Disposición espacialmente compacta de secciones de larvas de pez cebra para análisis transcriptómico espacial

Resumen

Aquí, presentamos un método para alinear y crioseccionar múltiples muestras de larvas de pez cebra (Danio rerio) y recolectarlas en un solo portaobjetos para el análisis transcriptómico espacial.

Resumen

Las técnicas transcriptómicas espaciales son una herramienta sofisticada en la investigación biomédica para visualizar patrones de expresión génica registrados espacialmente. La obtención de imágenes y el análisis de múltiples muestras con plataformas de imágenes espaciales pueden ser costosos. La realización de estas pruebas en múltiples condiciones experimentales, como se ha visto en los estudios de desarrollo, aumenta aún más los costos. Para reducir costos, este estudio buscó optimizar las técnicas y estrategias de disposición de muestras transcriptómicas espaciales para estudios de desarrollo. Aquí, el estudio utilizó peces cebra, que son un modelo de vertebrados en desarrollo bien establecido que es transparente durante el desarrollo, tienen ~ 70% de homología genética con los humanos y un genoma altamente anotado ideal para el análisis transcriptómico. Debido a su pequeño tamaño, el pez cebra en desarrollo también permite la colocación compacta de secciones en serie a través de varias réplicas biológicas. En este artículo, informamos sobre la fijación optimizada, la criosección y la alineación confiable de múltiples muestras de peces dentro del área de imágenes de una plataforma de imágenes espaciales de hibridación in situ múltiple . Con este método, el pez cebra de tan solo 15 días después de la fertilización (dpf) de al menos 4 moldes diferentes y hasta 174 secciones puede crioseccionarse con éxito, recolectarse dentro del área de imagen de 22 mm 10,5 mm (para un portaobjetos transcriptómico espacial in situ ) y procesarse simultáneamente. En función de la calidad de la sección, la alineación de la muestra y el tamaño de la muestra por portaobjetos, este método en el pez cebra optimiza la salida y el coste por muestra de las técnicas transcriptómicas espaciales.

Introducción

La evaluación de patrones de expresión espacialmente distintos en los tejidos sigue siendo fundamental para nuestra comprensión de las influencias genómicas en el desarrollo, el cáncer y la enfermedad ^1,2,3. La transcriptómica espacial combina técnicas de expresión multiplexada con el registro espacial de la expresión en tejidos. La "transcriptómica espacial" fue acuñada por primera vez por Ståhl y sus colegas⁴, donde los especímenes de cáncer montados se sondearon utilizando secuenciación de próxima generación in situ. Desde entonces, la "transcriptómica espacial" se ha utilizado como un cajón de sastre para los estudios de expresión de alto rendimiento combinados con el registro espacial. Si bien se trata de herramientas poderosas, también son empresas costosas que a menudo requieren grandes inversiones institucionales y costos de laboratorio antes de que se puedan generar datos⁵. Las estrategias para minimizar los costos y preservar los datos de alta calidad tienen una gran demanda.

El pez cebra, Danio rerio, se ha convertido en un importante sistema modelo para el estudio de la biología del desarrollo y ofrece un medio para multiplicar los análisis de órganos (y organismos) completos de vertebrados en un espacio limitado. Los peces cebra son pequeños (4-6 mm como larvas y 2-3 cm como adultos) y pueden poner cientos de huevos transparentes a la vez⁶. Los embriones de pez cebra se fertilizan externamente y se desarrollan rápidamente, lo que permite a los investigadores introducir transgenes en etapas tempranas de desarrollo para generar fácilmente alelos de ganancia y pérdida de función⁷. Colocar varios especímenes en un solo portaobjetos es una estrategia atractiva para reducir costos. Su alta fecundidad y pequeño tamaño hacen del pez cebra un candidato ideal para ensayos transcriptómicos espaciales multiplexados que tienen un espacio restringido para los especímenes⁸.

La criosección de larvas de pez cebra es una técnica desafiante. Muchas plataformas transcriptómicas espaciales no se han optimizado para las secciones de parafina del pez cebra y requieren criosecciones cuando se trabaja con el pez cebra como organismo modelo para preservar la estructura del tejido y retener las transcripciones de ARN. Además, el pequeño tamaño del pez cebra dificulta la obtención de criosecciones de calidad y el análisis eficaz de múltiples muestras. Esta tarea se vuelve más difícil cuando se trabaja con larvas de pez cebra que son más pequeñas y frágiles que sus contrapartes adultas. Para superar estos desafíos, describimos un método que alinea de manera confiable múltiples muestras y utiliza el área de imágenes de las plataformas de imágenes espaciales de manera eficiente para obtener muchas secciones de alta calidad en un solo portaobjetos que luego pueden ser visualizadas y analizadas por plataformas de imágenes espaciales (Figura 1). En este caso, este método se aplica a una plataforma de imágenes transcriptómicas espaciales.

Protocolo

Este protocolo sigue las pautas del comité institucional de cuidado y uso de animales de Dartmouth College.

1. Preparación del criostato

1. Enfríe el criostato a -22 °C y limpie las superficies interiores del criostato cepillando los residuos en el receptáculo. Coloque todos los cepillos y herramientas necesarios dentro de la cámara.

2. Preparación del molde base desechable

1. Prepare un molde base (molde de plástico desechable de 37 mm, 24 mm, 5 mm) para la alineación de muestras dibujando una línea recta a través del interior de un molde base con un marcador permanente para usarlo como punto de referencia para la alineación de muestras. Coloque un pedazo de cinta de laboratorio en el interior del molde base donde debe estar la línea recta antes de dibujar una línea para obtener mejores resultados (Figura 2A).
2. Dibuje un punto en el interior del molde base cerca de la pared izquierda o derecha para garantizar la orientación adecuada de la muestra durante la criosección (Figura 2B).
3. Mida el ángulo de corte deseado con un transportador y márquelo en el interior del molde base para cada muestra (Figura 2C).
4. Aplique una capa superficial de medio de congelación (tomografía de coherencia óptica [OCT]) al molde base preparado. Asegúrese de que haya suficiente medio de congelación para cubrir las muestras.
   1. Evite las burbujas de aire al aplicar el medio de congelación cebando la boquilla de la botella mediana y agregando la cantidad necesaria de medio a una esquina del molde base antes de cambiar el plano horizontal del molde base para que el medio se distribuya uniformemente por toda la superficie.
   2. Apriete el frasco lentamente cuando dispense el medio de congelación.
5. Agregue hielo a un vaso de precipitados de 1 L, coloque el molde base con medio de congelación en el baño de hielo e incube durante al menos 10 minutos para enfriar el medio.

3. Preparación de hielo seco: baño de etanol 100%

1. Prepare un baño de hielo seco y etanol 100% en una campana extractora agregando una parte de etanol 100% a una parte de hielo seco en un balde de hielo.
2. Use un plato de aluminio desechable o doble el papel de aluminio en un bote lo suficientemente grande como para caber en un molde de base desechable. Asegúrese de que el plato o bote sea lo suficientemente grande para que el molde base quede completamente plano.
3. Coloque el plato o el bote en la bañera y cubra el balde. Espere de 5 a 10 minutos para que el balde se enfríe antes de congelar las muestras.

4. Eutanasia de muestras

1. Seleccione al azar el pez cebra para seccionar. Si las muestras varían en tamaño, sepárelas en grupos por tamaño relativo para facilitar la alineación precisa (consulte la discusión para obtener más detalles). Coloque los peces más grandes y los peces más pequeños en platos separados.
2. Llene un vaso de precipitados con agua del sistema de peces y colóquelo en un cubo de hielo. Rodea el vaso de precipitados con hielo.
3. Controle la temperatura del agua con un termómetro. Deje que la temperatura se estabilice entre 2-4 °C.
4. Use una red o un colador para poner un grupo de peces en el agua a 4 ° C. Los peces deben estar completamente sumergidos en el agua y no en contacto con el hielo. Una vez que haya cesado el movimiento opercular, agregue hielo al agua para asegurarse de que permanezca por debajo de los 4 ° C. Deje los peces en agua a 4 °C durante 10 min.
   NOTA: Continúe con la inclusión, alineación y congelación instantánea de cada grupo de muestras eutanasiadas antes de sacrificar al siguiente grupo. Reemplace el agua cada vez.

5. Incrustación y alineación

1. Recoja los peces sacrificados después de haberlos sumergido en agua a 4 °C durante 10 minutos. Retire los peces del agua con pinzas de punta fina agarrándolos por la aleta caudal y séquelos presionándolos suavemente contra una toallita absorbente que no suelte pelusa.
   NOTA: En el caso de las secciones de alta calidad, es fundamental limitar el tiempo entre la extracción del pescado del agua a 4 °C y la congelación instantánea
2. Trabajando con el molde base preparado en un baño de hielo bajo un microscopio estereoscópico (aumento de 10x), coloque cada muestra en el molde base a lo largo de los puntos de referencia en la orientación correcta y cubra suavemente las muestras con otra capa delgada de medio de congelación.
   NOTA: No llene todo el molde con medio de congelación. En su lugar, use solo una capa delgada, lo suficiente para cubrir todas las muestras.
3. Use un punto de referencia anatómico para alinear con precisión el pez con las líneas marcadas en el interior del molde base. Use pinzas de punta fina para ajustar la orientación de cada pez de modo que estén alineados y en la misma orientación. Evite crear burbujas en el medio de congelación moviéndose lentamente.
4. Aplique un trozo de hielo seco en el fondo del molde base debajo de las muestras hasta que se congelen localmente en su posición. Mantenga el plano horizontal del molde base nivelado para evitar que las muestras se desvíen de sus puntos de referencia antes de congelarlas en su posición con hielo seco.
5. Coloque el molde base con las muestras en el bote o plato de aluminio en el baño de hielo seco: 100% etanol. Asegúrese de que el bote esté flotando en la superficie del baño y que el molde base permanezca seco. Cubra el baño y deje que las muestras floten durante 10 minutos.
6. Envuelva el molde base congelado en papel de aluminio y guárdelo en el congelador a -80 °C hasta que esté listo para seccionar. Repita los pasos 4.2 a 5.6 para los grupos restantes.

6. Crioseccionamiento

1. Lleve los moldes base congelados al criostato preenfriado para la crisección y colóquelos en la cámara de criostato. Transporta los bloques congelados en una caja con hielo seco para evitar que se descongelen.
2. Retire el portaobjetos de imágenes espaciales in situ del almacenamiento y colóquelo en un soporte de portaobjetos preenfriado. Guarde el portaobjetos con portaobjetos de imágenes espaciales en la cámara de criostato a -22 °C hasta que esté listo para recoger secciones de la región de interés.
3. Retire las muestras congeladas del molde base y luego congélelas en un mandril con un medio de congelación fresco. Congélelos en el mandril de modo que la superficie de corte quede orientada hacia la hoja.
4. Coloque una cuchilla de micrótomo nueva y fina en el criostato.
5. Alinee el molde con la cuchilla y recorte la región de interés (espesor de corte recomendado 20-50 μm). Asegúrese de que las marcas hechas dentro del molde se transfieran al bloque de muestras congeladas para ayudar a identificar la ubicación dentro de las muestras.
6. Ajuste el molde durante la fase de recorte para que la superficie de corte quede paralela a las marcas de referencia en el medio de congelación.
7. Recoja secciones en un portaobjetos de microscopio estándar con carga positiva y compruébelas mediante campo claro para confirmar cuándo ya no es necesario recortar.
8. Retire el portaobjetos de imágenes espaciales de la cámara de criostato y colóquelo en un baño de hielo a 4 °C. Mantenga la corredera en el soporte de la corredera. Asegúrese de que el tobogán no se moje.
9. Iniciar la criosección (recomendado 10-14 μm; Figura 3) y recoja secciones en portaobjetos cargados positivamente hasta que se alcance la región de interés en las muestras. Verifique las secciones por campo claro para confirmar que la región de interés será la siguiente sección del molde.
10. Lleve el portaobjetos de imágenes espaciales de una sola célula a la cámara de criostato. Retire la diapositiva del soporte de diapositivas y recoja secciones del área exacta de interés en la diapositiva de imágenes espaciales fila por fila con un pincel de punta fina para evitar que las secciones se enrollen.
    1. Presione una esquina del medio vacío y congelado en la etapa del cuchillo con la parte posterior del pincel para que la sección permanezca plana al agarrar el portaobjetos para recogerlo.
    2. Use la parte superior de la corredera como punto de pivote, baje lentamente la corredera sobre la sección y permita que las secciones se adhieran a la corredera durante 3 segundos antes de levantar la corredera de la etapa de la cuchilla.
    3. Trabaje de izquierda a derecha cuando recoja secciones en el área de imagen del portaobjetos y superponga capas de medio vacío y congelado cuando sea posible.
    4. Use bordes de papel de colores como referencia para colocar secciones dentro del área de imagen del portaobjetos si el tejido es difícil de ver.
11. Después de recoger secciones de la región de interés, vuelva a colocar la corredera en el soporte de la corredera. Si no hay más muestras para recolectar en el portaobjetos de imágenes espaciales, almacene el portaobjetos a -80 °C durante un máximo de 2 semanas hasta que esté listo para el análisis instrumental con la plataforma de imágenes espaciales in situ . Si es necesario recoger secciones de varios moldes, vuelva a colocar el portaobjetos de imágenes espaciales en el baño de hielo a 4 °C y repita los pasos 6.3-6.11 con el siguiente molde.
12. Recoja las secciones antes y después de las secciones de la región de interés de cada molde en un portaobjetos de microscopio estándar con carga positiva para la tinción de hematoxilina y eosina (HE) para verificar que la alineación de la muestra y la calidad de la sección sean suficientes antes de continuar con el análisis.

7. Fijación de la muestra

1. Retire los portaobjetos de referencia del criostato y séquelos al aire en RT durante 30 minutos para que se adhieran las secciones al portaobjetos.
2. Fije las secciones colocándolas en un recipiente con 4% de paraformaldehído (Tabla 1) durante 20 min.
3. Lave las secciones colocándolas en un recipiente deslizante con agua destilada durante 3 min.
4. Continúe con la tinción HE o seque y guarde los portaobjetos a -80 °C para futuras tinciones.

8. Tinción HE de las secciones

1. Deshidrate y limpie las secciones incubando los portaobjetos en etanol al 100% durante 2 minutos, etanol al 95% (Tabla 2) durante 2 minutos y luego agua del grifo durante 1 minuto. Use una gradilla de tinción de portaobjetos de microscopio para transferir los portaobjetos de un baño a otro.
2. Tiñir los núcleos y diferenciar incubando los portaobjetos en hematoxilina durante 2 min 45 s, agua del grifo durante 1 min, alcohol acidificado al 0,3% (Tabla 3) durante 1 min, y luego agua corriente del grifo durante 1 min. Use una gradilla de tinción de portaobjetos de microscopio para transferir los portaobjetos de un baño a otro.
3. Tiñir los componentes citoplasmáticos y deshidratar incubando los portaobjetos en eosina Y al 1% durante 45 s, etanol al 50% (Tabla 4) durante 1 min, etanol al 95% durante 1 min y etanol al 100% durante 1 min. Use una gradilla de tinción de portaobjetos de microscopio para transferir los portaobjetos de un baño a otro.
4. Limpie las secciones incubando portaobjetos en xileno durante 1 min. Monte y cubra los portaobjetos aplicando una gota de medio de montaje en el tercio superior del portaobjetos con una pipeta de transferencia y bajando lentamente un cubreobjetos sobre el medio de montaje con pinzas.

9. Imágenes transcriptómicas espaciales y análisis de las secciones

1. Retire las diapositivas de imagen del almacenamiento a -80 °C y obtenga imágenes con una plataforma de imágenes espaciales in situ para el análisis transcriptómico espacial.
   NOTA: Los pasos exactos involucrados en la obtención de imágenes serán determinados por la plataforma de imágenes espaciales.
2. Revise las métricas de control de calidad de la plataforma transcriptómica espacial. Las métricas importantes que se deben comprobar son el número de células detectadas, la mediana de transcripciones por célula, las transcripciones nucleares por 100 μm² y el total de transcripciones decodificadas de alta calidad de cada gen en el conjunto de sondas.
   NOTA: Estas métricas de control de calidad no tienen umbrales universales, y las expectativas para estos umbrales variarán según la muestra y el panel de genes que se utilicen.
3. Lea la salida de datos de las transcripciones de ARN detectables, determine qué transcripciones son de baja calidad en función de las métricas de control de calidad del experimento y filtre las transcripciones de baja calidad. Analice las transcripciones de alta calidad restantes en relación con su disposición espacial dentro de la sección.
4. Vea la segmentación celular de las secciones y agrupe las células en función de los intereses experimentales. Compare las transcripciones de ARN dentro de los grupos de células de la región de interés en grupos de diferentes edades de pez cebra en el mismo portaobjetos.

Resultados

En este método (Figura 1), el pez cebra se utiliza como modelo animal para sondear los patrones de expresión génica resueltos espacialmente. La criosección eficiente de larvas de pez cebra para la obtención de imágenes espaciales es un desafío. Las secciones deben ser de alta calidad para conservar la estructura del tejido y los genes detectables (Figura 4). Las secciones que contienen múltiples muestras para obtener im?...

Discusión

Este informe proporciona soluciones detalladas a muchos de los desafíos técnicos asociados con el pez cebra como organismo modelo en el análisis transcriptómico espacial durante el desarrollo. Al abordar estos desafíos, nuestra disposición compacta de muestras optimiza los costos en las plataformas transcriptómicas espaciales emergentes¹. La criosección de larvas de pez cebra para la obtención de imágenes espaciales es un desafío. Las secciones deben co...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
1 L Beaker	Pyrex	1003
200 proof pure ethanol	Koptec	V1001
Acetic acid, glacial	VWR	0714	acidified alcohol
Aluminum foil
Cover slips	Epredia	24X50-1.5-001G
Disposable base mold	Fisher HealthCare	22-363-556
Distilled water
DPX mountant	Sigma-Aldrich	06522	mountant for histology
Dry ice pellets
Dumont #5SF Forceps	Fine Science Tools	11252-00
Eosin-Y Alcoholic	Epredia	71204	Eosin Y 1%
Gill 1 Hematoxylin	Epredia	72411	Hematoxylin
Kimwipe	Kimberly-Clark Professional	34120	absorbent, lint-free wipe
Lab labelling tape	VWR	89097-934
Microtome blade MX35 Ultra	Epredia	3053835
Microtome Cryostat	Thermo Scientific	Microme HM 525
O.C.T. Compound	Fisher HealthCare	23-730-571	freezing medium
Paraformaldehyde	Sigma-Aldrich	158127	PFA
Permanent Marker	VWR	52877-886
Protractor
SafeClear Xylene Substitute	Fisherbrand	68551-16-6	Xylene substitute
Single Edge Blades	American Line	66-0407
Steriomicroscope	Zeiss	4350639000	Stemi 305 w/ double spot LED (4355259020) and Stand K lab (4354259010)
Superfrost Plus Micro Slides	VWR	48311-703
Transfer pipet
Xenium V1 slide	10X/Xenium	3000941	spatial transcriptomic imaging slide