim ersten Einführen verbiegt. Sobald die Sonde vollständig in das Gewebe eingedrungen ist, ist es im Allgemeinen sicher, die Sonde im automatischen Modus weiter abzusenken.
16. Tragen Sie Mineralöl auf die Gehirnoberfläche innerhalb des Kraniotomiefensters auf, um ein Austrocknen zu verhindern.
17. Lassen Sie die Aufzeichnungssonde nach dem Einsetzen 10 Minuten einwirken.
18. Zeichnen Sie Daten von der Siliziumsonde und ECoG mit 30 kHz mit einem Intan Recording Controller auf.
19. 1-2 h nach der Aufnahme verwenden Sie die transkardiale Perfusionstechnik, um das Gehirn mit 4% Paraformaldehyd²² zu fixieren.
    HINWEIS: Aufgrund des Zements kann es schwierig sein, den rostralen Teil des Schädels zu entfernen. Deshalb ist es vorzuziehen, das Gehirn zu entfernen, indem die dorsalen Teile des Schädels entfernt werden.
20. Enthaupten Sie die Maus, schneiden Sie die Haut entlang der Mittellinie auf der Rückenseite vom Hals bis zum Unterkiefer auf. Entfernen Sie Muskeln und Gewebe, die am Schädel befestigt sind, schneiden Sie den Unterkiefer ab, um den Zugang zum Gehirn zu erleichtern.
21. Wenn die Perfusion korrekt durchgeführt wird, sollte das Gehirn etwas schrumpfen, so dass genügend Platz bleibt, um eine feine Schere in den dorsalen Teil des Foramen magnum einzuführen. Machen Sie einen medialen Schnitt, einen lateralen und einen kontralateralen Schnitt von etwa 1 mm Größe im Hinterhauptbein.
22. Entfernen Sie vorsichtig den dorsalen Teil des Schädels mit einer Augenzange. Beginnen Sie am Hinterhauptbein, entfernen Sie alle Schädelfragmente, bis der gesamte dorsale Teil des Gehirns freigelegt ist.
23. Schieben Sie einen Mikrospatel unter das Gehirn, beginnend bei den Riechkolben, um das Gehirn herauszuschöpfen.
24. Nach der Perfusion und Entfernung kann das Gehirn in 4% Paraformaldehyd bei 4 °C für 24-48 h gelagert werden.

3. Histologie für die Rekonstruktion der Sondentrajektorie

1. Schneiden Sie das Gehirn mit einem Vibratom in 70 μm große koronale Schnitte.
2. Montieren Sie die Schnitte auf Objektträger mit einem DAPI-Einbettmedium, das Zellkerne färbt. Decken Sie die Objektträger ab und versiegeln Sie sie mit klarem Nagellack.
3. Bilden Sie die Objektträger auf einem Fluoreszenzmikroskop ab. Stellen Sie den Kontrast/die Helligkeit so ein, dass die Sondenspuren deutlich sichtbar sind. Stellen Sie sicher, dass die resultierende TIFF-Bilddateigröße weniger als 10 MB beträgt, damit MATLAB-Codes reibungslos ausgeführt werden. Rekonstruieren Sie die Sondenspuren mit einem MATLAB-Code²³.

4. Elektrophysiologische Datenanalyse

1. Analysieren Sie aufgezeichnete neuronale Signale von der Siliziumsonde mit einer Offline-Erkennungs- und automatischen Sortiersoftware (Kilosort)²⁴.
2. Klassifiziert erkannte Cluster mit Phy manuell als Multi- oder Einzeleinheiten²⁵. Klassifizieren Sie Cluster als einzelne Einheiten, wenn sie eine physiologische Spike-Wellenformform aufweisen, eine Refraktärperiode im Kreuzkorrelogramm und eine Normalverteilung der Amplitudenansicht aufweisen.
3. Importieren Sie Daten einzelner Einheiten in MATLAB und analysieren^{Sie 23}.

Ergebnisse

Fünf männlichen C57BL/6J wurden ein ECoG-Headset und eine Kopfplatte implantiert (Abbildung 4A). Nach der Genesung wurden die Mäuse während zweier 1,5-stündiger Sitzungen an verschiedenen Tagen an die Kopffixation und das elektrophysiologische Aufzeichnungssystem gewöhnt (Abbildung 4B). Als nächstes wurde ein 2 mm x 2 mm großes Kraniotomiefenster erstellt (Abbildung 4C) und eine Silikonsonde...

Diskussion

Hirnstammkerne vermitteln grundlegende Funktionen wie Atmung, Bewusstsein und Schlaf 26,27,28. Die Lage des Hirnstamms (tief und posterior) stellt eine Herausforderung dar, wenn es darum geht, seine neuronale Aktivität in vivo mit Standardtechniken zu untersuchen. Hier wird ein abgewinkelter anteriorer Zugang vorgestellt, um eine reproduzierbare Einzelaufzeichnung bei kopffixierten Mä...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
1024 channel RHD Recording Controller	Intan Technologies, Los Angeles, California, USA	C3008	Silicon probe recording; recording hardware and software
24 mm x 50 mm No. 1.5 VWR coverslip	VWR, Radnor, Pennsylvania, USA	48393-081	Histology
4% PFA in PBS	ThermoFisher Scientific, Waltham, Massachusetts, USA	J61899.AK	Histology; perfusion solution
C&B metabond	Patterson Dental, Richmond, Virginia, USA	powder: 5533559, quick base: 5533492, catalyst: 55335007	Headplate &Headset Implantation
C57/6J mice 4-6 weeks, males	The Jackson Laboratory, Bar Harbor, Maine, USA	000664
Capnomac Ultima	Datex, Helsinki, Finland	ULT-SVi-27-07	Gas Analyzer; discontinued; alternative gas analyzer can be purchased from Bionet America
CM-DiI	ThermoFisher Scientific, Waltham, Massachusetts, USA	V22888	Red fluorescent dye for coating of the silicon probe
Connector Header	DigiKey, Thief River Falls, Minnesota, USA	1212-1788-ND	ECoG Headset
DAPI Fluoromount-G	SouthernBiotech, Birmingham, Alabama, USA	0100-20	Histology
iBOND Universal	Patterson Dental, Richmond, Virginia, USA	044-1113	Headplate &Headset Implantation; for  securing stainless steel wires to the skull
Low toxicity silicon adhesive	World Precision Instruments, Sarasota, Florida, USA	KWIK-SIL	Headplate
Micro-Manipulator System	New Scale Technologies, Victor, New York, USA	Multi-Probe Manipulator: XYZ Stage Assembly: 06464-0000, MPM System Kit: 06267-3-0001, MPM-Platform-360, MPM ring for MPM Manual Arms, MPM_Ring-72 DEG: 06262-3-0000	Silicon probe recording; inserting the probe into the brain
Microprobes	UCLA, Los Angeles, California, USA	256 ANS, 64M	Discontinued; alternative silicon probes can be purchased from Neuropixels
Mineral Oil	Sigma Aldrich, Saint Luis, Missouri, USA	M8410-100ML	Silicon probe recording; preventing the tissue from drying during the recording
Normal saline	ThermoFisher Scientific, Waltham, Massachusetts, USA	Z1376	Headplate &Headset Implantation; preventing the brain from drying during the surgery
PFA-Coated Stainless Steel Wire-Diameter 0.008 in. coated with striped ends	A-M systems, Sequim, Washington, USA	791400	ECoG Headset & reference electrode for ECoG
Platinum wire 24AWG	World Precision Instruments, Sarasota, Florida, USA	PTP201	Reference electrode for the silicon probe recording
Shandon Colorfrost Plus microscope slides	ThermoFisher Scientific, Waltham, Massachusetts, USA	99-910-01	Histology
Stainless steel Headplate	Star Rapid, China	custom made part	Headplate &Headset Implantation; design available upon request
Stereotaxic apparatus	KOPF, Tujunga, California, USA	Model 940 Small Animal Stereotaxic Instrument with Digital Display Console	Headplate &Headset Implantation