Arranjo Espacialmente Compacto de Seções de Larvas de Peixe-Zebra para Análise Transcriptômica Espacial

Resumo

Aqui, apresentamos um método para alinhar e criosseccionar várias amostras de larvas de peixe-zebra (Danio rerio) e coletá-las em uma única lâmina para análise transcriptômica espacial.

Resumo

As técnicas transcriptômicas espaciais são uma ferramenta sofisticada na pesquisa biomédica para visualizar padrões de expressão gênica registrados espacialmente. A imagem e a análise de várias amostras com plataformas de imagem espacial podem ser caras. A realização desses testes em várias condições experimentais, como visto em estudos de desenvolvimento, aumenta ainda mais os custos. Para reduzir custos, este estudo buscou otimizar as técnicas e estratégias de arranjo de espécimes transcriptômicos espaciais para estudos de desenvolvimento. Aqui, o estudo utilizou o peixe-zebra, que é um modelo de vertebrado de desenvolvimento bem estabelecido que é transparente durante o desenvolvimento, tem ~ 70% de homologia genética com os humanos e um genoma altamente anotado ideal para análise transcriptômica. Devido ao seu pequeno tamanho, o desenvolvimento do peixe-zebra também permite a colocação compacta de seções seriadas em várias réplicas biológicas. Aqui, relatamos fixação otimizada, criosseccionamento e alinhamento confiável de várias amostras de peixes dentro da área de imagem de uma plataforma de imagem espacial de hibridização in situ multiplex. Com este método, o peixe-zebra tão jovem quanto 15 dias após a fertilização (dpf) de pelo menos 4 moldes diferentes e até 174 seções pode ser criosseccionado com sucesso, coletado dentro da área de imagem de 22 mm 10,5 mm (para uma lâmina transcriptômica espacial in situ ) e processado simultaneamente. Com base na qualidade da seção, alinhamento da amostra e tamanho da amostra por lâmina, este método no peixe-zebra otimiza a produção e o custo por amostra das técnicas transcriptômicas espaciais.

Introdução

A avaliação de padrões de expressão espacialmente distintos no tecido continua sendo crítica para nossa compreensão das influências genômicas no desenvolvimento, câncer e doença ^1,2,3. A transcriptômica espacial combina técnicas de expressão multiplexada com o registro espacial da expressão nos tecidos. "Transcriptômica espacial" foi cunhada pela primeira vez por Ståhl e colegas⁴, onde amostras de câncer montadas foram sondadas usando sequenciamento de próxima geração in situ. Desde então, a "transcriptômica espacial" tem sido usada como um termo genérico para estudos de expressão de alto rendimento combinados com registro espacial. Embora sejam ferramentas poderosas, também são empreendimentos caros que muitas vezes exigem grandes investimentos institucionais e custos laboratoriais antes que os dados possam ser gerados⁵. Estratégias para minimizar custos e preservar dados de alta qualidade estão em alta demanda.

O peixe-zebra, Danio rerio, tornou-se um importante sistema modelo para estudar a biologia do desenvolvimento e oferece um meio de multiplicar análises de órgãos inteiros (e organismos) de vertebrados em espaço limitado. O peixe-zebra é pequeno (4-6 mm como larvas e 2-3 cm como adulto) e pode colocar centenas de ovos transparentes de cada vez⁶. Os embriões de peixe-zebra são fertilizados externamente e se desenvolvem rapidamente, permitindo que os pesquisadores introduzam transgenes nos estágios iniciais de desenvolvimento para gerar prontamente alelos de ganho e perda de função⁷. Encaixar várias amostras em uma única lâmina é uma estratégia atraente para reduzir custos. Sua alta fecundidade e tamanho pequeno tornam o peixe-zebra um candidato ideal para ensaios transcriptômicos espaciais de multiplexação que têm espaço restrito para espécimes⁸.

A criossecção de larvas de peixe-zebra é uma técnica desafiadora. Muitas plataformas transcriptômicas espaciais não foram otimizadas para seções de parafina de peixe-zebra e requerem criossecções ao trabalhar com peixe-zebra como organismo modelo para preservar a estrutura do tecido e reter transcritos de RNA. Além disso, o pequeno tamanho do peixe-zebra dificulta a obtenção de criossecções de qualidade e a análise eficaz de várias amostras. Essa tarefa se torna mais difícil quando se trabalha com larvas de peixe-zebra menores e mais frágeis do que suas contrapartes adultas. Para superar esses desafios, descrevemos um método que alinha de forma confiável várias amostras e utiliza a área de imagem das plataformas de imagem espacial de forma eficiente para obter muitas seções de alta qualidade em uma única lâmina que pode ser visualizada e analisada por plataformas de imagem espacial (Figura 1). Neste caso, este método é aplicado a uma plataforma de imagem transcriptômica espacial.

Protocolo

Este protocolo segue as diretrizes do comitê institucional de cuidados e uso de animais do Dartmouth College.

1. Preparando o criostato

1. Resfrie o criostato a -22 °C e limpe as superfícies internas do criostato escovando os detritos no recipiente. Coloque todas as escovas e ferramentas necessárias dentro da câmara.

2. Preparando o molde de base descartável

1. Prepare um molde de base (molde de plástico descartável de 37 mm, 24 mm, 5 mm) para alinhamento da amostra, desenhando uma linha reta no interior de um molde de base com um marcador permanente para usar como ponto de referência para o alinhamento da amostra. Coloque um pedaço de fita adesiva no interior do molde de base, onde a linha reta deve estar, antes de desenhar uma linha para obter melhores resultados (Figura 2A).
2. Desenhe um ponto no interior do molde de base próximo à parede esquerda ou direita para garantir a orientação adequada da amostra durante a criossecção (Figura 2B).
3. Meça o ângulo de corte desejado com um transferidor e marque-o no interior do molde de base para cada amostra (Figura 2C).
4. Aplique uma camada rasa de meio de congelamento (tomografia de coerência óptica [OCT]) no molde de base preparado. Certifique-se de que haja meio de congelamento suficiente para cobrir as amostras.
   1. Evite bolhas de ar ao aplicar o meio de congelamento aplicando o bico da garrafa de meio e adicionando a quantidade necessária de meio a um canto do molde de base antes de deslocar o plano horizontal do molde de base para que o meio seja distribuído uniformemente por toda a superfície.
   2. Aperte o frasco lentamente ao dispensar o meio de congelamento.
5. Adicione gelo a um copo de 1 L, coloque o molde de base com meio de congelamento no banho de gelo e incube por pelo menos 10 min para resfriar o meio.

3. Preparação de gelo seco: banho de etanol 100%

1. Prepare um banho de gelo seco e etanol 100% em uma capela adicionando uma parte de etanol 100% a uma parte de gelo seco em um balde de gelo.
2. Use um prato de alumínio descartável ou dobre papel alumínio em um barco grande o suficiente para caber em um molde de base descartável. Certifique-se de que o prato ou barco seja grande o suficiente para que o molde de base fique completamente plano.
3. Coloque o prato ou barco na banheira e tampe o balde. Aguarde de 5 a 10 minutos para que o balde esfrie antes de congelar as amostras.

4. Eutanásia de amostras

1. Selecione aleatoriamente o peixe-zebra para seccionamento. Se as amostras variarem em tamanho, separe-as em grupos por tamanho relativo para facilitar o alinhamento preciso (consulte a discussão para obter detalhes). Coloque os peixes maiores e os peixes menores em pratos separados.
2. Encha um copo com água do sistema de peixes e coloque o copo em um balde de gelo. Envolver o copo com gelo.
3. Monitore a temperatura da água com um termômetro. Deixe a temperatura estabilizar entre 2-4 °C.
4. Use uma rede ou filtro para colocar um grupo de peixes na água a 4 °C. Os peixes devem estar totalmente imersos na água e não em contato com o gelo. Uma vez cessado o movimento opercular, adicione gelo à água para garantir que ela permaneça abaixo de 4 °C. Deixe o peixe em água a 4 °C por 10 min.
   NOTA: Continue com a incorporação, alinhamento e congelamento instantâneo de cada grupo de amostras sacrificadas antes de sacrificar o próximo grupo. Substitua a água a cada vez.

5. Incorporação e alinhamento

1. Recolher os peixes sacrificados depois de submersos em água a 4 °C durante 10 min. Retire os peixes da água com pinças de ponta fina, agarrando-os pela barbatana caudal e seque-os pressionando-os suavemente contra um lenço absorvente e sem fiapos.
   NOTA: Para seções de alta qualidade, é fundamental limitar o tempo entre a remoção de peixes da água a 4 ° C e o congelamento rápido
2. Trabalhando com o molde de base preparado em um banho de gelo sob um estereomicroscópio (ampliação de 10x), coloque cada amostra no molde de base ao longo dos pontos de referência na orientação correta e cubra suavemente as amostras com outra fina camada de meio de congelamento.
   NOTA: Não encha todo o molde com meio de congelamento. Em vez disso, use apenas uma camada fina, apenas o suficiente para cobrir todas as amostras.
3. Use um ponto de referência anatômico para alinhar com precisão o peixe às linhas marcadas no interior do molde de base. Use pinças de ponta fina para ajustar a orientação de cada peixe para que fiquem alinhados e na mesma orientação. Evite criar bolhas no meio de congelamento movendo-se lentamente.
4. Aplique um pedaço de gelo seco na parte inferior do molde de base sob as amostras até que estejam congeladas localmente na posição. Mantenha o plano horizontal do nível do molde de base para evitar deslocar as amostras de seus pontos de referência antes de congelar na posição com gelo seco.
5. Coloque o molde de base com as amostras no barco ou prato de alumínio no gelo seco: banho de etanol 100%. Certifique-se de que o barco esteja flutuando na superfície do banho e que o molde de base permaneça seco. Cubra o banho e deixe as amostras flutuarem por 10 min.
6. Embrulhe o molde de base congelado em papel alumínio e guarde no freezer a -80 ° C até que esteja pronto para cortar. Repita as etapas 4.2 a 5.6 para todos os grupos restantes.

6. Crioseccionamento

1. Traga os moldes de base congelados para o criostato pré-resfriado para criosseccionamento e coloque-os na câmara do criostato. Transporte blocos congelados em uma caixa com gelo seco para evitar o descongelamento.
2. Remova a lâmina de imagem espacial in situ do armazenamento e coloque-a em um suporte de lâmina pré-resfriado. Armazenar o suporte de lâminas com lâmina de imagem espacial na câmara de criostato a -22 °C até estar pronto para coletar seções da região de interesse.
3. Remova as amostras congeladas do molde de base e congele-as em um mandril com um meio de congelamento fresco. Congele-os no mandril para que a superfície de corte fique voltada para a lâmina.
4. Coloque uma lâmina de micrótomo fresca e fina no criostato.
5. Alinhe o molde com a lâmina e apare a região de interesse (espessura de corte recomendada de 20-50 μm). Certifique-se de que as marcações feitas dentro do molde sejam transferidas para o bloco de amostra congelado para ajudar a identificar a localização dentro das amostras.
6. Ajuste o molde durante a fase de corte para que a superfície de corte fique paralela às marcações de referência no meio de congelamento.
7. Colete seções em uma lâmina de microscópio carregada positivamente padrão e verifique-as por campo claro para confirmar quando o corte não é mais necessário.
8. Retirar a lâmina de imagem espacial da câmara do criostato e colocá-la num banho de gelo a 4 °C. Mantenha a corrediça no suporte da corrediça. Certifique-se de que o slide não fique molhado.
9. Iniciar a criossecção (recomendado 10-14 μm; Figura 3) e coletar seções em lâminas carregadas positivamente até que a região de interesse nas amostras seja alcançada. Verifique as seções por campo claro para confirmar se a região de interesse será a próxima seção do molde.
10. Traga a lâmina de imagem espacial de célula única de volta para a câmara do criostato. Remova o slide do suporte do slide e colete seções da área exata de interesse no slide de imagem espacial linha por linha usando um pincel de ponta fina para evitar que as seções se enrolem.
    1. Pressione um canto do meio vazio e congelante no estágio da faca com a parte de trás do pincel para que a seção permaneça plana ao pegar a lâmina para coleta.
    2. Use a parte superior da corrediça como ponto de articulação, abaixe lentamente a corrediça na seção e deixe as seções aderirem à corrediça por 3 s antes de levantar a corrediça do lâmina.
    3. Trabalhe da esquerda para a direita ao coletar seções na área de imagem da lâmina e sobreponha camadas de meio vazio e congelante quando possível.
    4. Use bordas de papel colorido como referência para colocar seções dentro da área de imagem da lâmina se o tecido for difícil de ver.
11. Depois de coletar as seções da região de interesse, coloque a lâmina de volta no suporte da lâmina. Se não houver mais amostras a serem coletadas na lâmina de imagem espacial, armazene a lâmina a -80 °C por até 2 semanas até que esteja pronta para análise do instrumento com a plataforma de imagem espacial in situ . Se as seções precisarem ser coletadas de vários moldes, coloque a lâmina de imagem espacial de volta no banho de gelo a 4 ° C e repita as etapas 6.3-6.11 com o próximo molde.
12. Colete seções antes e depois das seções da região de interesse de cada molde em uma lâmina de microscópio carregada positivamente padrão para coloração de hematoxilina e eosina (HE) para verificar se o alinhamento da amostra e a qualidade da seção são suficientes antes de prosseguir com a análise.

7. Corrigindo a amostra

1. Remova as lâminas de referência do criostato e seque ao ar em RT por 30 min para aderir às seções da lâmina.
2. Fixe as seções colocando-as em um recipiente de lâminas com paraformaldeído a 4% (Tabela 1) por 20 min.
3. Lave as seções colocando-as em um recipiente deslizante com água destilada por 3 min.
4. Continue com a coloração HE ou seque e guarde as lâminas a -80 °C para coloração futura.

8. Coloração HE das seções

1. Desidrate e limpe as seções incubando as lâminas em etanol 100% por 2 min, etanol 95% (Tabela 2) por 2 min e, em seguida, água da torneira por 1 min. Use um suporte de coloração de lâminas de microscópio para transferir lâminas de um banho para outro.
2. Pinte os núcleos e diferencie-se incubando as lâminas em Hematoxilina por 2 min 45 s, água da torneira por 1 min, álcool acidificado a 0,3% (Tabela 3) por 1 min e, em seguida, água corrente da torneira por 1 min. Use um suporte de coloração de lâminas de microscópio para transferir lâminas de um banho para outro.
3. Manchar os componentes citoplasmáticos e desidratar incubando as lâminas em Eosina Y 1% por 45 s, etanol a 50% (Tabela 4) por 1 min, etanol a 95% por 1 min e etanol a 100% por 1 min. Use um suporte de coloração de lâminas de microscópio para transferir lâminas de um banho para outro.
4. Limpe as seções incubando lâminas em xileno por 1 min. Monte e cubra as lâminas aplicando uma gota do meio de montagem no terço superior da lâmina com uma pipeta de transferência e abaixando lentamente uma lamínula no topo do meio de montagem com uma pinça.

9. Imagem transcriptômica espacial e análise das seções

1. Remova as lâminas de imagem do armazenamento a -80 °C e crie imagens com uma plataforma de imagem espacial in situ para análise transcriptômica espacial.
   NOTA: As etapas exatas envolvidas na imagem serão determinadas pela plataforma de imagem espacial.
2. Revise as métricas de controle de qualidade da plataforma transcriptômica espacial. Métricas importantes a serem verificadas são o número de células detectadas, transcritos médios por célula, transcritos nucleares por 100 μm² e transcritos decodificados totais de alta qualidade de cada gene no conjunto de sondas.
   NOTA: Essas métricas de controle de qualidade não têm limites universais e as expectativas para esses limites variam dependendo da amostra e do painel de genes que está sendo usado.
3. Leia a saída de dados de transcritos de RNA detectáveis, determine quais transcritos são de baixa qualidade com base nas métricas de controle de qualidade do experimento e filtre transcritos de baixa qualidade. Analise as transcrições de alta qualidade restantes em relação ao seu arranjo espacial dentro da seção.
4. Visualize a segmentação celular das seções e células de cluster com base em interesses experimentais. Compare os transcritos de RNA dentro de aglomerados de células da região de interesse em grupos de diferentes idades de peixe-zebra na mesma lâmina.

Resultados

Neste método (Figura 1), o peixe-zebra é usado como modelo animal para sondar padrões de expressão gênica espacialmente resolvidos. A criossecção eficiente de larvas de peixe-zebra para imagens espaciais é um desafio. As seções devem ser de alta qualidade para reter a estrutura do tecido e os genes detectáveis (Figura 4). As seções contendo várias amostras para imagens espacialmente eficientes devem ser alinhadas c...

Discussão

Este relatório fornece soluções detalhadas para muitos dos desafios técnicos associados ao peixe-zebra como organismo modelo na análise transcriptômica espacial durante o desenvolvimento. Ao enfrentar esses desafios, nosso arranjo compacto de espécimes otimiza os custos nas plataformas transcriptômicas espaciais emergentes¹. A criossecção de larvas de peixe-zebra para imagens espaciais é um desafio. As seções devem reter estrutura de tecido e qualidad...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
1 L Beaker	Pyrex	1003
200 proof pure ethanol	Koptec	V1001
Acetic acid, glacial	VWR	0714	acidified alcohol
Aluminum foil
Cover slips	Epredia	24X50-1.5-001G
Disposable base mold	Fisher HealthCare	22-363-556
Distilled water
DPX mountant	Sigma-Aldrich	06522	mountant for histology
Dry ice pellets
Dumont #5SF Forceps	Fine Science Tools	11252-00
Eosin-Y Alcoholic	Epredia	71204	Eosin Y 1%
Gill 1 Hematoxylin	Epredia	72411	Hematoxylin
Kimwipe	Kimberly-Clark Professional	34120	absorbent, lint-free wipe
Lab labelling tape	VWR	89097-934
Microtome blade MX35 Ultra	Epredia	3053835
Microtome Cryostat	Thermo Scientific	Microme HM 525
O.C.T. Compound	Fisher HealthCare	23-730-571	freezing medium
Paraformaldehyde	Sigma-Aldrich	158127	PFA
Permanent Marker	VWR	52877-886
Protractor
SafeClear Xylene Substitute	Fisherbrand	68551-16-6	Xylene substitute
Single Edge Blades	American Line	66-0407
Steriomicroscope	Zeiss	4350639000	Stemi 305 w/ double spot LED (4355259020) and Stand K lab (4354259010)
Superfrost Plus Micro Slides	VWR	48311-703
Transfer pipet
Xenium V1 slide	10X/Xenium	3000941	spatial transcriptomic imaging slide