Registrazioni acute multi-elettrodo a unità singola dal tronco encefalico di topi fissati alla testa

Riepilogo

Questo protocollo descrive un metodo per ottenere registrazioni in vivo di singoli neuroni ad alta densità dal tronco encefalico di topi fissati alla testa. Questo approccio viene utilizzato per misurare l'attivazione del potenziale d'azione dei neuroni nel grigio periacqueduttale ventrolaterale - una regione del tronco encefalico inattiva durante il sonno REM (Rapid Eye Movement) - prima e durante l'anestesia generale.

Abstract

Le registrazioni basate su multielettrodi al silicio sono sempre più popolari per studiare l'attività neuronale alla risoluzione temporale dei potenziali d'azione in molte regioni del cervello. Tuttavia, la registrazione dell'attività neuronale da strutture caudali profonde come il tronco encefalico utilizzando sonde multicanale rimane impegnativa. Una preoccupazione significativa è trovare una traiettoria per l'inserimento della sonda che eviti i grandi vasi sanguigni, come il seno venoso sagittale superiore e il seno venoso trasverso. Ferire queste grandi vene può causare emorragie estese, danni al tessuto cerebrale sottostante e potenzialmente la morte. Questo approccio descrive il targeting delle strutture del tronco encefalico accoppiando le coordinate anteriori con un approccio angolato, consentendo alla sonda di registrazione di penetrare nel cervello al di sotto delle strutture vascolari ad alto rischio. Rispetto a un approccio strettamente verticale, l'approccio angolato massimizza il numero di regioni cerebrali che possono essere mirate. Utilizzando questa strategia, il grigio periacqueduttale ventrolaterale (vlPAG), una regione del tronco encefalico associata al sonno REM, può essere accessibile in modo riproducibile e affidabile per ottenere registrazioni multi-elettrodo a unità singola in topi fissati alla testa prima e durante l'anestesia con sevoflurano. La capacità di registrare l'attività neuronale nel vlPAG e nei nuclei circostanti con un'elevata risoluzione temporale è un passo avanti nel far progredire la comprensione della relazione tra sonno REM e anestesia.

Introduzione

Le registrazioni basate su multielettrodi al silicio stanno diventando sempre più popolari per misurare l'attività neuronale in molte regioni del cervello con risoluzione del potenziale d'azione singolo 1,2,3,4. Nell'ultimo decennio, la tecnologia di registrazione ad alta densità è cresciuta notevolmente. Gli attuali elettrodi di registrazione a base di silicio possono ospitare un numero elevato di canali, fibre ottiche e dispositivi di registrazione per elettrocorticografia (ECoG) ^5,6. Inoltre, l'impianto cronico di questi elettrodi consente registrazioni a lungo termine ^7,8.

Nonostante i recenti progressi tecnologici, il targeting di strutture caudali profonde come il tronco encefalico con sonde multicanale rimane una sfida. Quando si prendono di mira strutture del tronco encefalico come il grigio periacqueduttale ventrolaterale (vlPAG), un ostacolo significativo è l'identificazione di una traiettoria della sonda che eviti i principali vasi sanguigni, ad esempio il seno venoso sagittale superiore e il seno venoso trasverso. La lesione di queste grandi vene può causare emorragie estese, danni al tessuto cerebrale sottostante e persino la morte ^9,10. Proponiamo di indirizzare le strutture del tronco encefalico dalle coordinate anteriori ad angolo, consentendo alla sonda di registrazione di penetrare nel cervello al di sotto di tali strutture vascolari ad alto rischio (vedi Figura 1). Questo approccio angolato, rispetto a quello verticale, massimizza il numero di regioni cerebrali accessibili per la registrazione. Inoltre, in circostanze sperimentali in cui si desidera effettuare registrazioni ECoG, l'approccio anteriore angolato offre una maggiore superficie cranica disponibile per l'impianto di cuffie ECoG, poiché la finestra craniotomica per l'inserimento della sonda è posizionata più anteriormente^10,11.

L'identificazione dei gruppi cellulari e dei circuiti specifici responsabili dei cambiamenti del sonno REM indotti dall'anestesia rimane uno degli obiettivi principali della ricerca sull'anestesia. Pertanto, l'obiettivo era quello di accedere in modo riproducibile e affidabile al vlPAG - una regione del tronco encefalico associata al sonno REM - per ottenere registrazioni multi-elettrodo a singola unità in topi fissati alla testa prima e durante l'anestesia con sevoflurano^12,13. Studi precedenti hanno utilizzato misurazioni elettrofisiologiche del potenziale di campo locale (LFP) del vlPAG in topi svegli per identificare i cambiamenti di stato neurale associati all'anestesia^14,15. Tuttavia, le misurazioni LFP sono principalmente sensibili all'attività sinaptica, non ai potenziali d'azione, all'interno dell'area registrata¹⁶. Di conseguenza, rimane una comprensione limitata di come gli anestetici influenzino direttamente i modelli di attività neurale prodotti dai neuroni vlPAG. Qui, viene descritto un metodo per ottenere registrazioni di singoli neuroni ad alta densità dal tronco cerebrale di topi fissati alla testa. Questo metodo può anche essere adattato per registrare l'attività di un singolo neurone da varie altre strutture del tronco encefalico profondo e posteriore.

Protocollo

Tutti gli studi sono stati approvati dall'Institutional Animal Care and Use Committee dell'Università della Virginia (Charlottesville, Virginia). Sono stati utilizzati cinque topi maschi C57BL/6J, di età compresa tra 3 e 7 mesi, del peso di 25-30 g. I dettagli dei reagenti e delle attrezzature qui utilizzate sono elencati nella Tabella dei materiali.

1. Impianto della piastra e della cuffia

1. Realizzare una cuffia ECoG saldando un filo di acciaio inossidabile rivestito di perfluoroalcossi (PFA) a un connettore a 3 pin (Figura 2A).
2. Identificare le coordinate di inserzione in base a un atlante stereotassico del mouse¹⁷. L'uso del teorema di Pitagora per calcolare l'angolo e la profondità di inserimento della sonda, in particolare quando ci sono poche informazioni in letteratura, è un punto di partenza ragionevole (Figura 1)¹⁸.
   NOTA: Alla fine, le coordinate verranno regolate per tentativi ed errori. Per indirizzare il vlPAG sono state utilizzate le seguenti coordinate nei topi adulti: anteroposteriore (AP) -3,6 mm, mediolaterale (ML) +0,5 mm, dorsoventrale (DV) -4 mm. La sonda è stata inserita con un angolo di 20° (AP).
3. Indurre l'anestesia generale posizionando il topo nella camera di induzione (1,5%-3% di isoflurano in ossigeno). Una volta anestetizzato, posizionare il topo nel telaio stereotassico, posizionando il naso dell'animale nel cono del naso e stabilizzando la testa con delle barre per la testa.
4. Applicare un unguento oftalmico sugli occhi per prevenire danni alla cornea. Utilizzare un sistema di controllo della temperatura per mantenere la temperatura corporea a 37 °C.
5. Applicare una crema depilatoria o radere il pelo sul cuoio capelluto, quindi disinfettare con iodio povidone e alcol al 70%. Utilizzare la tecnica asettica "solo punte" per mantenere un campo chirurgico sterile.
6. Eseguire un test di pizzicamento delle dita dei piedi per verificare la profondità dell'anestesia.
7. Somministrare analgesia: carprofene 2,5 mg/kg, somministrato per via sottocutanea nella parte posteriore.
8. Praticare un'incisione del cuoio capelluto di 5 mm per rimuovere una macchia circolare di pelle sopra le ossa parietale e occipitale. Rimuovere delicatamente le meningi raschiandole con la lama del bisturi.
9. Utilizzare la lama del bisturi per tagliare gli attacchi muscolari ed esporre le ossa parietali e occipitali¹⁹. Applicare perossido di idrogeno secondo necessità per controllare il sanguinamento e asciugare la superficie del cranio. È fondamentale applicare cemento dentale e resina sul cranio asciutto per ottenere un legame forte.
10. Innanzitutto, identifica i punti di riferimento bregma e lambda sul cranio²⁰. Quindi, regolare la posizione del cono del naso per livellare la posizione antero-posteriore del cranio, assicurandosi che non esistano più di 100 μm di differenza di altezza tra i due punti di riferimento.
11. Per livellare la posizione mediale-laterale del cranio, prelevare due punti opposti tra bregma e lambda, ciascuno a 1 mm dalla sutura sagittale e controllarne il livello. Se c'è una differenza di altezza superiore a 100 μm tra di loro, regola la posizione mediale-laterale del cranio manipolando le barre della testa.
12. Misurare la distanza tra bregma e lambda e confrontarla con la distanza riportata nell'atlante stereotassico di Franklin-Paxinos (di solito 4,2 mm)¹⁷. Utilizzare la differenza tra le distanze misurate e riportate per scalare proporzionalmente le coordinate AP. Segna le coordinate della craniotomia sul cranio con una matita sterilizzata.
    NOTA: Se la distanza misurata tra la bregma e l'altra è diversa da 4,2 mm, le coordinate devono essere scalate proporzionalmente. Tutte le coordinate AP riportate in un atlante stereotassico corrispondono a una distanza bregma-lambda standardizzata. Poiché la dimensione del cranio di un topo è variabile, è importante regolare le coordinate di conseguenza.
13. Utilizzando un micromanipolatore stereotassico, posizionare la piastra direttamente sopra la sutura lambda e fissarla al cranio applicando cemento dentale sulla piastra e attorno ad essa (Figura 3A, B). Lasciare asciugare almeno 10 minuti per il cemento.
14. Praticare dei fori (0,5 mm di diametro) per due elettrodi corticali (corteccia frontale e parietale) e per uno che fungerà da elettrodo di riferimento (cervelletto). Posizionare le estremità spellate (0,5 mm) degli elettrodi a filo d'argento rivestiti all'interno dei fori della fresa e fissarle con resina attivata dalla luce ultravioletta.
15. Coprire completamente i fili di acciaio inossidabile rivestiti con cemento dentale in modo che nessun filo sia esposto. Coprire la parte inferiore e i lati dell'auricolare con cemento dentale in modo che sia saldamente in posizione. Assicurarsi che le suture bregma e lambda rimangano visibili una volta che l'auricolare è fissato in posizione (Figura 2B).
16. Lascia che il topo si riprenda per un minimo di 7 giorni, esamina quotidianamente l'animale e il sito chirurgico per eventuali irregolarità. Somministrare analgesici (Carprofene 2,5 mg/kg, SC) secondo necessità.

2. Posizionamento e registrazione della sonda al silicio

1. Abituare il mouse al rig di registrazione e al fissaggio della testa (almeno 1,5 ore in due giorni separati) (Figura 2D).
2. Il giorno della registrazione, posizionare il topo nella camera di anestesia (isoflurano 1,5%-3% in ossigeno).
3. Posizionare il mouse in una cornice stereotassica, regolare l'ogiva e le barre della testa come descritto in 1.3. Mantenere l'anestesia (isoflurano 1,5%-3% in ossigeno) durante l'intervento di chirurgia stereotassica. Eseguire un test di pizzicamento delle dita dei piedi per verificare la profondità dell'anestesia.
4. Applicare un unguento oftalmico sugli occhi e mantenere una temperatura corporea adeguata.
5. Identificare bregma e lambda, assicurandosi che non esistano più di 100 μm di differenza di altezza tra i due punti di riferimento anatomici.
6. Trova e segna le coordinate calcolate sul cranio con una matita sterile, quindi crea un contorno della finestra craniotomica di 2 mm x 2 mm attorno alle coordinate.
7. Eseguire un test di pizzicamento delle dita dei piedi per verificare la profondità dell'anestesia.
8. Utilizzare un trapano ad alta velocità per creare una finestra per craniotomia di 2 mm x 2 mm. Applicare 0,5-1 ml di soluzione fisiologica normale per evitare che la superficie cerebrale si secchi. Rimuovere la dura madre utilizzando un ago da siringa e una pinza fine.
   NOTA: Fare attenzione ai vasi principali (seno sagittale superiore, seno trasverso) per evitare un sanguinamento eccessivo (Figura 3).
9. Utilizzare un trapano ad alta velocità per creare un foro di fresatura separato per l'elettrodo di riferimento della sonda in silicone, generalmente a ~1-2 mm dalla finestra cranica.
10. Applicare 0,2 ml di adesivo siliconico a bassa tossicità sul cranio per sigillare completamente la craniotomia, utilizzando l'applicatore allegato.
11. Lascia che il mouse si riprenda per circa 1 ora.
12. Fissare la testa del mouse al rig di registrazione elettrofisiologica utilizzando la piastra e le viti (Figura 2D).
13. Rivestire il gambo della sonda in silicone con il colorante fluorescente DiI (1:4 DiI:Etanolo) in modo che la traiettoria della sonda possa essere ricostruita dopo l'esperimento.
14. Montare la sonda sul manipolatore e impostare l'angolo desiderato. Per puntare il vlPAG, è stato applicato un angolo AP di 15-20°.
15. Abbassare la sonda di registrazione sulla superficie del cervello al centro della finestra cranica. Innanzitutto, inserire manualmente la sonda a una profondità di ~300 μm. Una volta inserita a questa profondità, abbassare lentamente la sonda automaticamente (ad es. 200 μm/min) alla profondità desiderata per ridurre al minimo il danno tissutale²¹ (Figura 2C).
    NOTA: Inizialmente si consiglia l'inserimento manuale della sonda. L'inserimento manuale della sonda garantisce la possibilità di arrestare e ritrarre la sonda nel caso in cui si pieghi al momento dell'inserimento iniziale. Una volta che la sonda è completamente penetrata nel tessuto, è generalmente sicuro continuare a scendere la sonda in modalità automatica.
16. Applicare olio minerale sulla superficie del cervello all'interno della finestra craniotomica per evitare che si secchi.
17. Lasciare che la sonda di registrazione si stabilizzi per 10 minuti dopo l'inserimento.
18. Registra i dati dalla sonda al silicio e dall'ECoG a 30 kHz utilizzando un controller di registrazione Intan.
19. 1-2 ore dopo la registrazione, utilizzare la tecnica della perfusione transcardica per fissare il cervello in paraformaldeide^{22% al} 4%.
    NOTA: A causa del cemento, potrebbe essere difficile rimuovere la parte rostrale del cranio. Ecco perché è preferibile asportare il cervello rimuovendo le parti dorsali del cranio.
20. Decapitare il topo, tagliare la pelle seguendo la linea mediana sul lato dorsale, dal collo alla mascella inferiore. Rimuovere i muscoli e i tessuti attaccati al cranio, tagliare la mascella inferiore per un più facile accesso al cervello.
21. Se la perfusione viene eseguita correttamente, il cervello dovrebbe restringersi un po', lasciando abbastanza spazio per inserire le forbici sottili nella parte dorsale del forame magno. Eseguire un taglio mediale, un taglio laterale e un taglio controlaterale, di circa 1 mm di dimensione, nell'osso occipitale.
22. Rimuovere con cautela la parte dorsale del cranio utilizzando una pinza oftalmica. Inizia dall'osso occipitale, rimuovi tutti i frammenti del cranio fino a quando l'intera parte dorsale del cervello non è esposta.
23. Fai scorrere una micro spatola sotto il cervello, iniziando dai bulbi olfattivi per estrarre il cervello.
24. Una volta perfuso e rimosso, il cervello può essere conservato in paraformaldeide al 4% a 4 °C per 24-48 ore.

3. Istologia per la ricostruzione della traiettoria della sonda

1. Sezionare il cervello in sezioni coronali di 70 μm utilizzando un vibratomo.
2. Montare le sezioni sui vetrini utilizzando un mezzo di montaggio DAPI che colora i nuclei cellulari. Vetrino coprioggetti e sigillare i vetrini con smalto trasparente.
3. Visualizzare i vetrini su un microscopio a fluorescenza. Regolare il contrasto/luminosità in modo che le tracce della sonda siano chiaramente visibili. Assicurati che le dimensioni del file immagine tiff risultante siano inferiori a 10 MB, in modo che i codici MATLAB vengano eseguiti senza problemi. Ricostruisci le tracce della sonda utilizzando un codice MATLAB²³.

4. Analisi dei dati elettrofisiologici

1. Analizza i segnali neurali registrati dalla sonda al silicio utilizzando un software di rilevamento off-line e di smistamento automatico (Kilosort)²⁴.
2. Classificare manualmente i cluster rilevati con Phy come unità multiple o singole²⁵. Classificare i cluster come singole unità quando hanno una forma d'onda a picco fisiologico, mostrano un periodo refrattario nel correlatore incrociato e una normale distribuzione della vista dell'ampiezza.
3. Importa i dati di una singola unità in MATLAB e analizzali²³.

Risultati

A cinque maschi C57BL/6J sono stati impiantati una cuffia ECoG e una piastra per la testa (Figura 4A). Dopo il recupero, i topi sono stati abituati alla fissazione della testa e al rig di registrazione elettrofisiologica durante due sessioni di 1,5 ore in giorni separati (Figura 4B). Successivamente, è stata creata una finestra per craniotomia di 2 mm x2 mm (Figura 4C) ed è stata inserita una sond...

Discussione

I nuclei del tronco encefalico mediano funzioni fondamentali come la respirazione, la coscienza e il sonno 26,27,28. La posizione del tronco encefalico (profonda e posteriore) rappresenta una sfida nello studio della sua attività neuronale in vivo utilizzando tecniche standard. Qui viene presentato un approccio anteriore angolato per consentire la registrazione riproducibile di una sin...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
1024 channel RHD Recording Controller	Intan Technologies, Los Angeles, California, USA	C3008	Silicon probe recording; recording hardware and software
24 mm x 50 mm No. 1.5 VWR coverslip	VWR, Radnor, Pennsylvania, USA	48393-081	Histology
4% PFA in PBS	ThermoFisher Scientific, Waltham, Massachusetts, USA	J61899.AK	Histology; perfusion solution
C&B metabond	Patterson Dental, Richmond, Virginia, USA	powder: 5533559, quick base: 5533492, catalyst: 55335007	Headplate &Headset Implantation
C57/6J mice 4-6 weeks, males	The Jackson Laboratory, Bar Harbor, Maine, USA	000664
Capnomac Ultima	Datex, Helsinki, Finland	ULT-SVi-27-07	Gas Analyzer; discontinued; alternative gas analyzer can be purchased from Bionet America
CM-DiI	ThermoFisher Scientific, Waltham, Massachusetts, USA	V22888	Red fluorescent dye for coating of the silicon probe
Connector Header	DigiKey, Thief River Falls, Minnesota, USA	1212-1788-ND	ECoG Headset
DAPI Fluoromount-G	SouthernBiotech, Birmingham, Alabama, USA	0100-20	Histology
iBOND Universal	Patterson Dental, Richmond, Virginia, USA	044-1113	Headplate &Headset Implantation; for  securing stainless steel wires to the skull
Low toxicity silicon adhesive	World Precision Instruments, Sarasota, Florida, USA	KWIK-SIL	Headplate
Micro-Manipulator System	New Scale Technologies, Victor, New York, USA	Multi-Probe Manipulator: XYZ Stage Assembly: 06464-0000, MPM System Kit: 06267-3-0001, MPM-Platform-360, MPM ring for MPM Manual Arms, MPM_Ring-72 DEG: 06262-3-0000	Silicon probe recording; inserting the probe into the brain
Microprobes	UCLA, Los Angeles, California, USA	256 ANS, 64M	Discontinued; alternative silicon probes can be purchased from Neuropixels
Mineral Oil	Sigma Aldrich, Saint Luis, Missouri, USA	M8410-100ML	Silicon probe recording; preventing the tissue from drying during the recording
Normal saline	ThermoFisher Scientific, Waltham, Massachusetts, USA	Z1376	Headplate &Headset Implantation; preventing the brain from drying during the surgery
PFA-Coated Stainless Steel Wire-Diameter 0.008 in. coated with striped ends	A-M systems, Sequim, Washington, USA	791400	ECoG Headset & reference electrode for ECoG
Platinum wire 24AWG	World Precision Instruments, Sarasota, Florida, USA	PTP201	Reference electrode for the silicon probe recording
Shandon Colorfrost Plus microscope slides	ThermoFisher Scientific, Waltham, Massachusetts, USA	99-910-01	Histology
Stainless steel Headplate	Star Rapid, China	custom made part	Headplate &Headset Implantation; design available upon request
Stereotaxic apparatus	KOPF, Tujunga, California, USA	Model 940 Small Animal Stereotaxic Instrument with Digital Display Console	Headplate &Headset Implantation