הקלטות חד-אלקטרודות חד-אלקטרודות חד-פעמיות חריפות מגזע המוח של עכברים בעלי ראש קבוע

Summary

פרוטוקול זה מתאר שיטה להשגת הקלטות של נוירון יחיד בצפיפות גבוהה מגזע המוח של עכברים בעלי ראש קבוע. גישה זו מיושמת כדי למדוד את פוטנציאל הפעולה של ירי נוירונים באפור פריאקוודוקטלי וונטרולטרלי - אזור בגזע המוח שאינו פעיל במהלך שנת REM (Rapid Eye Movement) - לפני ובמהלך הרדמה כללית.

Abstract

הקלטות מבוססות סיליקון רב-אלקטרודות פופולריות יותר ויותר לחקר פעילות עצבית ברזולוציה הטמפורלית של פוטנציאלי פעולה באזורים רבים במוח. עם זאת, רישום פעילות עצבית ממבנים קאודליים עמוקים כמו גזע המוח באמצעות בדיקות רב-ערוציות נותר מאתגר. חשש משמעותי הוא מציאת מסלול החדרת בדיקה שימנע כלי דם גדולים, כגון הסינוס הוורידי העליון והסינוס הורידי הרוחבי. פגיעה בוורידים הגדולים הללו עלולה לגרום לדימום נרחב, נזק לרקמת המוח הבסיסית ואולי אף למוות. גישה זו מתארת מיקוד מבנים בגזע המוח על ידי צימוד קואורדינטות קדמיות עם גישה זוויתית, המאפשרת לגשושית ההקלטה לחדור למוח מתחת למבני כלי דם בסיכון גבוה. בהשוואה לגישה אנכית לחלוטין, הגישה הזוויתית ממקסמת את מספר אזורי המוח שניתן לכוון. באמצעות אסטרטגיה זו, ניתן לגשת לאפור פריאקוודוקטלי וונטרולטרלי (vlPAG), אזור בגזע המוח הקשור לשנת REM, באופן משוחזר ואמין כדי להשיג הקלטות מרובות אלקטרודות ביחידה אחת בעכברים קבועי ראש לפני ובמהלך הרדמה סבופלורנית. היכולת לרשום פעילות עצבית ב-vlPAG ובגרעינים הסובבים אותו ברזולוציה טמפורלית גבוהה היא צעד קדימה בקידום הבנת הקשר בין שנת REM להרדמה.

Introduction

הקלטות מבוססות סיליקון מבוססות אלקטרודות הופכות פופולריות יותר ויותר למדידת פעילות עצבית באזורים רבים במוח עם רזולוציה פוטנציאלית של פעולה יחידה 1,2,3,4. במהלך העשור האחרון, טכנולוגיית הקלטה בצפיפות גבוהה גדלה במידה ניכרת. אלקטרודות הקלטה מבוססות סיליקון נוכחיות יכולות להכיל ספירות ערוצים גבוהות, סיבים אופטיים והתקני הקלטה אלקטרוקורטיקוגרפיה (ECoG) ^5,6. יתר על כן, השתלה כרונית של אלקטרודות אלה מאפשרת הקלטות ארוכות טווח ^7,8.

למרות ההתקדמות הטכנולוגית האחרונה, התמקדות במבנים קאודליים עמוקים כמו גזע המוח באמצעות גשושיות רב-ערוציות נותרה מאתגרת. כאשר מתמקדים במבנים בגזע המוח כגון האפור הפריאקוודוקטלי הוונטרולטרלי (vlPAG), מכשול משמעותי אחד הוא זיהוי מסלול בדיקה הנמנע מכלי דם מרכזיים, למשל, הסינוס הוורידי העליון והסינוס הורידי הרוחבי. פגיעה בוורידים גדולים אלה עלולה לגרום לדימום נרחב, נזק לרקמת המוח הבסיסית ואפילו למוות ^9,10. אנו מציעים לכוון מבנים של גזע המוח מקואורדינטות קדמיות בזווית, מה שיאפשר לגשושית ההקלטה לחדור למוח מתחת למבנים וסקולריים בסיכון גבוה כאלה (ראו איור 1). גישה זוויתית זוויתית, בהשוואה לגישה אנכית, ממקסמת את מספר אזורי המוח הנגישים להקלטה. בנוסף, בנסיבות ניסיוניות שבהן יש צורך בהקלטות ECoG, הגישה הקדמית הזוויתית מאפשרת יותר משטח גולגולת זמין להשתלת אוזניות ECoG, מכיוון שחלון הקרניוטומיה להחדרת בדיקה ממוקם קדמית יותר^10,11.

זיהוי קבוצות התאים והמעגלים הספציפיים האחראים לשינויים בשנת REM הנגרמים על ידי הרדמה נותר מטרה עיקרית של מחקר הרדמה. לפיכך, המטרה כאן הייתה לגשת באופן משוחזר ואמין ל-vlPAG - אזור בגזע המוח הקשור לשנת REM - כדי להשיג רישומים חד-יחידתיים, מרובי אלקטרודות בעכברים קבועי ראש לפני ובמהלך הרדמה סבופלורנית^12,13. מחקרים קודמים השתמשו במדידות אלקטרופיזיולוגיות של פוטנציאל שדה מקומי (LFP) של vlPAG בעכברים ערים כדי לזהות שינויים במצב העצבי הקשורים להרדמה^14,15. עם זאת, מדידות LFP רגישות בעיקר לפעילות סינפטית, ולא לפוטנציאלי פעולה, בתוך האזור המתועד¹⁶. כתוצאה מכך, נותרה הבנה מוגבלת של האופן שבו חומרי הרדמה משפיעים ישירות על דפוסי הפעילות העצבית המיוצרים על-ידי נוירוני vlPAG. כאן, מתוארת שיטה להשגת הקלטות נוירון יחיד בצפיפות גבוהה מגזע המוח של עכברים קבועי ראש. שיטה זו יכולה גם להיות מותאמת לרישום פעילות נוירון יחיד ממבנים שונים אחרים בגזע המוח העמוק והאחורי.

Protocol

כל המחקרים אושרו על ידי הוועדה המוסדית לטיפול ושימוש בבעלי חיים באוניברסיטת וירג'יניה (שרלוטסוויל, וירג'יניה). נעשה שימוש בחמישה עכברי C57BL/6J זכרים בגילאי 3-7 חודשים, במשקל 25-30 גרם. פרטי הריאגנטים והציוד המשמש כאן מפורטים בטבלת החומרים.

1. השתלת לוחית ראש ואוזניות

1. צרו אוזניות ECoG על-ידי הלחמת חוט נירוסטה מצופה פרפלואורואלקוקסי (PFA) לראש מחבר של 3 פינים (איור 2A).
2. זהה את קואורדינטות ההכנסה בהתבסס על אטלס סטריאוטקסי של עכבר¹⁷. שימוש במשפט פיתגורס כדי לחשב את הזווית והעומק של החדרת הגשושית – במיוחד כאשר יש מעט מידע בספרות – הוא נקודת התחלה סבירה (איור 1)¹⁸.
   הערה: בסופו של דבר, הקואורדינטות יותאמו באמצעות ניסוי וטעייה. כדי להתמקד ב-vlPAG השתמשו בקואורדינטות הבאות בעכברים בוגרים: אנטרופוסטריור (AP) -3.6 מ"מ, בינוני (ML) +0.5 מ"מ, דורסו-ונטרלי (DV) -4 מ"מ. הגשושית הוכנסה בזווית של 20° (AP).
3. יש לגרום להרדמה כללית על ידי הנחת העכבר בתא האינדוקציה (1.5%-3% איזופלורן בחמצן). לאחר הרדמה, מקם את העכבר במסגרת הסטריאוטקסית, הניח את אפו של בעל החיים בחרוט האף וייצב את הראש עם מוטות הראש.
4. החל משחה אופתלמית על העיניים כדי למנוע נזק הקרנית. השתמש במערכת בקרת טמפרטורה כדי לשמור על טמפרטורת הגוף ב 37 ° C.
5. יש למרוח קרם להסרת שיער או לגלח פרווה על הקרקפת, ולאחר מכן לחטא עם יוד פובידון ואלכוהול 70%. השתמש בטכניקה אספטית 'טיפים בלבד' כדי לשמור על שדה כירורגי סטרילי.
6. בצע בדיקת צביטת בוהן כדי לבדוק את עומק ההרדמה.
7. מתן שיכוך כאבים: קרפרופן 2.5 מ"ג/ק"ג, ניתן תת עורית בגב.
8. בצע חתך קרקפת 5 מ"מ כדי להסיר כתם עגול של העור מעל עצמות הקודקוד והעורף. הסר בעדינות את קרומי המוח על ידי גירודם עם להב האזמל.
9. השתמש בלהב האזמל כדי לחתוך חיבורי שרירים ולחשוף את עצמות הקודקוד והעורף¹⁹. יש למרוח מי חמצן לפי הצורך כדי לשלוט בדימום ולייבש את פני הגולגולת. חיוני למרוח מלט דנטלי ושרף על גולגולת יבשה כדי להשיג קשר חזק.
10. ראשית, זהה את ציוני הדרך ברגמה ולמבדה על הגולגולת²⁰. לאחר מכן, התאימו את מיקום חרוט האף כדי ליישר את המיקום הקדמי-אחורי של הגולגולת, וודאו שלא קיים הפרש גובה של יותר מ-100 מיקרומטר בין שני ציוני הדרך.
11. כדי ליישר את המיקום המדיאלי-לטרלי של הגולגולת, בחר שתי נקודות מנוגדות בין ברגמה ללמדא, כל אחת 1 מ"מ מתפר הקשת ובדוק את רמתן. אם יש הפרש גובה של יותר מ-100 מיקרומטר ביניהם, התאימו את המיקום האמצעי-לטרלי של הגולגולת על ידי מניפולציה של מוטות הראש.
12. מדדו את המרחק בין ברגמה ללמדא והשוו אותו למרחק שדווח באטלס הסטריאוטקסי של פרנקלין-פקסינוס (בדרך כלל 4.2 מ"מ)¹⁷. השתמש בהפרש בין המרחק הנמדד למרחק המדווח כדי לשנות את קנה המידה של נקודת הגישה באופן פרופורציונלי. סמן קואורדינטות קרניוטומיה על הגולגולת עם עיפרון מעוקר.
    הערה: אם המרחק הנמדד bregma-lambda שונה מ 4.2 מ"מ, אז הקואורדינטות צריכות להיות בקנה מידה פרופורציונלי. כל קואורדינטות AP המדווחות באטלס סטריאוטקסי תואמות למרחק ברגמה-למדא סטנדרטי. מכיוון שגודל גולגולת העכבר משתנה, חשוב להתאים את הקואורדינטות בהתאם.
13. באמצעות מיקרומניפולטור סטריאוטקסי, מקמו את לוחית הראש ישירות על גבי תפר הלמדא, והדקו אותה לגולגולת על-ידי מריחת מלט דנטלי על לוחית הראש ומסביבה (איור 3A,B). יש להמתין לפחות 10 דקות לייבוש המלט.
14. קדח חורים (בקוטר 0.5 מ"מ) עבור שתי אלקטרודות קליפת המוח (קליפת המוח הקדמית והקודקודית) ועבור אחת שתשמש כאלקטרודת ייחוס (המוח הקטן). הניחו את הקצוות המופשטים (0.5 מ"מ) של אלקטרודות חוטי כסף מצופות בתוך חורי הבור והדקו באמצעות שרף המופעל על ידי אור אולטרה סגול.
15. כסו לחלוטין את חוטי הנירוסטה המצופים במלט דנטלי כך שאף חוט לא ייחשף. כסו את החלק התחתון והצדדים של האוזנייה במלט דנטלי כך שהוא יהיה יציב במקומו. ודאו שתפרי ברגמה ולמבדה נשארים גלויים ברגע שהאוזנייה מאובטחת במקומה (איור 2B).
16. תן לעכבר להתאושש במשך מינימום של 7 ימים, לבחון את החיה ואת האתר כירורגי מדי יום עבור כל חריגות. מתן משככי כאבים (קרפרופן 2.5 מ"ג/ק"ג, SC) לפי הצורך.

2. מיקום והקלטה של גשושית סיליקון

1. הרגילו את העכבר למתקן ההקלטה ולקיבוע הראש (לפחות שעה וחצי בשני ימים נפרדים) (איור 2D).
2. ביום ההקלטה יש להכניס את העכבר לתא ההרדמה (איזופלורן 1.5%-3% בחמצן).
3. מקם את העכבר במסגרת סטריאוטקסית, התאם את חרוט האף ואת מוטות הראש כמתואר ב- 1.3. לשמור על הרדמה (איזופלורן 1.5%-3% בחמצן) לאורך כל הניתוח הסטריאוטקסי. בצע בדיקת צביטת בוהן כדי לבדוק את עומק ההרדמה.
4. החל משחה אופתלמית על העיניים ולשמור על טמפרטורת הגוף נאותה.
5. זהה ברגמה ולמבדה, וודא שלא קיים הפרש גובה של יותר מ -100 מיקרומטר בין שני ציוני הדרך האנטומיים.
6. מצא וסמן את הקואורדינטות המחושבות על הגולגולת בעיפרון סטרילי, ולאחר מכן צור מתאר של חלון קרניוטומיה בגודל 2 מ"מ x 2 מ"מ סביב הקואורדינטות.
7. בצע בדיקת צביטת בוהן כדי לבדוק את עומק ההרדמה.
8. השתמש במקדחה במהירות גבוהה כדי ליצור חלון קרניוטומיה בגודל 2 מ"מ x 2 מ"מ. יש למרוח 0.5-1 מ"ל של מי מלח רגילים כדי למנוע התייבשות של פני המוח. מוציאים את הדורה בעזרת מחט מזרק ומלקחיים עדינים.
   הערה: שימו לב לכלי דם עיקריים (סינוס סגיטלי עליון, סינוס רוחבי) כדי למנוע דימום יתר (איור 3).
9. השתמש במקדחה במהירות גבוהה כדי ליצור חור בור נפרד לאלקטרודת הייחוס של גשושית הסיליקון, בדרך כלל ~ 1-2 מ"מ מחלון הגולגולת.
10. החל 0.2 מ"ל רעילות נמוכה דבק סיליקון על הגולגולת כדי לאטום לחלוטין את craniotomy, באמצעות המוליך המצורף.
11. תן לעכבר להתאושש במשך כשעה אחת.
12. הצמידו את ראש העכבר למתקן ההקלטה האלקטרופיזיולוגי באמצעות לוחית הראש והברגים (איור 2D).
13. צפו את שוק החללית סיליקון בצבע הפלואורסצנטי DiI (1:4 DiI:Ethanol) כך שניתן יהיה לשחזר את מסלול הגשושית לאחר הניסוי.
14. הרכיבו את הגשושית על המניפולטור וקבעו את הזווית הרצויה. כדי לכוון את vlPAG, הוחלה זווית AP של 15-20°.
15. הורידו את גשושית ההקלטה לפני השטח של המוח במרכז חלון הגולגולת. ראשית, הכנס ידנית את הגשושית לעומק של ~300 מיקרומטר. לאחר החדרתה לעומק הזה, הורידו את הגשושית באופן אוטומטי (למשל, 200 מיקרומטר/דקה) לעומק הממוקד כדי למזער את הנזק לרקמה²¹ (איור 2C).
    הערה: בתחילה מומלצת הכנסה ידנית של הבדיקה. החדרת בדיקה ידנית מבטיחה את היכולת לעצור ולמשוך את הגשושית אם היא מתכופפת עם הכנסתה הראשונית. ברגע שהגשושית חודרת במלואה לרקמה, בדרך כלל בטוח להמשיך לרדת בבדיקה במצב אוטומטי.
16. יש למרוח שמן מינרלי על משטח המוח בתוך חלון הקרניוטומיה כדי למנוע התייבשות.
17. הניחו לבדיקת ההקלטה להסתפק ב-10 דקות לאחר ההכנסה.
18. הקלט נתונים מגשושית הסיליקון ומ- ECoG במהירות של 30kHz באמצעות בקר הקלטה Intan.
19. 1-2 שעות לאחר ההקלטה, השתמש בטכניקת זילוח הלב כדי לתקן את המוח ב 4% paraformaldehyde²².
    הערה: בגלל המלט, ייתכן שיהיה קשה להסיר את החלק הרוסטרלי של הגולגולת. לכן עדיף להוציא את המוח על ידי הסרת החלקים הגביים של הגולגולת.
20. ערפו את ראשו של העכבר, חתכו את העור בעקבות קו האמצע בצד הגבי, מהצוואר ועד הלסת התחתונה. הסר שרירים ורקמות המחוברים לגולגולת, חתוך את הלסת התחתונה לגישה קלה יותר למוח.
21. אם הזלוף נעשה כראוי המוח צריך להתכווץ קצת, משאיר מספיק מקום כדי להכניס מספריים עדינים בחלק הגבי של מגנום foramen. בצע חתך מדיאלי אחד, אחד לרוחב ואחד קונטרלטרלי, בגודל של כ -1 מ"מ, בעצם העורפית.
22. בזהירות להסיר את החלק הגבי של הגולגולת באמצעות מלקחיים אופתלמיים. התחל בעצם העורפית, הסר את כל שברי הגולגולת עד שכל החלק הגבי של המוח נחשף.
23. החליקו מרית מיקרו מתחת למוח, התחילו בנורות הריח כדי להוציא את המוח החוצה.
24. לאחר ניקוב והסרה, המוח יכול להיות מאוחסן 4% paraformaldehyde ב 4 ° C במשך 24-48 שעות.

3. היסטולוגיה לשחזור מסלול בדיקה

1. חלק את המוח למקטעים קורונליים של 70 מיקרומטר באמצעות ויברטום.
2. הרכבה של המקטעים בשקופיות באמצעות אמצעי הרכבה DAPI שמכתים גרעיני תאים. מכסים ואוטמים את המגלשות בלק שקוף.
3. דמיינו את השקופיות במיקרוסקופ פלואורסצנטי. כוונן את הניגודיות/בהירות כך שרצועות הבדיקה יהיו גלויות בבירור. ודאו שגודל קובץ תמונת tiff המתקבל קטן מ- 10MB, כך שקודי MATLAB יפעלו בצורה חלקה. שחזר את רצועות הגשושית באמצעות קוד MATLAB²³.

4. ניתוח נתונים אלקטרופיזיולוגיים

1. נתח אותות עצביים מוקלטים מגשושית הסיליקון באמצעות תוכנת זיהוי ומיון אוטומטי (Kilosort)²⁴.
2. סווג ידנית אשכולות שזוהו עם Phy כיחידות מרובות או בודדות²⁵. לסווג אשכולות כיחידות בודדות כאשר יש להם צורת גל ספייק פיזיולוגית, להראות תקופה עקשנית בקורלוגרמה הצולבת, והתפלגות נורמלית של תצוגת משרעת.
3. ייבאו נתוני יחידה בודדת ל-MATLAB ונתחו²³.

תוצאות

חמישה גברים C57BL/6J הושתלו עם אוזניות ECoG ולוחית ראש (איור 4A). לאחר ההתאוששות, עכברים הורגלו לקיבוע ראש ולמתקן ההקלטה האלקטרופיזיולוגי במהלך שני מפגשים של שעה וחצי בימים נפרדים (איור 4B). לאחר מכן, נוצר חלון קרניוטומיה בגודל 2 מ"מ על 2 מ"מ (

Discussion

גרעיני גזע המוח מתווכים תפקודים בסיסיים כגון נשימה, תודעה ושינה 26,27,28. מיקומו של גזע המוח (עמוק ואחורי) מהווה אתגר בחקר פעילותו העצבית in vivo באמצעות טכניקות סטנדרטיות. כאן מוצגת גישה קדמית זוויתית המאפשרת הקלטה של יח?...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
1024 channel RHD Recording Controller	Intan Technologies, Los Angeles, California, USA	C3008	Silicon probe recording; recording hardware and software
24 mm x 50 mm No. 1.5 VWR coverslip	VWR, Radnor, Pennsylvania, USA	48393-081	Histology
4% PFA in PBS	ThermoFisher Scientific, Waltham, Massachusetts, USA	J61899.AK	Histology; perfusion solution
C&B metabond	Patterson Dental, Richmond, Virginia, USA	powder: 5533559, quick base: 5533492, catalyst: 55335007	Headplate &Headset Implantation
C57/6J mice 4-6 weeks, males	The Jackson Laboratory, Bar Harbor, Maine, USA	000664
Capnomac Ultima	Datex, Helsinki, Finland	ULT-SVi-27-07	Gas Analyzer; discontinued; alternative gas analyzer can be purchased from Bionet America
CM-DiI	ThermoFisher Scientific, Waltham, Massachusetts, USA	V22888	Red fluorescent dye for coating of the silicon probe
Connector Header	DigiKey, Thief River Falls, Minnesota, USA	1212-1788-ND	ECoG Headset
DAPI Fluoromount-G	SouthernBiotech, Birmingham, Alabama, USA	0100-20	Histology
iBOND Universal	Patterson Dental, Richmond, Virginia, USA	044-1113	Headplate &Headset Implantation; for  securing stainless steel wires to the skull
Low toxicity silicon adhesive	World Precision Instruments, Sarasota, Florida, USA	KWIK-SIL	Headplate
Micro-Manipulator System	New Scale Technologies, Victor, New York, USA	Multi-Probe Manipulator: XYZ Stage Assembly: 06464-0000, MPM System Kit: 06267-3-0001, MPM-Platform-360, MPM ring for MPM Manual Arms, MPM_Ring-72 DEG: 06262-3-0000	Silicon probe recording; inserting the probe into the brain
Microprobes	UCLA, Los Angeles, California, USA	256 ANS, 64M	Discontinued; alternative silicon probes can be purchased from Neuropixels
Mineral Oil	Sigma Aldrich, Saint Luis, Missouri, USA	M8410-100ML	Silicon probe recording; preventing the tissue from drying during the recording
Normal saline	ThermoFisher Scientific, Waltham, Massachusetts, USA	Z1376	Headplate &Headset Implantation; preventing the brain from drying during the surgery
PFA-Coated Stainless Steel Wire-Diameter 0.008 in. coated with striped ends	A-M systems, Sequim, Washington, USA	791400	ECoG Headset & reference electrode for ECoG
Platinum wire 24AWG	World Precision Instruments, Sarasota, Florida, USA	PTP201	Reference electrode for the silicon probe recording
Shandon Colorfrost Plus microscope slides	ThermoFisher Scientific, Waltham, Massachusetts, USA	99-910-01	Histology
Stainless steel Headplate	Star Rapid, China	custom made part	Headplate &Headset Implantation; design available upon request
Stereotaxic apparatus	KOPF, Tujunga, California, USA	Model 940 Small Animal Stereotaxic Instrument with Digital Display Console	Headplate &Headset Implantation