Räumlich kompakte Anordnung von Zebrafischlarvenschnitten für die räumliche Transkriptomanalyse

Zusammenfassung

Hier stellen wir eine Methode vor, mit der mehrere Zebrafisch-Larvenproben (Danio rerio) ausgerichtet und kryosektioniert und auf einem einzigen Objektträger für die räumliche transkriptomische Analyse gesammelt werden können.

Zusammenfassung

Räumliche Transkriptomtechniken sind ein ausgeklügeltes Werkzeug in der biomedizinischen Forschung, um räumlich registrierte Genexpressionsmuster sichtbar zu machen. Die Bildgebung und Analyse mehrerer Proben mit räumlichen Bildgebungsplattformen kann kostspielig sein. Die Durchführung dieser Tests unter mehreren experimentellen Bedingungen, wie sie in Entwicklungsstudien zu sehen sind, erhöht die Kosten weiter. Um die Kosten zu senken, wurde in dieser Studie versucht, die Techniken und Strategien der räumlichen transkriptomischen Probenanordnung für Entwicklungsstudien zu optimieren. Hier wurden in der Studie Zebrafische verwendet, die ein gut etabliertes Entwicklungswirbeltiermodell sind, das während der Entwicklung transparent ist, ~70% genetische Homologie zum Menschen aufweist und ein hochgradig annotiertes Genom hat, das sich ideal für die transkriptomische Analyse eignet. Aufgrund ihrer geringen Größe ermöglicht der sich entwickelnde Zebrafisch auch eine kompakte Platzierung von Serienabschnitten über mehrere biologische Replikate. Darin berichten wir über eine optimierte Fixierung, Kryosektion und zuverlässige Ausrichtung mehrerer Fischproben innerhalb des Bildgebungsbereichs einer räumlichen Multiplex-in-situ-Hybridisierungs-Bildgebungsplattform. Mit dieser Methode können Zebrafische bereits 15 Tage nach der Befruchtung (dpf) von mindestens 4 verschiedenen Schimmelpilzen und bis zu 174 Schnitten erfolgreich kryoschnittiert, innerhalb des Bildgebungsbereichs von 22 mm 10,5 mm (für einen räumlichen Transkriptom-Objektträger in situ ) entnommen und gleichzeitig verarbeitet werden. Basierend auf der Schnittqualität, der Probenausrichtung und der Probengröße pro Objektträger optimiert diese Methode beim Zebrafisch die Leistung und die Kosten pro Probe für räumliche Transkriptomtechniken.

Einleitung

Die Bewertung räumlich unterschiedlicher Expressionsmuster im Gewebe ist nach wie vor entscheidend für unser Verständnis genomischer Einflüsse auf Entwicklung, Krebs und Krankheit ^1,2,3. Die räumliche Transkriptomik kombiniert gemultiplexte Expressionstechniken mit der räumlichen Registrierung der Expression in Geweben. "Räumliche Transkriptomik" wurde zuerst von Ståhl und Kollegen^{geprägt 4}, bei denen montierte Krebsproben mit Hilfe von in situ Next-Generation-Sequencing untersucht wurden. Seitdem wird die "räumliche Transkriptomik" als Sammelbegriff für Hochdurchsatz-Expressionsstudien in Kombination mit räumlicher Registrierung verwendet. Dies sind zwar leistungsstarke Werkzeuge, aber auch teure Unternehmungen, die oft hohe institutionelle Investitionen und Laborkosten erfordern, bevor Daten generiert werden können⁵. Strategien zur Kostenminimierung bei gleichzeitiger Beibehaltung qualitativ hochwertiger Daten sind sehr gefragt.

Der Zebrafisch, Danio rerio, ist zu einem wichtigen Modellsystem für die Erforschung der Entwicklungsbiologie geworden und bietet die Möglichkeit, Analysen ganzer Organe (und Organismen) von Wirbeltieren auf begrenztem Raum zu vervielfachen. Zebrafische sind klein (4-6 mm als Larven und 2-3 cm als erwachsene Tiere) und können Hunderte von durchsichtigen Eiern auf einmal legen⁶. Zebrafischembryonen werden extern befruchtet und entwickeln sich schnell, was es den Forschern ermöglicht, Transgene in frühen Entwicklungsstadien einzuführen, um leicht Funktionsgewinn- und -verlustallele zu erzeugen⁷. Das Anpassen mehrerer Proben auf einem einzigen Objektträger ist eine attraktive Strategie, um Kosten zu senken. Ihre hohe Fruchtbarkeit und geringe Größe machen Zebrafische zu einem idealen Kandidaten für das Multiplexing von räumlichen Transkriptom-Assays, bei denen nur wenig Platz für Proben zur Verfügung steht⁸.

Die Kryosektion von Zebrafischlarven ist eine anspruchsvolle Technik. Viele räumliche transkriptomische Plattformen sind nicht für Zebrafisch-Paraffinschnitte optimiert und erfordern Kryosektionen, wenn mit Zebrafischen als Modellorganismus gearbeitet wird, um die Gewebestruktur zu erhalten und RNA-Transkripte zu erhalten. Darüber hinaus macht es die geringe Größe des Zebrafisches schwierig, qualitativ hochwertige Kryoschnitte zu erhalten und mehrere Proben effektiv zu analysieren. Schwieriger wird diese Aufgabe, wenn man mit Zebrafischlarven arbeitet, die kleiner und zerbrechlicher sind als ihre erwachsenen Artgenossen. Um diese Herausforderungen zu meistern, beschreiben wir eine Methode, die mehrere Proben zuverlässig ausrichtet und den Bildgebungsbereich von räumlichen Bildgebungsplattformen effizient nutzt, um viele hochwertige Schnitte auf einem einzigen Objektträger zu erhalten, die dann von räumlichen Bildgebungsplattformen abgebildet und analysiert werden können (Abbildung 1). In diesem Fall wird diese Methode auf eine räumliche transkriptomische Bildgebungsplattform angewendet.

Protokoll

Dieses Protokoll folgt den Richtlinien des institutionellen Ausschusses für Tierpflege und -nutzung des Dartmouth College.

1. Vorbereitung des Kryostaten

1. Kühlen Sie den Kryostaten auf -22 °C ab und reinigen Sie die Innenflächen des Kryostaten, indem Sie Schmutz in den Behälter bürsten. Platzieren Sie alle notwendigen Bürsten und Werkzeuge in der Kammer.

2. Vorbereitung der Einweg-Basisform

1. Bereiten Sie eine Basisform (37 mm, 24 mm, 5 mm Einweg-Kunststoffform) für die Probenausrichtung vor, indem Sie mit einem Permanentmarker, der als Referenzpunkt für die Probenausrichtung verwendet wird, eine gerade Linie über die Innenseite einer Basisform zeichnen. Legen Sie ein Stück Laborband auf die Innenseite der Grundform, wo die gerade Linie sein sollte, bevor Sie eine Linie zeichnen, um optimale Ergebnisse zu erzielen (Abbildung 2A).
2. Zeichnen Sie einen Punkt auf die Innenseite der Grundform in der Nähe der linken oder rechten Wand, um die richtige Ausrichtung der Probe während der Kryosektion sicherzustellen (Abbildung 2B).
3. Messen Sie den gewünschten Schnittwinkel mit einem Winkelmesser und markieren Sie diesen für jede Probe auf der Innenseite der Grundform (Abbildung 2C).
4. Tragen Sie eine flache Schicht Gefriermedium (optische Kohärenztomographie [OCT]) auf die vorbereitete Grundform auf. Stellen Sie sicher, dass gerade genügend Gefriermedium vorhanden ist, um die Proben zu bedecken.
   1. Vermeiden Sie Luftblasen beim Auftragen des Gefriermediums, indem Sie die Düse der Mediumflasche grundieren und die erforderliche Menge Medium in eine Ecke der Grundform geben, bevor Sie die horizontale Ebene der Basisform so verschieben, dass das Medium gleichmäßig über die gesamte Oberfläche verteilt wird.
   2. Drücken Sie die Flasche langsam zusammen, wenn Sie das Gefriermedium ausgeben.
5. Geben Sie Eis in ein 1-Liter-Becherglas, stellen Sie die Grundform mit dem Gefriermedium in das Eisbad und inkubieren Sie es mindestens 10 Minuten lang, um das Medium abzukühlen.

3. Vorbereitung von Trockeneis: 100% Ethanolbad

1. Bereiten Sie ein Bad mit Trockeneis und 100 % Ethanol in einem Abzug vor, indem Sie einen Teil 100 % Ethanol zu einem Teil Trockeneis in einem Eiskübel hinzufügen.
2. Verwenden Sie eine Einweg-Aluminiumschale oder falten Sie Alufolie zu einem Boot, das groß genug ist, um eine Einweg-Basisform aufzunehmen. Stellen Sie sicher, dass die Schale oder das Schiffchen groß genug ist, damit die Bodenform vollständig flach aufliegt.
3. Stellen Sie die Schale oder das Boot in die Badewanne und decken Sie den Eimer ab. Lassen Sie den Eimer 5-10 Minuten abkühlen, bevor Sie die Proben einfrieren.

4. Einschläfern von Proben

1. Wählen Sie zufällig Zebrafische für die Sektion aus. Wenn die Größe der Proben variiert, teilen Sie sie nach relativer Größe in Gruppen auf, um die genaue Ausrichtung zu erleichtern (siehe Diskussion für Details). Größere und kleinere Fische in getrennte Schalen geben.
2. Füllen Sie ein Becherglas mit Wasser aus dem Fischsystem und stellen Sie das Becherglas in einen Eiskübel. Den Becher mit Eis umgeben.
3. Überwachen Sie die Temperatur des Wassers mit einem Thermometer. Lassen Sie die Temperatur zwischen 2-4 °C stabilisieren.
4. Verwenden Sie ein Netz oder Sieb, um eine Gruppe Fische in das 4 °C warme Wasser zu setzen. Fische sollten vollständig in Wasser getaucht werden und nicht mit Eis in Berührung kommen. Sobald die Bewegung der Opercularität aufgehört hat, gib Eis in das Wasser, um sicherzustellen, dass es unter 4 °C bleibt. Fisch 10 min in 4 °C heißem Wasser ziehen lassen.
   HINWEIS: Fahren Sie mit dem Einbetten, Ausrichten und Schockfrosten jeder Gruppe euthanasierter Proben fort, bevor Sie die nächste Gruppe einschläfern. Ersetzen Sie das Wasser jedes Mal.

5. Einbettung und Ausrichtung

1. Sammeln Sie die eingeschläferten Fische, nachdem sie 10 Minuten lang in 4 °C heißes Wasser getaucht wurden. Nehmen Sie die Fische mit einer feinen Pinzette aus dem Wasser, indem Sie sie an der Schwanzflosse packen und trocknen Sie sie, indem Sie sie vorsichtig gegen ein saugfähiges, fusselfreies Tuch drücken.
   HINWEIS: Bei hochwertigen Abschnitten ist es wichtig, die Zeit zwischen der Entnahme der Fische aus dem 4 °C warmen Wasser und dem Schockfrosten zu begrenzen
2. Arbeiten Sie mit der vorbereiteten Basisform in einem Eisbad unter einem Stereomikroskop (10-fache Vergrößerung), legen Sie jede Probe entlang der Referenzpunkte in der richtigen Ausrichtung in die Basisform und bedecken Sie die Proben vorsichtig mit einer weiteren dünnen Schicht Gefriermedium.
   HINWEIS: Füllen Sie nicht die gesamte Form mit Gefriermedium. Verwenden Sie stattdessen nur eine dünne Schicht, gerade genug, um alle Proben zu bedecken.
3. Verwenden Sie einen anatomischen Referenzpunkt, um den Fisch genau an den Linien auszurichten, die auf der Innenseite der Grundform markiert sind. Verwenden Sie eine Pinzette mit feiner Spitze, um die Ausrichtung jedes Fisches so einzustellen, dass sie ausgerichtet und in der gleichen Ausrichtung sind. Vermeiden Sie die Bildung von Blasen im Gefriermedium, indem Sie sich langsam bewegen.
4. Tragen Sie ein Stück Trockeneis auf den Boden der Basisform unter den Proben auf, bis sie lokal eingefroren sind. Halten Sie die horizontale Ebene der Grundform waagerecht, um zu vermeiden, dass die Proben vor dem Einfrieren mit Trockeneis von ihren Referenzpunkten verschoben werden.
5. Legen Sie die Basisform mit den Proben auf das Aluminiumschiffchen oder die Aluminiumschale in das Trockeneis: 100% Ethanolbad. Stellen Sie sicher, dass das Boot an der Oberfläche des Bades schwimmt und die Grundform trocken bleibt. Decken Sie das Bad ab und lassen Sie die Proben 10 Minuten lang schwimmen.
6. Wickeln Sie die gefrorene Grundform in Folie ein und lagern Sie sie bis zum Schnitt bei -80 °C im Gefrierschrank. Wiederholen Sie die Schritte 4.2 bis 5.6 für alle verbleibenden Gruppen.

6. Kryosektion

1. Bringen Sie gefrorene Basisformen zur Kryosektion in den vorgekühlten Kryostaten und legen Sie sie in die Kryostatenkammer. Transportieren Sie gefrorene Blöcke in einer Box mit Trockeneis, um ein Auftauen zu verhindern.
2. Nehmen Sie den in situ Spatial Imaging Dia aus dem Lager und legen Sie ihn in einen vorgekühlten Objektträgerhalter. Lagern Sie den Objektträgerhalter mit dem Objektträger für die räumliche Bildgebung in der -22 °C heißen Kryostatkammer, bis Sie bereit sind, Schnitte aus dem interessierenden Bereich zu entnehmen.
3. Nehmen Sie die gefrorenen Proben aus der Grundform und frieren Sie sie dann in einem Chuck mit einem frischen Gefriermedium ein. Frieren Sie sie auf dem Spannfutter ein, so dass die Schnittfläche zur Klinge zeigt.
4. Legen Sie eine frische, feine Mikrotomklinge in den Kryostaten.
5. Richten Sie die Form an der Klinge aus und trimmen Sie den interessierenden Bereich (empfohlene Beschnittstärke 20-50 μm). Stellen Sie sicher, dass die in der Form vorgenommenen Markierungen auf den gefrorenen Probenblock übertragen werden, um die Position in den Proben zu identifizieren.
6. Stellen Sie die Form während der Trimmphase so ein, dass die Schnittfläche parallel zu den Referenzmarkierungen im Gefriermedium verläuft.
7. Sammeln Sie Schnitte auf einem positiv geladenen Standard-Objektträger und überprüfen Sie sie mit Hellfeld, um zu bestätigen, wann ein Trimmen nicht mehr erforderlich ist.
8. Nehmen Sie den Objektträger aus der Kryostatenkammer und legen Sie ihn in ein 4 °C heißes Eisbad. Bewahren Sie die Folie im Folienhalter auf. Achten Sie darauf, dass die Rutsche nicht nass wird.
9. Beginn der Kryosektion (empfohlen 10-14 μm; Abbildung 3) und sammeln Sie Schnitte auf positiv geladenen Objektträgern, bis der Bereich von Interesse in den Proben erreicht ist. Überprüfen Sie die Schnitte nach Hellfeld, um sicherzustellen, dass der interessierende Bereich der nächste Abschnitt aus der Form ist.
10. Bringen Sie den Einzelzell-Objektträger zurück in die Kryostatenkammer. Nehmen Sie das Objektträger aus dem Objektträgerhalter und sammeln Sie mit einem feinen Pinsel Reihe für Reihe Abschnitte aus dem genauen Interessenbereich auf dem Objektträger für die räumliche Bildgebung, um zu verhindern, dass sich die Abschnitte aufrollen.
    1. Drücken Sie mit der Rückseite des Pinsels eine Ecke des leeren, gefrierenden Mediums in den Messertisch, so dass der Abschnitt flach bleibt, wenn Sie den Objektträger zum Sammeln greifen.
    2. Verwenden Sie die Oberseite des Schlittens als Drehpunkt, senken Sie den Schlitten langsam auf den Abschnitt ab und lassen Sie die Teile 3 s lang am Schlitten haften, bevor Sie den Schlitten vom Messertisch abheben.
    3. Arbeiten Sie beim Sammeln von Abschnitten im Bildbereich des Objektträgers von links nach rechts und überlappen Sie nach Möglichkeit Schichten aus leerem, gefrierendem Medium.
    4. Verwenden Sie farbige Papierränder als Referenz, um Abschnitte innerhalb des Bildgebungsbereichs des Objektträgers zu platzieren, wenn das Gewebe schwer zu erkennen ist.
11. Nachdem Sie Abschnitte aus dem interessierenden Bereich gesammelt haben, setzen Sie die Folie wieder in den Folienhalter ein. Wenn keine Proben mehr auf dem Objektträger für die räumliche Bildgebung entnommen werden müssen, lagern Sie den Objektträger bis zu 2 Wochen lang bei -80 °C, bis er für die Instrumentenanalyse mit der In-situ-Plattform für die räumliche Bildgebung bereit ist. Wenn Schnitte aus mehreren Formen entnommen werden müssen, legen Sie den Objektträger wieder in das 4 °C heiße Eisbad und wiederholen Sie die Schritte 6.3-6.11 mit der nächsten Form.
12. Entnehmen Sie Schnitte vor und nach den "Region of Interest"-Schnitten von jeder Form auf einem positiv geladenen Standard-Objektträger für die Hämatoxylin- und Eosin (HE)-Färbung, um zu überprüfen, ob die Probenausrichtung und die Schnittqualität ausreichend sind, bevor Sie mit der Analyse fortfahren.

7. Fixieren der Probe

1. Nehmen Sie die Referenzobjektträger aus dem Kryostaten und trocknen Sie sie 30 Minuten lang an der Luft, um die Abschnitte auf dem Objektträger zu kleben.
2. Fixieren Sie die Abschnitte, indem Sie sie für 20 Minuten in einen Objektträgerbehälter mit 4 % Paraformaldehyd (Tabelle 1) legen.
3. Waschen Sie die Abschnitte, indem Sie sie 3 Minuten lang in einen Schiebebehälter mit destilliertem Wasser legen.
4. Fahren Sie mit der HE-Färbung fort oder trocknen Sie sie und lagern Sie die Objektträger bei -80 °C für zukünftige Färbungen.

8. HE-Färbung der Sektionen

1. Dehydrieren und reinigen Sie die Abschnitte, indem Sie die Objektträger 2 Minuten lang in 100 % Ethanol, 2 Minuten lang in 95 % (Tabelle 2) Ethanol und dann 1 Minute lang in Leitungswasser inkubieren. Verwenden Sie ein Färbegestell für Objektträger, um Objektträger von Bad zu Bad zu übertragen.
2. Färben Sie die Zellkerne und differenzieren Sie, indem Sie die Objektträger 2 min 45 s lang in Hämatoxylin inkubieren, 1 min lang in Leitungswasser, 1 min mit 0,3 % angesäuertem Alkohol (Tabelle 3) und dann 1 min lang mit fließendem Leitungswasser inkubieren. Verwenden Sie ein Färbegestell für Objektträger, um Objektträger von Bad zu Bad zu übertragen.
3. Färben Sie die zytoplasmatischen Komponenten und dehydrieren Sie, indem Sie die Objektträger in Eosin Y 1% für 45 s, 50% Ethanol (Tabelle 4) für 1 min, 95% Ethanol für 1 min und 100% Ethanol für 1 min inkubieren. Verwenden Sie ein Färbegestell für Objektträger, um Objektträger von Bad zu Bad zu übertragen.
4. Reinigen Sie die Abschnitte, indem Sie die Objektträger 1 Minute lang in Xylol inkubieren. Montieren und bedecken Sie die Objektträger, indem Sie mit einer Transferpipette einen Tropfen Eindeckmedium auf das obere Drittel des Objektträgers auftragen und ein Deckglas langsam mit einer Pinzette auf das Eindeckmedium absenken.

9. Räumliche Transkriptomik und Analyse der Schnitte

1. Entnehmen Sie die Objektträger aus der Lagerung bei -80 °C und bilden Sie sie mit einer In-situ-Plattform für die räumliche Transkriptomanalyse ab.
   HINWEIS: Die genauen Schritte der Bildgebung werden von der Spatial Imaging-Plattform bestimmt.
2. Überprüfen Sie die Qualitätskontrollmetriken der räumlichen Transkriptomik-Plattform. Wichtige Metriken, die überprüft werden müssen, sind die Anzahl der nachgewiesenen Zellen, die medianen Transkripte pro Zelle, die Kerntranskripte pro 100^{μm 2} und die Gesamtzahl der qualitativ hochwertigen dekodierten Transkripte jedes Gens im Sondensatz.
   HINWEIS: Für diese Qualitätskontrollmetriken gibt es keine universellen Schwellenwerte, und die Erwartungen an diese Schwellenwerte variieren je nach verwendeter Probe und Genpanel.
3. Lesen Sie die Datenausgabe von nachweisbaren RNA-Transkripten, bestimmen Sie anhand der Qualitätskontrollmetriken des Experiments, welche Transkripte von geringer Qualität sind, und filtern Sie Transkripte von geringer Qualität heraus. Analysieren Sie die verbleibenden hochwertigen Transkripte in Bezug auf ihre räumliche Anordnung innerhalb des Abschnitts.
4. Sehen Sie sich die zelluläre Segmentierung der Schnitte und Clusterzellen basierend auf experimentellen Interessen an. Vergleichen Sie die RNA-Transkripte innerhalb von Zellclustern der interessierenden Region über Gruppen unterschiedlichen Alters von Zebrafischen auf demselben Objektträger.

Ergebnisse

Bei dieser Methode (Abbildung 1) wird der Zebrafisch als Tiermodell verwendet, um nach räumlich aufgelösten Genexpressionsmustern zu suchen. Die effiziente Kryosektion von Zebrafischlarven für die räumliche Bildgebung ist eine Herausforderung. Die Schnitte müssen von hoher Qualität sein, um die Gewebestruktur und die nachweisbaren Gene zu erhalten (Abbildung 4). Schnitte mit mehreren Proben für eine räumlich effiziente B...

Diskussion

Dieser Bericht bietet detaillierte Lösungen für viele der technischen Herausforderungen, die mit dem Zebrafisch als Modellorganismus in der räumlichen Transkriptomanalyse während der Entwicklung verbunden sind. Um diese Herausforderungen zu bewältigen, optimiert unsere kompakte Probenanordnung die Kosten auf den neu entstehenden räumlichen Transkriptomplattformen¹. Die Kryosektion von Zebrafischlarven für die räumliche Bildgebung ist eine Herausforderung. ...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
1 L Beaker	Pyrex	1003
200 proof pure ethanol	Koptec	V1001
Acetic acid, glacial	VWR	0714	acidified alcohol
Aluminum foil
Cover slips	Epredia	24X50-1.5-001G
Disposable base mold	Fisher HealthCare	22-363-556
Distilled water
DPX mountant	Sigma-Aldrich	06522	mountant for histology
Dry ice pellets
Dumont #5SF Forceps	Fine Science Tools	11252-00
Eosin-Y Alcoholic	Epredia	71204	Eosin Y 1%
Gill 1 Hematoxylin	Epredia	72411	Hematoxylin
Kimwipe	Kimberly-Clark Professional	34120	absorbent, lint-free wipe
Lab labelling tape	VWR	89097-934
Microtome blade MX35 Ultra	Epredia	3053835
Microtome Cryostat	Thermo Scientific	Microme HM 525
O.C.T. Compound	Fisher HealthCare	23-730-571	freezing medium
Paraformaldehyde	Sigma-Aldrich	158127	PFA
Permanent Marker	VWR	52877-886
Protractor
SafeClear Xylene Substitute	Fisherbrand	68551-16-6	Xylene substitute
Single Edge Blades	American Line	66-0407
Steriomicroscope	Zeiss	4350639000	Stemi 305 w/ double spot LED (4355259020) and Stand K lab (4354259010)
Superfrost Plus Micro Slides	VWR	48311-703
Transfer pipet
Xenium V1 slide	10X/Xenium	3000941	spatial transcriptomic imaging slide