Disposizione spazialmente compatta delle sezioni larvali di zebrafish per l'analisi trascrittomica spaziale

Riepilogo

Qui, presentiamo un metodo per allineare e criosezionare più campioni di larve di Zebrafish (Danio rerio) e raccoglierli su un singolo vetrino per l'analisi trascrittomica spaziale.

Abstract

Le tecniche di trascrittomica spaziale sono uno strumento sofisticato nella ricerca biomedica per visualizzare i modelli di espressione genica registrati spazialmente. L'imaging e l'analisi di più campioni con piattaforme di imaging spaziale possono essere costosi. L'esecuzione di questi test su più condizioni sperimentali, come si è visto negli studi sullo sviluppo, aumenta ulteriormente i costi. Per ridurre i costi, questo studio ha cercato di ottimizzare le tecniche e le strategie di disposizione dei campioni di trascrittomica spaziale per gli studi sullo sviluppo. Qui, lo studio ha utilizzato il pesce zebra, che è un modello di vertebrato di sviluppo ben consolidato che è trasparente durante lo sviluppo, ha ~ 70% di omologia genetica con gli esseri umani e un genoma altamente annotato ideale per l'analisi trascrittomica. A causa delle loro piccole dimensioni, lo sviluppo del pesce zebra consente anche il posizionamento compatto di sezioni seriali su diverse repliche biologiche. In questo articolo, riportiamo la fissazione ottimizzata, la criosezione e l'allineamento affidabile di più campioni di pesce all'interno dell'area di imaging di una piattaforma di imaging spaziale di ibridazione multiplex in situ. Con questo metodo, i pesci zebra a partire da 15 giorni dopo la fecondazione (dpf) da almeno 4 diversi stampi e fino a 174 sezioni possono essere criosezionati con successo, raccolti all'interno dell'area di imaging di 22 mm 10,5 mm (per un vetrino trascrittomico spaziale in situ ) e processati simultaneamente. Sulla base della qualità della sezione, dell'allineamento del campione e della dimensione del campione per vetrino, questo metodo nel pesce zebra ottimizza l'output e il costo per campione delle tecniche di trascrittomica spaziale.

Introduzione

La valutazione di modelli di espressione spazialmente distinti nei tessuti rimane fondamentale per la nostra comprensione delle influenze genomiche nello sviluppo, nel cancro e nella malattia ^1,2,3. La trascrittomica spaziale combina tecniche di espressione multiplexata con la registrazione spaziale dell'espressione nei tessuti. La "trascrittomica spaziale" è stata coniata per la prima volta da Ståhl e colleghi⁴, in cui i campioni di cancro montati sono stati sondati utilizzando il sequenziamento in situ di nuova generazione. Da quel momento, la "trascrittomica spaziale" è stata utilizzata come catch-all per studi di espressione ad alto rendimento combinati con la registrazione spaziale. Sebbene si tratti di strumenti potenti, si tratta anche di imprese costose che spesso richiedono ingenti investimenti istituzionali e costi di laboratorio prima che i dati possano essere generati⁵. Le strategie per ridurre al minimo i costi preservando al contempo dati di alta qualità sono molto richieste.

Il pesce zebra, Danio rerio, è diventato un importante sistema modello per lo studio della biologia dello sviluppo e offre un mezzo per moltiplicare le analisi di interi organi (e organismi) dei vertebrati in uno spazio limitato. I pesci zebra sono piccoli (4-6 mm come larve e 2-3 cm come adulti) e possono deporre centinaia di uova trasparenti alla volta⁶. Gli embrioni di pesce zebra vengono fecondati esternamente e si sviluppano rapidamente, consentendo ai ricercatori di introdurre transgeni nelle prime fasi di sviluppo per generare prontamente alleli di guadagno e perdita di funzione⁷. L'inserimento di più campioni su un singolo vetrino è una strategia interessante per ridurre i costi. La loro elevata fecondità e le piccole dimensioni rendono il pesce zebra un candidato ideale per il multiplexing di saggi trascrittomici spaziali che hanno uno spazio limitato per i campioni⁸.

La criosezione delle larve di pesce zebra è una tecnica impegnativa. Molte piattaforme di trascrittomica spaziale non sono state ottimizzate per le sezioni di paraffina di zebrafish e richiedono criosezioni quando si lavora con zebrafish come organismo modello per preservare la struttura dei tessuti e conservare i trascritti di RNA. Inoltre, le piccole dimensioni del pesce zebra rendono difficile ottenere criosezioni di qualità e analizzare più campioni in modo efficace. Questo compito diventa più difficile quando si lavora con larve di pesce zebra che sono più piccole e più fragili delle loro controparti adulte. Per superare queste sfide, descriviamo un metodo che allinea in modo affidabile più campioni e utilizza in modo efficiente l'area di imaging delle piattaforme di imaging spaziale per ottenere molte sezioni di alta qualità su un singolo vetrino che possono quindi essere visualizzate e analizzate dalle piattaforme di imaging spaziale (Figura 1). In questo caso, questo metodo viene applicato a una piattaforma di imaging trascrittomico spaziale.

Protocollo

Questo protocollo segue le linee guida del comitato istituzionale per la cura e l'uso degli animali del Dartmouth College.

1. Preparazione del criostato

1. Raffreddare il criostato a -22 °C e pulire le superfici interne del criostato spazzolando i detriti nel recipiente. Posizionare tutte le spazzole e gli strumenti necessari all'interno della camera.

2. Preparazione dello stampo base usa e getta

1. Preparare uno stampo di base (stampo in plastica monouso da 37 mm, 24 mm, 5 mm) per l'allineamento del campione tracciando una linea retta attraverso l'interno di uno stampo di base con un pennarello indelebile da utilizzare come punto di riferimento per l'allineamento del campione. Posiziona un pezzo di nastro adesivo da laboratorio all'interno dello stampo di base dove dovrebbe essere la linea retta prima di tracciare una linea per ottenere i migliori risultati (Figura 2A).
2. Disegnare un punto all'interno dello stampo di base vicino alla parete sinistra o destra per garantire il corretto orientamento del campione durante la criosezione (Figura 2B).
3. Misurare l'angolo di taglio desiderato con un goniometro e segnarlo all'interno dello stampo di base per ogni campione (Figura 2C).
4. Applicare uno strato superficiale di terreno di congelamento (tomografia a coerenza ottica [OCT]) sullo stampo di base preparato. Assicurarsi che ci sia abbastanza mezzo di congelamento per coprire i campioni.
   1. Evitare la formazione di bolle d'aria durante l'applicazione del mezzo di congelamento adescando l'ugello della bottiglia media e aggiungendo la quantità necessaria di terreno in un angolo dello stampo di base prima di spostare il piano orizzontale dello stampo di base in modo che il mezzo sia distribuito uniformemente su tutta la superficie.
   2. Spremere lentamente il flacone durante l'erogazione del mezzo di congelamento.
5. Aggiungere il ghiaccio in un becher da 1 litro, posizionare lo stampo di base con il mezzo di congelamento nel bagno di ghiaccio e incubare per almeno 10 minuti per raffreddare il terreno.

3. Preparazione del ghiaccio secco: bagno di etanolo al 100%

1. Preparare un bagno di ghiaccio secco ed etanolo al 100% in una cappa aspirante aggiungendo una parte di etanolo al 100% a una parte di ghiaccio secco in un secchiello per il ghiaccio.
2. Usa un piatto di alluminio usa e getta o piega un foglio di alluminio in una barca abbastanza grande da contenere uno stampo di base usa e getta. Assicurarsi che il piatto o la barca siano abbastanza grandi da consentire allo stampo di base di essere completamente piatto.
3. Metti il piatto o la barca nella vasca da bagno e copri il secchio. Attendere 5-10 minuti affinché il secchio si raffreddi prima di congelare i campioni.

4. Campioni di eutanasia

1. Seleziona casualmente il pesce zebra per il sezionamento. Se i campioni variano di dimensioni, separarli in gruppi in base alle dimensioni relative per facilitare l'allineamento accurato (vedere la discussione per i dettagli). Mettere il pesce più grande e il pesce più piccolo in piatti separati.
2. Riempi un bicchiere con acqua del sistema di pesci e metti il bicchiere in un secchiello per il ghiaccio. Circondare il bicchiere con del ghiaccio.
3. Monitora la temperatura dell'acqua con un termometro. Lasciare che la temperatura si stabilizzi tra 2-4 °C.
4. Usa una rete o un colino per mettere un gruppo di pesci nell'acqua a 4 °C. I pesci devono essere completamente immersi nell'acqua e non a contatto con il ghiaccio. Una volta cessato il movimento opercolare, aggiungere ghiaccio all'acqua per assicurarsi che rimanga al di sotto dei 4 °C. Lasciare il pesce in acqua a 4 °C per 10 minuti.
   NOTA: Continuare con l'incorporamento, l'allineamento e il congelamento rapido di ciascun gruppo di campioni sottoposti a eutanasia prima di eseguire l'eutanasia del gruppo successivo. Sostituire l'acqua ogni volta.

5. Incorporamento e allineamento

1. Raccogli i pesci soppressi dopo che sono stati immersi in acqua a 4 °C per 10 minuti. Togliete i pesci dall'acqua con una pinza a punta fine afferrandoli per la pinna caudale e asciugateli premendoli delicatamente contro un panno assorbente e privo di lanugine.
   NOTA: Per sezioni di alta qualità, è fondamentale limitare il tempo tra la rimozione del pesce dall'acqua a 4 °C e il congelamento rapido
2. Lavorando con lo stampo di base preparato in un bagno di ghiaccio al microscopio stereomicroscopico (ingrandimento 10x), posizionare ogni campione nello stampo di base lungo i punti di riferimento con l'orientamento corretto e coprire delicatamente i campioni con un altro strato sottile di mezzo di congelamento.
   NOTA: Non riempire l'intero stampo con mezzo di congelamento. Utilizzare invece solo uno strato sottile, quanto basta per coprire tutti i campioni.
3. Utilizzare un punto di riferimento anatomico per allineare con precisione il pesce alle linee segnate all'interno dello stampo di base. Usa una pinza a punta fine per regolare l'orientamento di ogni pesce in modo che siano allineati e con lo stesso orientamento. Evitare di creare bolle nel mezzo di congelamento muovendosi lentamente.
4. Applicare un pezzo di ghiaccio secco sul fondo dello stampo di base sotto i campioni fino a quando non vengono congelati localmente in posizione. Mantenere il piano orizzontale dello stampo di base in piano per evitare di spostare i campioni dai loro punti di riferimento prima di congelarli in posizione con ghiaccio secco.
5. Posizionare lo stampo di base con i campioni sulla barca di alluminio o sul piatto nel bagno di ghiaccio secco: 100% etanolo. Assicurarsi che la barca galleggi sulla superficie della vasca e che lo stampo di base rimanga asciutto. Coprire il bagno e lasciare galleggiare i campioni per 10 minuti.
6. Avvolgere lo stampo base congelato in un foglio di alluminio e conservare in congelatore a -80 °C fino al momento di sezionare. Ripetere i passaggi 4.2-5.6 per tutti i gruppi rimanenti.

6. Criosezione

1. Portare gli stampi di base congelati al criostato pre-raffreddato per la criosezione e posizionarli nella camera del criostato. Trasportare i blocchi congelati in una scatola con ghiaccio secco per evitare lo scongelamento.
2. Rimuovere il vetrino per immagini spaziali in situ dal deposito e riporlo in un supporto per vetrini pre-raffreddato. Conservare il supporto del vetrino con il vetrino per immagini spaziali nella camera del criostato a -22 °C fino al momento di raccogliere le sezioni dalla regione di interesse.
3. Rimuovere i campioni congelati dallo stampo di base e poi congelarli in un mandrino con un mezzo di congelamento fresco. Congelarli sul mandrino in modo che la superficie di taglio sia rivolta verso la lama.
4. Metti una lama di microtomo fresca e fine nel criostato.
5. Allineare lo stampo alla lama e rifilare la regione di interesse (spessore di rifilatura consigliato 20-50 μm). Assicurarsi che le marcature effettuate all'interno dello stampo vengano trasferite al blocco del campione congelato per aiutare a identificare la posizione all'interno dei campioni.
6. Regolare lo stampo durante la fase di rifilatura in modo che la superficie di taglio sia parallela ai segni di riferimento nel mezzo di congelamento.
7. Raccogli le sezioni su un vetrino da microscopio standard caricato positivamente e controllale in campo chiaro per confermare quando il taglio non è più necessario.
8. Rimuovere il vetrino per immagini spaziali dalla camera del criostato e metterlo in un bagno di ghiaccio a 4 °C. Conservare la diapositiva nel supporto per diapositive. Assicurarsi che il vetrino non si bagni.
9. Iniziare la criosezione (consigliata 10-14 μm; Figura 3) e raccogliere sezioni su vetrini caricati positivamente fino a raggiungere la regione di interesse nei campioni. Controllare le sezioni in campo chiaro per confermare che la regione di interesse sarà la sezione successiva dallo stampo.
10. Riportare il vetrino di imaging spaziale a singola cellula nella camera del criostato. Rimuovere il vetrino dal supporto del vetrino e raccogliere le sezioni dall'esatta area di interesse sul vetrino di imaging spaziale riga per riga utilizzando un pennello a punta fine per evitare che le sezioni si arrotolino.
    1. Premere un angolo del mezzo vuoto e congelante nella fase del coltello con la parte posteriore del pennello in modo che la sezione rimanga piatta quando si afferra il vetrino per la raccolta.
    2. Utilizzare la parte superiore della diapositiva come punto di rotazione, abbassare lentamente la diapositiva sulla sezione e lasciare che le sezioni aderiscano alla diapositiva per 3 s prima di sollevare la diapositiva dal coltello stage.
    3. Lavorare da sinistra a destra quando si raccolgono le sezioni nell'area di imaging del vetrino e, quando possibile, sovrapporre strati di terreno vuoto e congelante.
    4. Utilizzare i bordi di carta colorati come riferimento per posizionare le sezioni all'interno dell'area di imaging del vetrino se il tessuto è difficile da vedere.
11. Dopo aver raccolto le sezioni dalla regione di interesse, riposizionare la diapositiva nel supporto della diapositiva. Se non ci sono più campioni da raccogliere sul vetrino per l'imaging spaziale, conservare il vetrino a -80 °C per un massimo di 2 settimane fino a quando non è pronto per l'analisi strumentale con la piattaforma di imaging spaziale in situ . Se le sezioni devono essere raccolte da più stampi, rimettere il vetrino di imaging spaziale nel bagno di ghiaccio a 4 °C e ripetere i passaggi 6.3-6.11 con lo stampo successivo.
12. Raccogliere le sezioni prima e dopo le sezioni della regione di interesse da ciascuno stampo su un vetrino da microscopio standard caricato positivamente per la colorazione con ematossilina ed eosina (HE) per verificare che l'allineamento del campione e la qualità della sezione siano sufficienti prima di procedere con l'analisi.

7. Fissaggio del campione

1. Rimuovere i vetrini di riferimento dal criostato e asciugare all'aria a RT per 30 minuti per far aderire le sezioni al vetrino.
2. Fissare le sezioni mettendole in un contenitore per vetrini con paraformaldeide al 4% (Tabella 1) per 20 minuti.
3. Lavare le sezioni mettendole in un contenitore scorrevole con acqua distillata per 3 minuti.
4. Continuare con la colorazione HE o asciugare e conservare i vetrini a -80 °C per la colorazione futura.

8. Colorazione HE delle sezioni

1. Disidratare e pulire le sezioni incubando i vetrini in etanolo al 100% per 2 minuti, etanolo al 95% (Tabella 2) per 2 minuti, quindi acqua di rubinetto per 1 minuto. Utilizzare un rack per la colorazione dei vetrini del microscopio per trasferire i vetrini da una vasca all'altra.
2. Colorare i nuclei e differenziare incubando i vetrini in ematossilina per 2 minuti e 45 secondi, acqua del rubinetto per 1 minuto, alcol acidificato allo 0,3% (Tabella 3) per 1 minuto e quindi acqua corrente del rubinetto per 1 minuto. Utilizzare un rack per la colorazione dei vetrini del microscopio per trasferire i vetrini da una vasca all'altra.
3. Colorare i componenti citoplasmatici e disidratare incubando i vetrini in eosina Y all'1% per 45 s, etanolo al 50% (Tabella 4) per 1 minuto, etanolo al 95% per 1 minuto ed etanolo al 100% per 1 minuto. Utilizzare un rack per la colorazione dei vetrini del microscopio per trasferire i vetrini da una vasca all'altra.
4. Cancellare le sezioni incubando i vetrini in xilene per 1 minuto. Montare e coprire i vetrini applicando una goccia di terreno di montaggio sul terzo superiore del vetrino con una pipetta di trasferimento e abbassando lentamente un vetrino coprioggetti sulla parte superiore del mezzo di montaggio con una pinza.

9. Imaging trascrittomico spaziale e analisi delle sezioni

1. Rimuovere i vetrini da una conservazione a -80 °C e acquisire immagini con una piattaforma di imaging spaziale in situ per l'analisi trascrittomica spaziale.
   NOTA: I passaggi esatti coinvolti nell'imaging saranno determinati dalla piattaforma di imaging spaziale.
2. Esaminare le metriche di controllo della qualità della piattaforma di trascrittomica spaziale. Metriche importanti da controllare sono il numero di cellule rilevate, i trascritti mediani per cellula, i trascritti nucleari per 100 μm² e i trascritti decodificati totali di alta qualità di ciascun gene nel set di sonde.
   NOTA: Queste metriche di controllo della qualità non hanno soglie universali e le aspettative per queste soglie variano a seconda del campione e del pannello genetico utilizzato.
3. Leggi l'output dei dati delle trascrizioni di RNA rilevabili, determina quali trascrizioni sono di bassa qualità in base alle metriche di controllo della qualità dell'esperimento e filtra le trascrizioni di bassa qualità. Analizza le restanti trascrizioni di alta qualità in relazione alla loro disposizione spaziale all'interno della sezione.
4. Visualizza la segmentazione cellulare delle sezioni e delle cellule del cluster in base agli interessi sperimentali. Confrontare i trascritti di RNA all'interno di cluster cellulari della regione di interesse tra gruppi di diverse età di zebrafish sullo stesso vetrino.

Risultati

In questo metodo (Figura 1), il pesce zebra viene utilizzato come modello animale per sondare i modelli di espressione genica spazialmente risolti. La criosezione efficiente delle larve di pesce zebra per l'imaging spaziale è impegnativa. Le sezioni devono essere di alta qualità per mantenere la struttura tissutale e i geni rilevabili (Figura 4). Le sezioni contenenti più campioni per un imaging spazialmente efficiente devono...

Discussione

Questo rapporto fornisce soluzioni dettagliate a molte delle sfide tecniche associate al pesce zebra come organismo modello nell'analisi trascrittomica spaziale durante lo sviluppo. Nell'affrontare queste sfide, la nostra disposizione compatta dei campioni ottimizza i costi sulle piattaforme di trascrittomica spaziale emergenti¹. La criosezione di larve di pesce zebra per l'imaging spaziale è impegnativa. Le sezioni devono mantenere una struttura tissutale e una ...

Materiali

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1 L Beaker	Pyrex	1003
200 proof pure ethanol	Koptec	V1001
Acetic acid, glacial	VWR	0714	acidified alcohol
Aluminum foil
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Disposable base mold	Fisher HealthCare	22-363-556
Distilled water
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