頭部固定マウスの脳幹からの急性単一ユニット多電極記録

要約

このプロトコルは、頭部固定マウスの脳幹から in vivoで高密度の単一ニューロン記録を取得する方法を説明する。このアプローチは、全身麻酔前および全身麻酔中に、腹外側水道周囲灰色 (急速眼球運動 (REM) 睡眠中に不活性な脳幹領域) のニューロンの活動電位発火を測定するために展開されます。

要約

シリコン多電極ベースの記録は、多くの脳領域における活動電位の時間分解能でニューロン活動を研究するためにますます人気が高まっています。しかし、マルチチャネルプローブを使用して脳幹のような深部尾側構造からのニューロン活動を記録することは依然として困難です。大きな懸念事項は、上矢状静脈洞や横静脈洞などの大きな血管を避けるプローブ挿入の軌道を見つけることです。これらの大きな静脈を損傷すると、広範な出血、下にある脳組織の損傷、そして潜在的に死に至る可能性があります。このアプローチでは、前座標と角度付きアプローチを結合して脳幹構造を標的とし、記録プローブが高リスク血管構造の下の脳を貫通できるようにする方法を説明しています。厳密に垂直なアプローチと比較して、角度付きアプローチは、ターゲットにできる脳領域の数を最大化します。この戦略を使用すると、レム睡眠に関連する脳幹領域である腹外側脳水道周囲灰色 (vlPAG) に再現性があり確実にアクセスして、セボフルラン麻酔前および麻酔中に頭部固定マウスで単一ユニットの多電極記録を取得できます。vlPAGおよび周囲の核のニューロン活動を高い時間分解能で記録する能力は、レム睡眠と麻酔の関係の理解を前進させる一歩です。

概要

シリコンマルチ電極ベースの記録は、単一活動電位分解能1,2,3,4で多くの脳領域にわたるニューロン活動を測定するためにますます人気が高まっています。この10年間で、高密度記録技術は大幅に進歩しました。現在のシリコンベースの記録電極は、多チャンネル数、光ファイバー、および皮質電図(ECoG)記録デバイス^5,6に対応できます。さらに、これらの電極の慢性的な埋め込みは、長期記録^7,8を可能にする。

近年の技術の進歩にもかかわらず、マルチチャネルプローブで脳幹のような深部尾側構造を標的とすることは依然として困難です。腹外側脳水道周囲灰色(vlPAG)などの脳幹構造を標的とする場合、大きな障害の1つは、主要な血管(上矢状静脈洞や横静脈洞など)を回避するプローブ軌道を特定することです。これらの大きな静脈の損傷は、広範な出血、下にある脳組....

プロトコル

すべての研究は、バージニア大学(バージニア州シャーロッツビル)の施設動物管理および使用委員会によって承認されました。体重25-30gの生後3-7ヶ月の雄C57BL/6Jマウス5匹を用いた。ここで使用する試薬や機器の詳細は、 資料表に記載されています。

1.ヘッドプレートとヘッドセットの埋め込み

1. ペルフルオロアルコキシ(PFA)コーティングされたステンレス鋼線を3ピンコネクタヘッダーにはんだ付けして、ECoGヘッドセットを作成します(図2A)。
2. マウス定位アトラス¹⁷に基づいて挿入座標を特定する。ピタゴラスの定理を使用してプローブ挿入の角度と深さを計算することは、特に文献に情報がほとんどない場合に、合理的な出発点です(図1)¹⁸。
   注:最終的には、試行錯誤によって座標が調整されます。vlPAGを標的とするために、成体マウスで次の座標を使用しました:前後(AP)-3.6 mm、中外側(ML)+ 0.5 mm、背腹側(DV)-4 mm。プローブは20°の角度で挿入されました(AP)。

ディスカッション

脳幹核は、呼吸、意識、睡眠などの基本的な機能を媒介する26,27,28。脳幹の位置(深部および後部)は、標準的な技術を使用してin vivoでそのニューロン活動を研究する上で課題となります。ここでは、頭部固定マウスでの再現性のある単一ユニット記録を可能にするために、角度付き前方アプ.......

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
1024 channel RHD Recording Controller	Intan Technologies, Los Angeles, California, USA	C3008	Silicon probe recording; recording hardware and software
24 mm x 50 mm No. 1.5 VWR coverslip	VWR, Radnor, Pennsylvania, USA	48393-081	Histology
4% PFA in PBS	ThermoFisher Scientific, Waltham, Massachusetts, USA	J61899.AK	Histology; perfusion solution
C&B metabond	Patterson Dental, Richmond, Virginia, USA	powder: 5533559, quick base: 5533492, catalyst: 55335007	Headplate &Headset Implantation
C57/6J mice 4-6 weeks, males	The Jackson Laboratory, Bar Harbor, Maine, USA	000664
Capnomac Ultima	Datex, Helsinki, Finland	ULT-SVi-27-07	Gas Analyzer; discontinued; alternative gas analyzer can be purchased from Bionet America
CM-DiI	ThermoFisher Scientific, Waltham, Massachusetts, USA	V22888	Red fluorescent dye for coating of the silicon probe
Connector Header	DigiKey, Thief River Falls, Minnesota, USA	1212-1788-ND	ECoG Headset
DAPI Fluoromount-G	SouthernBiotech, Birmingham, Alabama, USA	0100-20	Histology
iBOND Universal	Patterson Dental, Richmond, Virginia, USA	044-1113	Headplate &Headset Implantation; for  securing stainless steel wires to the skull
Low toxicity silicon adhesive	World Precision Instruments, Sarasota, Florida, USA	KWIK-SIL	Headplate
Micro-Manipulator System	New Scale Technologies, Victor, New York, USA	Multi-Probe Manipulator: XYZ Stage Assembly: 06464-0000, MPM System Kit: 06267-3-0001, MPM-Platform-360, MPM ring for MPM Manual Arms, MPM_Ring-72 DEG: 06262-3-0000	Silicon probe recording; inserting the probe into the brain
Microprobes	UCLA, Los Angeles, California, USA	256 ANS, 64M	Discontinued; alternative silicon probes can be purchased from Neuropixels
Mineral Oil	Sigma Aldrich, Saint Luis, Missouri, USA	M8410-100ML	Silicon probe recording; preventing the tissue from drying during the recording
Normal saline	ThermoFisher Scientific, Waltham, Massachusetts, USA	Z1376	Headplate &Headset Implantation; preventing the brain from drying during the surgery
PFA-Coated Stainless Steel Wire-Diameter 0.008 in. coated with striped ends	A-M systems, Sequim, Washington, USA	791400	ECoG Headset & reference electrode for ECoG
Platinum wire 24AWG	World Precision Instruments, Sarasota, Florida, USA	PTP201	Reference electrode for the silicon probe recording
Shandon Colorfrost Plus microscope slides	ThermoFisher Scientific, Waltham, Massachusetts, USA	99-910-01	Histology
Stainless steel Headplate	Star Rapid, China	custom made part	Headplate &Headset Implantation; design available upon request
Stereotaxic apparatus	KOPF, Tujunga, California, USA	Model 940 Small Animal Stereotaxic Instrument with Digital Display Console	Headplate &Headset Implantation