Enregistrements aigus à une unité et à plusieurs électrodes du tronc cérébral de souris fixées à la tête

Résumé

Ce protocole décrit une méthode permettant d’obtenir in vivo des enregistrements de neurones uniques à haute densité à partir du tronc cérébral de souris fixées à la tête. Cette approche est déployée pour mesurer le potentiel d’action des neurones dans le gris périaqueducal ventrolatéral - une région du tronc cérébral inactive pendant le sommeil paradoxal - avant et pendant l’anesthésie générale.

Résumé

Les enregistrements à base de multiélectrodes en silicium sont de plus en plus populaires pour étudier l’activité neuronale à la résolution temporelle des potentiels d’action dans de nombreuses régions du cerveau. Cependant, l’enregistrement de l’activité neuronale à partir de structures caudales profondes comme le tronc cérébral à l’aide de sondes multicanaux reste difficile. Une préoccupation importante est de trouver une trajectoire d’insertion de la sonde qui évite les gros vaisseaux sanguins, tels que le sinus veineux sagittal supérieur et le sinus veineux transverse. Endommager ces grosses veines peut provoquer des saignements importants, des dommages au tissu cérébral sous-jacent et potentiellement la mort. Cette approche décrit le ciblage des structures du tronc cérébral en couplant les coordonnées antérieures avec une approche inclinée, permettant à la sonde enregistreuse de pénétrer dans le cerveau sous les structures vasculaires à haut risque. Par rapport à une approche strictement verticale, l’approche angulaire maximise le nombre de régions cérébrales qui peuvent être ciblées. À l’aide de cette stratégie, le gris périaqueducal ventrolatéral (vlPAG), une région du tronc cérébral associée au sommeil paradoxal, peut être accédé de manière reproductible et fiable pour obtenir des enregistrements unitaires et multi-électrodes chez des souris à tête fixe avant et pendant l’anesthésie au sévoflurane. La capacité d’enregistrer l’activité neuronale dans le vlPAG et les noyaux environnants avec une résolution temporelle élevée est un pas en avant dans la compréhension de la relation entre le sommeil paradoxal et l’anesthésie.

Introduction

Les enregistrements à base de multiélectrodes en silicium sont de plus en plus populaires pour mesurer l’activité neuronale dans de nombreuses régions du cerveau avec une résolution de potentiel d’action unique 1,2,3,4. Au cours de la dernière décennie, la technologie d’enregistrement à haute densité s’est considérablement développée. Les électrodes d’enregistrement actuelles à base de silicium peuvent s’adapter à un nombre élevé de canaux, à des fibres optiques et à des dispositifs d’enregistrement par électrocorticographie (ECoG) ^5,6. De plus, l’implantation chronique de ces électrodes permet des enregistrements à long terme ^7,8.

Malgré les progrès technologiques récents, il reste difficile de cibler les structures caudales profondes comme le tronc cérébral à l’aide de sondes multicanaux. Lorsque l’on cible des structures du tronc cérébral telles que le gris périacqueductal ventrolatéral (vlPAG), un obstacle important est l’identification d’une trajectoire de sonde qui évite les principaux vaisseaux sanguins, par exemple, le sinus veineux sagittal supérieur et le sinus veineux transverse. Les blessures à ces grosses veines peuvent provoquer des saignements importants, des dommages aux tissus cérébraux sous-jacents et même la mort ^9,10. Nous proposons de cibler les structures du tronc cérébral à partir des coordonnées antérieures à un angle, permettant à la sonde enregistreuse de pénétrer le cerveau sous ces structures vasculaires à haut risque (voir Figure 1). Cette approche inclinée, par rapport à une approche verticale, maximise le nombre de régions cérébrales accessibles pour l’enregistrement. De plus, dans des circonstances expérimentales où des enregistrements ECoG sont souhaités, l’approche antérieure inclinée offre plus de surface crânienne disponible pour l’implantation du casque ECoG, car la fenêtre de craniotomie pour l’insertion de la sonde est positionnée plus en avant^10,11.

L’identification des groupes cellulaires et des circuits spécifiques responsables des changements de sommeil paradoxal induits par l’anesthésie reste un objectif majeur de la recherche en anesthésie. Ainsi, l’objectif ici était d’accéder de manière reproductible et fiable au vlPAG - une région du tronc cérébral associée au sommeil paradoxal - pour obtenir des enregistrements unitaires et multi-électrodes chez des souris fixées à la tête avant et pendant l’anesthésie au sévoflurane^12,13. Des études antérieures ont utilisé des mesures électrophysiologiques du potentiel de champ local (LFP) du vlPAG chez des souris éveillées pour identifier les changements d’état neuronal associés à l’anesthésie^14,15. Cependant, les mesures de la LFP sont principalement sensibles à l’activité synaptique, et non aux potentiels d’action, dans la zone^{enregistrée 16}. Par conséquent, il reste une compréhension limitée de la façon dont les anesthésiques affectent directement les modèles d’activité neuronale produits par les neurones vlPAG. Ici, une méthode est décrite pour obtenir des enregistrements à haute densité de neurones uniques à partir du tronc cérébral de souris à tête fixe. Cette méthode peut également être adaptée pour enregistrer l’activité d’un seul neurone à partir de diverses autres structures profondes et postérieures du tronc cérébral.

Protocole

Toutes les études ont été approuvées par l’Institutional Animal Care and Use Committee de l’Université de Virginie (Charlottesville, Virginie). Cinq souris C57BL/6J mâles, âgées de 3 à 7 mois et pesant de 25 à 30 g, ont été utilisées. Les détails des réactifs et de l’équipement utilisé ici sont répertoriés dans la table des matériaux.

1. Implantation de la plaque frontale et du casque

1. Fabriquez un casque ECoG en soudant un fil d’acier inoxydable revêtu de perfluoroalcoxy (PFA) à un connecteur à 3 broches (Figure 2A).
2. Identifiez les coordonnées d’insertion à l’aide d’un atlas stéréotaxique^{de souris 17}. L’utilisation du théorème de Pythagore pour calculer l’angle et la profondeur d’insertion de la sonde - en particulier lorsqu’il y a peu d’informations dans la littérature - est un point de départ raisonnable (Figure 1)¹⁸.
   REMARQUE : En fin de compte, les coordonnées seront ajustées par essais et erreurs. Pour cibler le vlPAG, les coordonnées suivantes ont été utilisées chez les souris adultes : antéropostérieure (AP) -3,6 mm, médiolatérale (ML) +0,5 mm, dorso-ventrale (DV) -4 mm. La sonde a été insérée à un angle de 20° (AP).
3. Induire une anesthésie générale en plaçant la souris dans la chambre d’induction (1,5 % à 3 % d’isoflurane dans l’oxygène). Une fois anesthésiée, positionnez la souris dans le cadre stéréotaxique, en plaçant le nez de l’animal dans le cône nasal et en stabilisant la tête avec des barres de tête.
4. Appliquez une pommade ophtalmique sur les yeux pour prévenir les lésions cornéennes. Utilisez un système de contrôle de la température pour maintenir la température corporelle à 37 °C.
5. Appliquez une crème dépilatoire ou rasez la fourrure sur le cuir chevelu, puis désinfectez avec de la povidone iodée et de l’alcool à 70%. Utilisez la technique aseptique « pointes seulement » pour maintenir un champ chirurgical stérile.
6. Effectuez un test de pincement des orteils pour vérifier la profondeur de l’anesthésie.
7. Administrer un analgésique : carprofène 2,5 mg/kg, administré par voie sous-cutanée dans le dos.
8. Faites une incision de 5 mm du cuir chevelu pour enlever une tache circulaire de peau au-dessus des os pariétals et occipitaux. Retirez délicatement les méninges en les grattant avec la lame du scalpel.
9. Utilisez la lame du scalpel pour couper les attaches musculaires et exposer les os pariétals et occipitaux¹⁹. Appliquez du peroxyde d’hydrogène au besoin pour contrôler les saignements et assécher la surface du crâne. Il est crucial d’appliquer du ciment dentaire et de la résine sur le crâne sec pour obtenir une liaison solide.
10. Tout d’abord, identifiez les points de repère bregma et lambda sur le crâne²⁰. Ensuite, ajustez la position du cône nasal pour niveler la position antéro-postérieure du crâne, en vous assurant qu’il n’y a pas plus de 100 μm de différence de hauteur entre les deux points de repère.
11. Pour niveler la position médiale-latérale du crâne, choisissez deux points opposés entre bregma et lambda, chacun à 1 mm de la suture sagittale et vérifiez leur niveau. S’il y a plus de 100 m de différence de hauteur entre eux, ajustez la position médiale-latérale du crâne en manipulant les barres de tête.
12. Mesurez la distance entre bregma et lambda et comparez-la à la distance indiquée dans l’atlas stéréotaxique de Franklin-Paxinos (généralement 4,2 mm)¹⁷. Utilisez la différence entre les distances mesurées et rapportées pour mettre à l’échelle vos coordonnées AP proportionnellement. Marquez les coordonnées de la craniotomie sur le crâne avec un crayon stérilisé.
    REMARQUE : Si la distance bregma-lambda mesurée diffère de 4,2 mm, les coordonnées doivent être mises à l’échelle proportionnellement. Toutes les coordonnées AP rapportées dans un atlas stéréotaxique correspondent à une distance standardisée bregma-lambda. Comme la taille d’un crâne de souris est variable, il est important d’ajuster vos coordonnées en conséquence.
13. À l’aide d’un micromanipulateur stéréotaxique, positionnez la plaque frontale directement sur le dessus de la suture lambda et fixez-la au crâne en appliquant du ciment dentaire sur la plaque frontale et autour de celle-ci (Figure 3A,B). Attendez au moins 10 min pour que le ciment sèche.
14. Percez des trous de bavure (0,5 mm de diamètre) pour deux électrodes corticales (cortex frontal et pariétal) et pour une qui servira d’électrode de référence (cervelet). Placez les extrémités dénudées (0,5 mm) des électrodes en fil d’argent revêtues dans les trous de bavure et fixez-les à l’aide d’une résine activée par la lumière ultraviolette.
15. Couvrez complètement les fils d’acier inoxydable revêtus de ciment dentaire afin qu’aucun fil ne soit exposé. Couvrez le dessous et les côtés du casque avec du ciment dentaire afin qu’il soit fermement en place. Assurez-vous que les sutures bregma et lambda restent visibles une fois le casque fixé en place (Figure 2B).
16. Laissez la souris récupérer pendant au moins 7 jours, examinez quotidiennement l’animal et le site chirurgical pour détecter toute irrégularité. Administrer des analgésiques (Carprofène 2,5 mg/kg, SC) au besoin.

2. Placement et enregistrement de la sonde en silicium

1. Habituer la souris à la plate-forme d’enregistrement et à la fixation de la tête (au moins 1,5 h sur deux jours différents) (figure 2D).
2. Le jour de l’enregistrement, placez la souris dans la chambre d’anesthésie (Isoflurane 1,5 % à 3 % dans l’oxygène).
3. Positionnez la souris dans un cadre stéréotaxique, ajustez le cône de nez et les barres de tête comme décrit en 1.3. Maintenez l’anesthésie (isoflurane 1,5 % à 3 % dans l’oxygène) tout au long de la chirurgie stéréotaxique. Effectuez un test de pincement des orteils pour vérifier la profondeur de l’anesthésie.
4. Appliquez une pommade ophtalmique sur les yeux et maintenez une température corporelle adéquate.
5. Identifiez bregma et lambda, en vous assurant qu’il n’existe pas plus de 100 μm de différence de hauteur entre les deux points de repère anatomiques.
6. Trouvez et marquez les coordonnées calculées sur le crâne à l’aide d’un crayon stérile, puis créez un contour de la fenêtre de craniotomie de 2 mm x 2 mm autour des coordonnées.
7. Effectuez un test de pincement des orteils pour vérifier la profondeur de l’anesthésie.
8. Utilisez une perceuse à grande vitesse pour créer une fenêtre de craniotomie de 2 mm x 2 mm. Appliquez 0,5 à 1 ml de solution saline normale pour empêcher la surface du cerveau de se dessécher. Retirez la dure-mère à l’aide d’une aiguille de seringue et d’une pince fine.
   REMARQUE : Surveillez les principaux vaisseaux (sinus sagittal supérieur, sinus transverse) pour éviter les saignements excessifs (Figure 3).
9. Utilisez une perceuse à grande vitesse pour créer un trou de bavure séparé pour l’électrode de référence de la sonde en silicium, généralement à ~1-2 mm de la fenêtre crânienne.
10. Appliquez 0,2 ml d’adhésif silicone à faible toxicité sur le crâne pour sceller complètement la craniotomie, à l’aide de l’applicateur ci-joint.
11. Laissez la souris récupérer pendant environ 1 h.
12. Fixez la tête de la souris sur le dispositif d’enregistrement électrophysiologique à l’aide de la plaque frontale et des vis (Figure 2D).
13. Enduire la tige de la sonde en silicium avec le colorant fluorescent DiI (1:4 DiI :Ethanol) afin que la trajectoire de la sonde puisse être reconstruite après l’expérience.
14. Montez la sonde sur le manipulateur et réglez l’angle souhaité. Pour cibler le vlPAG, un angle AP de 15-20° a été appliqué.
15. Abaissez la sonde d’enregistrement à la surface du cerveau au centre de la fenêtre crânienne. Tout d’abord, insérez manuellement la sonde à une profondeur de ~300 μm. Une fois insérée à cette profondeur, abaissez lentement la sonde automatiquement (par exemple, 200 μm/min) à la profondeur ciblée pour minimiser les lésions tissulaires²¹ (Figure 2C).
    REMARQUE : L’insertion manuelle de la sonde est initialement recommandée. L’insertion manuelle de la sonde garantit la possibilité d’arrêter et de rétracter la sonde si elle se plie lors de l’insertion initiale. Une fois que la sonde pénètre complètement dans le tissu, il est généralement sûr de continuer à descendre la sonde en mode automatique.
16. Appliquez de l’huile minérale sur la surface du cerveau à l’intérieur de la fenêtre de craniotomie pour éviter qu’elle ne sèche.
17. Laissez la sonde d’enregistrement se stabiliser pendant 10 minutes après l’insertion.
18. Enregistrez les données de la sonde en silicium et de l’ECoG à 30 kHz à l’aide d’un contrôleur d’enregistrement Intan.
19. 1 à 2 h après l’enregistrement, utiliser la technique de perfusion transcardique pour fixer le cerveau dans du paraformaldéhyde²² à 4 %.
    REMARQUE : En raison du ciment, il peut être difficile d’enlever la partie rostrale du crâne. C’est pourquoi il est préférable d’exciser le cerveau en enlevant les parties dorsales du crâne.
20. Décapitez la souris, coupez la peau en suivant la ligne médiane du côté dorsal, du cou à la mâchoire inférieure. Retirez les muscles et les tissus attachés au crâne, coupez la mâchoire inférieure pour faciliter l’accès au cerveau.
21. Si la perfusion est faite correctement, le cerveau devrait rétrécir un peu, laissant suffisamment d’espace pour insérer de fines ciseaux dans la partie dorsale du foramen magnum. Faites une incision médiale, une incision latérale et une incision controlatérale, d’une taille d’environ 1 mm, dans l’os occipital.
22. Retirez délicatement la partie dorsale du crâne à l’aide d’une pince ophtalmique. Commencez par l’os occipital, retirez tous les fragments de crâne jusqu’à ce que toute la partie dorsale du cerveau soit exposée.
23. Glissez une micro spatule sous le cerveau, en commençant par les bulbes olfactifs pour évasser le cerveau.
24. Une fois perfusé et retiré, le cerveau peut être stocké dans du paraformaldéhyde à 4 % à 4 °C pendant 24 à 48 h.

3. Histologie pour la reconstruction de la trajectoire de la sonde

1. Sectionnez le cerveau en sections coronales de 70 μm à l’aide d’un vibratome.
2. Montez les sections sur les lames à l’aide d’un support de montage DAPI qui colore les noyaux cellulaires. Couvre-lame et scellez les lames avec du vernis à ongles transparent.
3. Imagez les lames à l’aide d’un microscope à fluorescence. Ajustez le contraste/la luminosité de manière à ce que les traces de la sonde soient clairement visibles. Assurez-vous que la taille des fichiers image tiff résultants est inférieure à 10 Mo, afin que les codes MATLAB fonctionnent correctement. Reconstruisez les traces de la sonde à l’aide d’un code MATLAB²³.

4. Analyse des données électrophysiologiques

1. Analysez les signaux neuronaux enregistrés de la sonde en silicium à l’aide d’un logiciel de détection et de tri automatique hors ligne (Kilosort⁾²⁴.
2. Classez manuellement les clusters détectés avec Phy en tant que plusieurs unités ou unités uniques²⁵. Classez les clusters en tant qu’unités uniques lorsqu’ils ont une forme d’onde de pointe physiologique, montrent une période réfractaire dans le corrélogramme croisé et une distribution normale de la vue d’amplitude.
3. Importez des données unitaires dans MATLAB et^{analysez-en 23}.

Résultats

Cinq C57BL/6J mâles ont été implantés avec un casque ECoG et une plaque frontale (Figure 4A). Après la récupération, les souris ont été habituées à la fixation de la tête et à l’appareil d’enregistrement électrophysiologique pendant deux séances d’une heure et demie à des jours différents (figure 4B). Ensuite, une fenêtre de craniotomie de 2 mm x 2 mm a été créée (figure 4C

Discussion

Les noyaux du tronc cérébral interviennent dans des fonctions fondamentales telles que la respiration, la conscience et le sommeil 26,27,28. L’emplacement du tronc cérébral (profond et postérieur) présente un défi pour l’étude de son activité neuronale in vivo à l’aide de techniques standard. Ici, une approche antérieure inclinée est présentée pour permettre un enreg...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
1024 channel RHD Recording Controller	Intan Technologies, Los Angeles, California, USA	C3008	Silicon probe recording; recording hardware and software
24 mm x 50 mm No. 1.5 VWR coverslip	VWR, Radnor, Pennsylvania, USA	48393-081	Histology
4% PFA in PBS	ThermoFisher Scientific, Waltham, Massachusetts, USA	J61899.AK	Histology; perfusion solution
C&B metabond	Patterson Dental, Richmond, Virginia, USA	powder: 5533559, quick base: 5533492, catalyst: 55335007	Headplate &Headset Implantation
C57/6J mice 4-6 weeks, males	The Jackson Laboratory, Bar Harbor, Maine, USA	000664
Capnomac Ultima	Datex, Helsinki, Finland	ULT-SVi-27-07	Gas Analyzer; discontinued; alternative gas analyzer can be purchased from Bionet America
CM-DiI	ThermoFisher Scientific, Waltham, Massachusetts, USA	V22888	Red fluorescent dye for coating of the silicon probe
Connector Header	DigiKey, Thief River Falls, Minnesota, USA	1212-1788-ND	ECoG Headset
DAPI Fluoromount-G	SouthernBiotech, Birmingham, Alabama, USA	0100-20	Histology
iBOND Universal	Patterson Dental, Richmond, Virginia, USA	044-1113	Headplate &Headset Implantation; for  securing stainless steel wires to the skull
Low toxicity silicon adhesive	World Precision Instruments, Sarasota, Florida, USA	KWIK-SIL	Headplate
Micro-Manipulator System	New Scale Technologies, Victor, New York, USA	Multi-Probe Manipulator: XYZ Stage Assembly: 06464-0000, MPM System Kit: 06267-3-0001, MPM-Platform-360, MPM ring for MPM Manual Arms, MPM_Ring-72 DEG: 06262-3-0000	Silicon probe recording; inserting the probe into the brain
Microprobes	UCLA, Los Angeles, California, USA	256 ANS, 64M	Discontinued; alternative silicon probes can be purchased from Neuropixels
Mineral Oil	Sigma Aldrich, Saint Luis, Missouri, USA	M8410-100ML	Silicon probe recording; preventing the tissue from drying during the recording
Normal saline	ThermoFisher Scientific, Waltham, Massachusetts, USA	Z1376	Headplate &Headset Implantation; preventing the brain from drying during the surgery
PFA-Coated Stainless Steel Wire-Diameter 0.008 in. coated with striped ends	A-M systems, Sequim, Washington, USA	791400	ECoG Headset & reference electrode for ECoG
Platinum wire 24AWG	World Precision Instruments, Sarasota, Florida, USA	PTP201	Reference electrode for the silicon probe recording
Shandon Colorfrost Plus microscope slides	ThermoFisher Scientific, Waltham, Massachusetts, USA	99-910-01	Histology
Stainless steel Headplate	Star Rapid, China	custom made part	Headplate &Headset Implantation; design available upon request
Stereotaxic apparatus	KOPF, Tujunga, California, USA	Model 940 Small Animal Stereotaxic Instrument with Digital Display Console	Headplate &Headset Implantation