סידור קומפקטי מרחבית של קטעי דג זברה זחלים לניתוח טרנסקריפטומי מרחבי

Summary

כאן, אנו מציגים שיטה ליישור והקפאה של דגימות זחלי דג זברה מרובות (Danio rerio) ואיסוףן בשקופית אחת לניתוח טרנסקריפטומי מרחבי.

Abstract

טכניקות טרנסקריפטומיות מרחביות הן כלי מתוחכם במחקר ביו-רפואי להמחשת דפוסי ביטוי גנים רשומים מרחבית. הדמיה וניתוח של דגימות מרובות עם פלטפורמות הדמיה מרחבית עלולות להיות יקרות. ביצוע בדיקות אלה בתנאי ניסוי מרובים, כפי שניתן לראות במחקרים התפתחותיים, מגדיל עוד יותר את העלויות. כדי להפחית עלויות, מחקר זה ביקש לייעל את הטכניקות והאסטרטגיות של סידור דגימות טרנסקריפטומיות מרחביות למחקרים התפתחותיים. כאן, המחקר השתמש בדגי זברה, שהם מודל בעל חוליות התפתחותי מבוסס היטב שהוא שקוף במהלך ההתפתחות, יש להם ~70% הומולוגיה גנטית לבני אדם, וגנום מבואר מאוד אידיאלי לניתוח טרנסקריפטומי. בגלל גודלם הקטן, פיתוח דגי הזברה מאפשר גם מיקום קומפקטי של חלקים סדרתיים על פני מספר שכפולים ביולוגיים. כאן, אנו מדווחים על קיבוע אופטימלי, הקפאה ויישור אמין של דגימות דגים מרובות באזור ההדמיה של פלטפורמת הדמיה מרחבית היברידית מולטיפלקס באתר. בשיטה זו, ניתן להקפיא בהצלחה דגי זברה צעירים עד 15 יום לאחר ההפריה (dpf) מלפחות 4 תבניות שונות ועד 174 חלקים, לאסוף אותם באזור ההדמיה של 22 מ"מ 10.5 מ"מ (עבור שקופית טרנסקריפטומית מרחבית באתר ), ולעבד אותם בו זמנית. בהתבסס על איכות החתך, יישור הדגימה וגודל המדגם לכל שקופית, שיטה זו בדגי הזברה מייעלת את התפוקה ואת העלות לדגימה של טכניקות תעתיק מרחביות.

Introduction

הערכת דפוסי ביטוי מובחנים מרחבית ברקמה נותרה קריטית להבנתנו את ההשפעות הגנומיות בהתפתחות, סרטן ומחלות ^1,2,3. טרנסקריפטומיקה מרחבית משלבת טכניקות ביטוי מרובות עם רישום מרחבי של ביטוי ברקמות. "טרנסקריפטומיקה מרחבית" נטבעה לראשונה על ידי Ståhl ועמיתיו⁴, שם נבדקו דגימות סרטן רכובות באמצעות ריצוף הדור הבא באתרו. מאז, "טרנסקריפטומיקה מרחבית" שימשה כתפיסה למחקרי ביטוי בתפוקה גבוהה בשילוב עם רישום מרחבי. אמנם מדובר בכלים רבי עוצמה, אך הם גם התחייבויות יקרות שלעתים קרובות דורשות השקעה מוסדית גדולה ועלויות מעבדה לפני שניתן יהיה לייצר נתונים⁵. אסטרטגיות למזעור עלויות תוך שמירה על נתונים באיכות גבוהה מבוקשות מאוד.

דג הזברה, Danio rerio, הפך למערכת מודל חשובה לחקר ביולוגיה התפתחותית ומציע אמצעי להכפלת ניתוחי איברים שלמים (ואורגניזמים) של בעלי חוליות במרחב מוגבל. דגי הזברה קטנים (4-6 מ"מ כזחלים ו-2-3 ס"מ כבוגרים) ויכולים להטיל מאות ביצים שקופות בכל פעם⁶. עוברי דג הזברה מופרים חיצונית ומתפתחים במהירות, מה שמאפשר לחוקרים להכניס טרנסגנים בשלבי התפתחות מוקדמים כדי לייצר בקלות אללים של רווח ואובדן תפקוד⁷. התאמת מספר דגימות בשקופית אחת היא אסטרטגיה מושכת להפחתת עלויות. פוריותם הגבוהה וגודלם הקטן הופכים את דג הזברה למועמד אידיאלי לריבוי מבחני טרנסקריפטומיה מרחביים שיש להם מקום מוגבל לדגימות⁸.

הקפאה של זחלי דג הזברה היא טכניקה מאתגרת. פלטפורמות טרנסקריפטומיות מרחביות רבות לא עברו אופטימיזציה עבור קטעי פרפין של דג הזברה ודורשות חתכים בהקפאה בעת עבודה עם דג הזברה כאורגניזם מודל לשימור מבנה הרקמה ושמירה על תעתיקי RNA. בנוסף, הגודל הקטן של דג הזברה מקשה על השגת חתכים איכותיים וניתוח דגימות מרובות ביעילות. משימה זו הופכת לקשה יותר כאשר עובדים עם זחלי דג זברה קטנים ושבריריים יותר מעמיתיהם הבוגרים. כדי להתגבר על אתגרים אלה, אנו מתארים שיטה המיישרת באופן אמין מספר דגימות ומנצלת ביעילות את אזור ההדמיה של פלטפורמות הדמיה מרחבית כדי להשיג מקטעים רבים באיכות גבוהה על שקופית אחת שניתן לאחר מכן לצלם ולנתח על ידי פלטפורמות הדמיה מרחבית (איור 1). במקרה זה, שיטה זו מיושמת על פלטפורמת הדמיה טרנסקריפטומית מרחבית.

Protocol

פרוטוקול זה עוקב אחר ההנחיות של הוועדה המוסדית לטיפול ושימוש בבעלי חיים של מכללת דארטמות'.

1. הכנת קריוסטט

1. יש לקרר את הקריוסטט לטמפרטורה של -22 מעלות צלזיוס ולנקות את המשטחים הפנימיים של הקריוסטט על ידי הברשה של פסולת לתוך כלי הקיבול. הנח את כל המברשות והכלים הדרושים בתוך החדר.

2. הכנת תבנית הבסיס החד פעמית

1. הכן תבנית בסיס (תבנית פלסטיק חד פעמית 37 מ"מ 24 מ"מ 5 מ"מ) ליישור דגימה על ידי ציור קו ישר על פני החלק הפנימי של תבנית בסיס עם טוש קבוע לשימוש כנקודת ייחוס ליישור הדגימה. הניחו פיסת סרט מעבדה בחלק הפנימי של תבנית הבסיס היכן שהקו הישר צריך להיות לפני שרטוט קו לקבלת התוצאות הטובות ביותר (איור 2A).
2. צייר נקודה בחלק הפנימי של תבנית הבסיס ליד הקיר השמאלי או הימני כדי להבטיח כיוון דגימה נכון במהלך הקפאה (איור 2B).
3. מדוד את זווית החיתוך הרצויה בעזרת מד זווית וסמן זאת בחלק הפנימי של תבנית הבסיס עבור כל דגימה (איור 2C).
4. מרחו שכבה רדודה של מדיום הקפאה (טומוגרפיה קוהרנטית אופטית [OCT]) על תבנית הבסיס המוכנה. ודא שיש מספיק אמצעי הקפאה כדי לכסות את הדגימות.
   1. הימנע מבועות אוויר בעת מריחת מדיום ההקפאה על ידי תחול הזרבובית של בקבוק המדיום והוספת הכמות הדרושה של מדיום לפינה אחת של תבנית הבסיס לפני הזזת המישור האופקי של תבנית הבסיס כך שהמדיום יתפזר באופן שווה על פני כל המשטח.
   2. סחטו את הבקבוק לאט בעת חלוקת אמצעי ההקפאה.
5. מוסיפים קרח לכוס של 1 ליטר, מניחים את תבנית הבסיס עם מדיום מקפיא באמבט הקרח, ומדגרים לפחות 10 דקות כדי לקרר את המדיום.

3. הכנת קרח יבש: אמבט 100% אתנול

1. הכינו אמבט קרח יבש ואתנול 100% במכסה אדים על ידי הוספת חלק אחד של 100% אתנול לחלק אחד של קרח יבש בדלי קרח.
2. השתמש בכלי אלומיניום חד פעמי או קפל נייר אלומיניום לסירה גדולה מספיק כדי להתאים לתבנית בסיס חד פעמית. ודא שהצלחת או הסירה גדולות מספיק כדי שתבנית הבסיס תשכב שטוחה לחלוטין.
3. מניחים את המנה או הסירה באמבטיה ומכסים את הדלי. אפשר 5-10 דקות עד שהדלי יתקרר לפני הקפאת הדגימות.

4. המתת חסד של דגימות

1. בחר באופן אקראי דג זברה לחתך. אם הדגימות משתנות בגודלן, הפרד אותן לקבוצות לפי גודל יחסי כדי להקל על היישור המדויק (ראה דיון לפרטים). מניחים דגים גדולים יותר ודגים קטנים יותר בכלים נפרדים.
2. ממלאים במי מערכת דגים ומניחים את הכוס בדלי קרח. הקיפו את הכוס בקרח.
3. עקוב אחר טמפרטורת המים בעזרת מדחום. תנו לטמפרטורה להתייצב בין 2-4 מעלות צלזיוס.
4. השתמש ברשת או במסננת כדי להכניס קבוצת דגים אחת למים של 4 מעלות צלזיוס. דגים צריכים להיות שקועים לחלוטין במים ולא במגע עם קרח. לאחר הפסקת התנועה האופרקולרית, הוסיפו קרח למים כדי להבטיח שהם יישארו מתחת ל-4 מעלות צלזיוס. השאירו את הדגים במים בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות.
   הערה: המשך עם ההטמעה, היישור והקפאת הבזק של כל קבוצה של דגימות מורדמות לפני המתת חסד של הקבוצה הבאה. החלף את המים בכל פעם.

5. הטבעה ויישור

1. אוספים את הדגים המומתים לאחר שהושקעו במים של 4 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות. הוציאו את הדגים מהמים בעזרת מלקחיים עדינים על ידי אחיזתם בסנפיר הזנב וייבשו אותם על ידי לחיצה עדינה על מגבון סופג ונטול מוך.
   הערה: עבור קטעים באיכות גבוהה, חשוב להגביל את הזמן בין הוצאת דגים מהמים בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס לבין הקפאת הבזק
2. בעבודה עם תבנית הבסיס המוכנה באמבט קרח תחת סטריאומיקרוסקופ (הגדלה פי 10), הנח כל דגימה בתבנית הבסיס לאורך נקודות הייחוס בכיוון הנכון וכסה בעדינות את הדגימות בשכבה דקה נוספת של מדיום הקפאה.
   הערה: אין למלא את כל התבנית במדיום הקפאה. במקום זאת, השתמש רק בשכבה דקה, מספיק כדי לכסות את כל הדגימות.
3. השתמש בנקודת ייחוס אנטומית כדי ליישר במדויק את הדג לקווים המסומנים בחלק הפנימי של תבנית הבסיס. השתמש במלקחיים עדינים כדי להתאים את הכיוון של כל דג כך שיהיו מיושרים ובאותו כיוון. הימנע מיצירת בועות במדיום ההקפאה על ידי תנועה איטית.
4. מרחו חתיכת קרח יבש על תחתית תבנית הבסיס מתחת לדגימות עד שהן קפואות מקומית למקומן. שמור על המישור האופקי של תבנית הבסיס בגובה כדי למנוע הזזת הדגימות מנקודות הייחוס שלהן לפני הקפאה למקומן עם קרח יבש.
5. מניחים את תבנית הבסיס עם הדגימות על סירת האלומיניום או צלחת האלומיניום בקרח היבש: אמבט אתנול 100%. ודא שהסירה צפה על פני האמבטיה ותבנית הבסיס נשארת יבשה. מכסים את האמבטיה ומאפשרים לדגימות לצוף למשך 10 דקות.
6. עוטפים את תבנית הבסיס הקפואה בנייר כסף ושומרים במקפיא של -80 מעלות צלזיוס עד שמוכן לחתך. חזור על שלבים 4.2-5.6 עבור כל הקבוצות הנותרות.

6. הקפאה

1. הביאו תבניות בסיס קפואות לקריוסטט שהתקרר מראש לצורך הקפאה והניחו אותן בתא הקריוסטט. הובלת בלוקים קפואים בקופסה עם קרח יבש למניעת הפשרה.
2. הסר שקופית הדמיה מרחבית באתרה מהאחסון והנח אותה במחזיק שקופיות מקורר מראש. אחסן את מחזיק השקופיות עם שקופית הדמיה מרחבית בתא הקריוסטט של -22 מעלות צלזיוס עד שמוכן לאסוף חלקים מאזור העניין.
3. מוציאים את הדגימות הקפואות מתבנית הבסיס ולאחר מכן מקפיאים אותן בצ'אק עם מדיום הקפאה טרי. הקפיאו אותם על הצ'אק כך שמשטח החיתוך יפנה ללהב.
4. הניחו להב מיקרוטום טרי ועדין בקריוסטט.
5. יישר את התבנית ללהב וחתוך את אזור העניין (עובי גימור מומלץ 20-50 מיקרומטר). ודא שהסימונים שנעשו בתוך התבנית מועברים לבלוק הדגימה הקפוא כדי לסייע בזיהוי המיקום בתוך הדגימות.
6. כוונן את התבנית בשלב החיתוך כך שמשטח החיתוך יהיה מקביל לסימוני הייחוס במדיום ההקפאה.
7. אסוף קטעים על שקופית מיקרוסקופ רגילה טעונה חיובית ובדוק אותם לפי שדה בהיר כדי לוודא מתי אין עוד צורך בחיתוך.
8. הסר את שקופית ההדמיה המרחבית מתא הקריוסטט והנח אותה באמבט קרח של 4 מעלות צלזיוס. שמור את השקופית במחזיק השקופיות. ודא שהמגלשה לא נרטבת.
9. התחל בהקפאה (מומלץ 10-14 מיקרומטר; איור 3) ולאסוף קטעים על שקופיות טעונות חיובית עד שמגיעים לאזור העניין בדגימות. בדוק קטעים לפי שדה בהיר כדי לאשר שאזור העניין יהיה החלק הבא מהתבנית.
10. החזר את שקופית ההדמיה המרחבית של תא יחיד לתא הקריוסטט. הסר את השקופית ממחזיק השקופית ואסוף מקטעים מאזור העניין המדויק אל השקופית של ההדמיה המרחבית שורה אחר שורה באמצעות מברשת צבע עדינה כדי למנוע גלגול של מקטעים.
    1. לחץ על פינה של המדיום הריק והקפוא לתוך שלב הסכין עם הצד האחורי של המברשת כך שהחלק יישאר שטוח בעת תפיסת השקופית לאיסוף.
    2. השתמש בחלק העליון של המגלשה כנקודת ציר, הורד לאט את השקופית על הקטע, ואפשר לחלקים להיצמד למגלשה למשך 3 שניות לפני הרמת המגלשה מהסכין tage.
    3. עבדו משמאל לימין בעת איסוף מקטעים באזור ההדמיה של השקופית וחפפו שכבות של מדיום ריק ומקפיא במידת האפשר.
    4. השתמש בגבולות נייר צבעוניים כהתייחסות למיקום מקטעים בתוך אזור ההדמיה של השקופית אם קשה לראות רקמה.
11. לאחר איסוף קטעים מאזור העניין, הנח את השקופית בחזרה למחזיק השקופיות. אם אין עוד דגימות לאיסוף על שקופית ההדמיה המרחבית, אחסן את השקופית בטמפרטורה של -80 מעלות צלזיוס עד שבועיים עד שהיא מוכנה לניתוח מכשירים עם פלטפורמת ההדמיה המרחבית באתרה . אם יש צורך לאסוף חלקים ממספר תבניות, החזר את שקופית ההדמיה המרחבית לאמבטיית הקרח של 4 מעלות צלזיוס וחזור על שלבים 6.3-6.11 עם התבנית הבאה.
12. אסוף קטעים לפני ואחרי קטעי אזור העניין מכל תבנית בשקופית מיקרוסקופ סטנדרטית טעונה חיובית לצביעה של המטוקסילין ואאוזין (HE) כדי לבדוק שיישור הדגימה ואיכות החתך מספיקים לפני שתמשיך בניתוח.

7. תיקון המדגם

1. הסר את שקופיות הייחוס מהקריוסטט וייבש באוויר ב-RT למשך 30 דקות כדי להדביק חלקים למגלשה.
2. תקן מקטעים על-ידי הנחתם במכל שקופיות עם 4% פרפורמלדהיד (טבלה 1) למשך 20 דקות.
3. שטפו חלקים על ידי הנחתם במיכל שקופיות עם מים מזוקקים למשך 3 דקות.
4. המשך עם צביעת HE או יבש ואחסן שקופיות ב-80 מעלות צלזיוס לצביעה עתידית.

8. הכתמת הקטעים

1. ייבשו ונקו את החלקים על ידי דגירה של המגלשות ב-100% אתנול למשך 2 דקות, 95% (טבלה 2) אתנול למשך 2 דקות, ולאחר מכן מי ברז למשך דקה. השתמש במתלה לצביעה שקופיות במיקרוסקופ כדי להעביר שקופיות מאמבטיה לאמבטיה.
2. צבעו את הגרעינים והתמיינו על ידי דגירה של המגלשות בהמטוקסילין למשך 2 דקות ו-45 שניות, מי ברז למשך דקה, 0.3% אלכוהול מחומצן (טבלה 3) למשך דקה אחת, ולאחר מכן מי ברז זורמים למשך דקה אחת. השתמש במתלה לצביעה שקופיות במיקרוסקופ כדי להעביר שקופיות מאמבטיה לאמבטיה.
3. לצבוע את הרכיבים הציטופלזמיים ולייבש על ידי דגירה של השקופיות באאוזין Y 1% למשך 45 שניות, 50% אתנול (טבלה 4) למשך דקה אחת, 95% אתנול למשך דקה אחת ו-100% אתנול למשך דקה אחת. השתמש במתלה לצביעה שקופיות במיקרוסקופ כדי להעביר שקופיות מאמבטיה לאמבטיה.
4. נקה את החלקים על ידי דגירה של שקופיות בקסילן למשך דקה. הרכיבו וכסו את המגלשות על ידי מריחת טיפה של אמצעי הרכבה על השליש העליון של השקופית בעזרת צינור העברה והורדה איטית של כיסוי על גבי אמצעי ההרכבה בעזרת מלקחיים.

9. הדמיה טרנסקריפטומית מרחבית וניתוח חתכים

1. הסר את שקופיות ההדמיה מאחסון ותמונה של -80 מעלות צלזיוס עם פלטפורמת הדמיה מרחבית באתרה לניתוח טרנסקריפטומי מרחבי.
   הערה: השלבים המדויקים הכרוכים בהדמיה ייקבעו על ידי פלטפורמת ההדמיה המרחבית.
2. סקור את מדדי בקרת האיכות של פלטפורמת התעתיק המרחבית. מדדים חשובים שיש לבדוק הם מספר התאים שזוהו, תעתיקים חציוניים לתא, תעתיקים גרעיניים לכל 100 מיקרומטר², וסך כל התעתיקים המפוענחים באיכות גבוהה של כל גן בערכת הבדיקה.
   הערה: למדדי בקרת איכות אלה אין ספים אוניברסליים, והציפיות לספים אלה ישתנו בהתאם לדגימה ולפאנל הגנים שבהם נעשה שימוש.
3. קרא את פלט הנתונים של תמלילי RNA הניתנים לזיהוי, קבע אילו תמלילים באיכות נמוכה על סמך מדדי בקרת האיכות של הניסוי, וסנן תמלילים באיכות נמוכה. נתח את התמלילים האיכותיים הנותרים ביחס לסידורם המרחבי בתוך הקטע.
4. הצג את הפילוח הסלולרי של החתכים ותאי האשכול על סמך תחומי עניין ניסיוניים. השווה את תעתיקי ה-RNA בתוך אשכולות תאים של אזור העניין על פני קבוצות בגילאים שונים של דג זברה באותה שקופית.

תוצאות

בשיטה זו (איור 1), דג הזברה משמש כמודל של חיות כדי לחקור דפוסי ביטוי גנים שנפתרו מרחבית. חיתוך הקפאה של דג זברה זחל ביעילות להדמיה מרחבית הוא מאתגר. המקטעים חייבים להיות באיכות גבוהה כדי לשמור על מבנה הרקמה והגנים הניתנים לזיהוי (איור 4). קטע?...

Discussion

דוח זה מספק פתרונות מפורטים לרבים מהאתגרים הטכניים הקשורים לדגי הזברה כאורגניזם מודל בניתוח טרנסקריפטומי מרחבי במהלך ההתפתחות. בהתמודדות עם אתגרים אלה, סידור הדגימות הקומפקטי שלנו מייעל את העלויות בפלטפורמות התעתיק המרחביות המתפתחות¹. הקפאה של דג זברה זח?...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
1 L Beaker	Pyrex	1003
200 proof pure ethanol	Koptec	V1001
Acetic acid, glacial	VWR	0714	acidified alcohol
Aluminum foil
Cover slips	Epredia	24X50-1.5-001G
Disposable base mold	Fisher HealthCare	22-363-556
Distilled water
DPX mountant	Sigma-Aldrich	06522	mountant for histology
Dry ice pellets
Dumont #5SF Forceps	Fine Science Tools	11252-00
Eosin-Y Alcoholic	Epredia	71204	Eosin Y 1%
Gill 1 Hematoxylin	Epredia	72411	Hematoxylin
Kimwipe	Kimberly-Clark Professional	34120	absorbent, lint-free wipe
Lab labelling tape	VWR	89097-934
Microtome blade MX35 Ultra	Epredia	3053835
Microtome Cryostat	Thermo Scientific	Microme HM 525
O.C.T. Compound	Fisher HealthCare	23-730-571	freezing medium
Paraformaldehyde	Sigma-Aldrich	158127	PFA
Permanent Marker	VWR	52877-886
Protractor
SafeClear Xylene Substitute	Fisherbrand	68551-16-6	Xylene substitute
Single Edge Blades	American Line	66-0407
Steriomicroscope	Zeiss	4350639000	Stemi 305 w/ double spot LED (4355259020) and Stand K lab (4354259010)
Superfrost Plus Micro Slides	VWR	48311-703
Transfer pipet
Xenium V1 slide	10X/Xenium	3000941	spatial transcriptomic imaging slide