Agencement spatialement compact de coupes de larves de poisson-zèbre pour l’analyse transcriptomique spatiale

Résumé

Ici, nous présentons une méthode pour aligner et cryosectionner plusieurs échantillons de larves de poisson-zèbre (Danio rerio) et les collecter sur une seule lame pour une analyse transcriptomique spatiale.

Résumé

Les techniques transcriptomiques spatiales sont un outil sophistiqué dans la recherche biomédicale pour visualiser des modèles d’expression génique enregistrés dans l’espace. L’imagerie et l’analyse de plusieurs échantillons à l’aide de plateformes d’imagerie spatiale peuvent être coûteuses. La réalisation de ces tests dans plusieurs conditions expérimentales, comme on le voit dans les études de développement, augmente encore les coûts. Afin de réduire les coûts, cette étude a cherché à optimiser les techniques et les stratégies d’arrangement transcriptomique spatial des échantillons pour les études de développement. Ici, l’étude a utilisé le poisson zèbre, qui est un modèle de vertébré de développement bien établi qui est transparent pendant le développement, a ~70 % d’homologie génétique avec les humains et un génome hautement annoté idéal pour l’analyse transcriptomique. En raison de leur petite taille, le développement du poisson-zèbre permet également de placer de manière compacte des sections en série sur plusieurs réplicats biologiques. Dans cet article, nous rapportons l’optimisation de la fixation, de la cryosection et de l’alignement fiable de plusieurs échantillons de poissons dans la zone d’imagerie d’une plateforme d’imagerie spatiale d’hybridation in situ multiplexe. Avec cette méthode, des poissons-zèbres aussi jeunes que 15 jours après la fécondation (dpf) d’au moins 4 moules différents et jusqu’à 174 sections peuvent être cryosectionnés avec succès, collectés dans la zone d’imagerie de 22 mm 10,5 mm (pour une lame transcriptomique spatiale in situ ) et traités simultanément. Basée sur la qualité de la section, l’alignement de l’échantillon et la taille de l’échantillon par lame, cette méthode chez le poisson zèbre optimise le rendement et le coût par échantillon des techniques de transcriptomique spatiale.

Introduction

L’évaluation des modèles d’expression spatialement distincts dans les tissus reste essentielle pour notre compréhension des influences génomiques dans le développement, le cancer et la maladie ^1,2,3. La transcriptomique spatiale combine des techniques d’expression multiplexées avec l’enregistrement spatial de l’expression dans les tissus. La « transcriptomique spatiale » a été inventée pour la première fois par Ståhl et ses collègues⁴, où des échantillons de cancer montés ont été sondés à l’aide d’un séquençage in situ de nouvelle génération. Depuis lors, la « transcriptomique spatiale » a été utilisée comme un fourre-tout pour les études d’expression à haut débit combinées à l’enregistrement spatial. Bien qu’il s’agisse d’outils puissants, ils sont également coûteux et nécessitent souvent des investissements institutionnels importants et des coûts de laboratoire avant que les données puissent être générées⁵. Les stratégies visant à minimiser les coûts tout en préservant des données de haute qualité sont très demandées.

Le poisson-zèbre, Danio rerio, est devenu un système modèle important pour l’étude de la biologie du développement et offre un moyen de multiplier les analyses d’organes entiers (et d’organismes) de vertébrés dans un espace limité. Les poissons-zèbres sont petits (4 à 6 mm en tant que larves et 2 à 3 cm en tant qu’adultes) et peuvent pondre des centaines d’œufs transparents à la fois⁶. Les embryons de poisson-zèbre sont fécondés à l’extérieur et se développent rapidement, ce qui permet aux chercheurs d’introduire des transgènes aux premiers stades de développement pour générer facilement des allèles de gain et de perte de fonction⁷. L’ajustement de plusieurs échantillons sur une seule lame est une stratégie attrayante pour réduire les coûts. Leur grande fécondité et leur petite taille font du poisson-zèbre un candidat idéal pour le multiplexage des tests transcriptomiques spatiaux qui ont restreint l’espace pour les spécimens⁸.

La cryosection des larves de poisson-zèbre est une technique difficile. De nombreuses plateformes transcriptomiques spatiales n’ont pas été optimisées pour les coupes de paraffine du poisson-zèbre et nécessitent des cryosections lorsqu’on travaille avec le poisson-zèbre en tant qu’organisme modèle pour préserver la structure tissulaire et conserver les transcrits d’ARN. De plus, la petite taille du poisson-zèbre rend difficile l’obtention de cryosections de qualité et l’analyse efficace de plusieurs échantillons. Cette tâche devient plus difficile lorsque l’on travaille avec des larves de poisson-zèbre qui sont plus petites et plus fragiles que leurs homologues adultes. Pour surmonter ces défis, nous décrivons une méthode qui aligne de manière fiable plusieurs échantillons et utilise efficacement la zone d’imagerie des plateformes d’imagerie spatiale pour obtenir de nombreuses sections de haute qualité sur une seule lame qui peuvent ensuite être imagées et analysées par des plateformes d’imagerie spatiale (Figure 1). Dans ce cas, cette méthode est appliquée à une plateforme d’imagerie transcriptomique spatiale.

Protocole

Ce protocole suit les lignes directrices du comité institutionnel de soin et d’utilisation des animaux du Dartmouth College.

1. Préparation du cryostat

1. Refroidissez le cryostat à -22 °C et nettoyez les surfaces intérieures du cryostat en brossant les débris dans le récipient. Placez toutes les brosses et tous les outils nécessaires à l’intérieur de la chambre.

2. Préparation du moule de base jetable

1. Préparez un moule de base (moule en plastique jetable de 37 mm, 24 mm, 5 mm) pour l’alignement de l’échantillon en traçant une ligne droite à l’intérieur d’un moule de base avec un marqueur permanent à utiliser comme point de référence pour l’alignement de l’échantillon. Placez un morceau de ruban adhésif de laboratoire à l’intérieur du moule de base, à l’endroit où la ligne droite doit se trouver, avant de tracer une ligne pour de meilleurs résultats (Figure 2A).
2. Tracez un point à l’intérieur du moule de base, près de la paroi gauche ou droite, pour assurer une bonne orientation de l’échantillon pendant la cryosection (Figure 2B).
3. Mesurez l’angle de coupe souhaité à l’aide d’un rapporteur et marquez-le à l’intérieur du moule de base pour chaque échantillon (Figure 2C).
4. Appliquez une couche peu profonde de milieu de congélation (tomographie par cohérence optique [OCT]) sur le moule de base préparé. Assurez-vous qu’il y a juste assez de milieu de congélation pour couvrir les échantillons.
   1. Évitez les bulles d’air lors de l’application du produit de congélation en amorçant la buse de la bouteille de fluide et en ajoutant la quantité nécessaire de fluide dans un coin du moule de base avant de déplacer le plan horizontal du moule de base afin que le milieu soit réparti uniformément sur toute la surface.
   2. Pressez lentement le flacon lors de la distribution du fluide de congélation.
5. Ajoutez de la glace dans un bécher de 1 L, placez le moule de base avec le milieu de congélation dans le bain de glace et incubez pendant au moins 10 minutes pour refroidir le milieu.

3. Préparation de la glace sèche : bain à 100 % éthanol

1. Préparez un bain de glace sèche et d’éthanol à 100 % dans une hotte en ajoutant une partie d’éthanol à une partie de glace carbonique dans un seau à glace.
2. Utilisez un plat en aluminium jetable ou pliez du papier d’aluminium dans un bateau suffisamment grand pour contenir un moule de base jetable. Assurez-vous que le plat ou le bateau est suffisamment grand pour que le moule de base soit complètement à plat.
3. Placez le plat ou le bateau dans le bain et couvrez le seau. Attendez 5 à 10 minutes pour que le seau refroidisse avant de congeler les échantillons.

4. Euthanasie des échantillons

1. Sélectionnez au hasard le poisson-zèbre pour la section. Si les échantillons varient en taille, séparez-les en groupes par taille relative pour faciliter un alignement précis (voir la discussion pour plus de détails). Placez les gros poissons et les petits poissons dans des plats séparés.
2. Remplissez un bécher avec de l’eau du système de poisson et placez le bécher dans un seau à glace. Entourez le bécher de glace.
3. Surveillez la température de l’eau à l’aide d’un thermomètre. Laissez la température se stabiliser entre 2 et 4 °C.
4. À l’aide d’un filet ou d’une passoire, mettez un groupe de poissons dans l’eau à 4 °C. Les poissons doivent être complètement immergés dans l’eau et ne pas être en contact avec la glace. Une fois que le mouvement de l’opercule a cessé, ajoutez de la glace à l’eau pour vous assurer qu’elle reste en dessous de 4 °C. Laissez le poisson dans de l’eau à 4 °C pendant 10 min.
   REMARQUE : Poursuivre l’enrobage, l’alignement et la congélation instantanée de chaque groupe d’échantillons euthanasiés avant d’euthanasier le groupe suivant. Remplacez l’eau à chaque fois.

5. Intégration et alignement

1. Récupérez les poissons euthanasiés après qu’ils aient été immergés dans de l’eau à 4 °C pendant 10 min. Retirez les poissons de l’eau à l’aide d’une pince à pointe fine en les saisissant par la nageoire caudale et séchez-les en les pressant doucement contre une lingette absorbante et non pelucheuse.
   REMARQUE : Pour des sections de haute qualité, il est essentiel de limiter le temps entre le retrait du poisson de l’eau à 4 °C et la congélation instantanée
2. En travaillant avec le moule de base préparé dans un bain de glace sous un stéréomicroscope (grossissement 10x), placez chaque échantillon dans le moule de base le long des points de référence dans la bonne orientation et recouvrez doucement les échantillons d’une autre fine couche de produit de congélation.
   REMARQUE : Ne remplissez pas tout le moule avec du produit de congélation. Au lieu de cela, n’utilisez qu’une couche mince, juste assez pour couvrir tous les échantillons.
3. Utilisez un point de référence anatomique pour aligner précisément le poisson sur les lignes marquées à l’intérieur du moule de base. À l’aide d’une pince à pointe fine, ajustez l’orientation de chaque poisson afin qu’ils soient alignés et dans la même orientation. Évitez de créer des bulles dans le milieu de congélation en vous déplaçant lentement.
4. Appliquez un morceau de glace sèche au fond du moule de base sous les échantillons jusqu’à ce qu’ils soient localement gelés en position. Maintenez le plan horizontal du moule de base à niveau pour éviter de déplacer les échantillons de leurs points de référence avant de les geler en position avec de la glace sèche.
5. Placez le moule de base avec les échantillons sur le bateau ou le plat en aluminium dans le bain de glace carbonique : 100 % éthanol. Assurez-vous que le bateau flotte à la surface du bain et que le moule de base reste sec. Couvrez le bain et laissez les échantillons flotter pendant 10 min.
6. Enveloppez le moule de base congelé dans du papier d’aluminium et conservez-le au congélateur à -80 °C jusqu’au moment de le sectionner. Répétez les étapes 4.2 à 5.6 pour les groupes restants.

6. Cryosectionnement

1. Apportez les moules de base congelés dans le cryostat pré-refroidi pour la cryosection et placez-les dans la chambre du cryostat. Transportez les blocs congelés dans une boîte avec de la glace sèche pour éviter la décongélation.
2. Retirez la lame d’imagerie spatiale in situ de son stockage et placez-la dans un support de lame pré-refroidi. Rangez le support de lames avec la lame d’imagerie spatiale dans la chambre du cryostat à -22 °C jusqu’à ce qu’il soit prêt à collecter des coupes dans la région d’intérêt.
3. Retirez les échantillons congelés du moule de base, puis congelez-les dans un mandrin avec un produit de congélation frais. Congelez-les sur le mandrin afin que la surface de coupe fasse face à la lame.
4. Placez une lame de microtome fraîche et fine dans le cryostat.
5. Alignez le moule sur la lame et coupez la région d’intérêt (épaisseur de coupe recommandée 20-50 μm). Assurez-vous que les marques faites à l’intérieur du moule sont transférées sur le bloc d’échantillons congelé pour aider à identifier l’emplacement dans les échantillons.
6. Ajustez le moule pendant la phase de coupe de manière à ce que la surface de coupe soit parallèle aux repères de référence dans le produit de congélation.
7. Collectez des coupes sur une lame de microscope standard chargée positivement et vérifiez-les en fond clair pour confirmer quand le rognage n’est plus nécessaire.
8. Retirez la lame d’imagerie spatiale de la chambre du cryostat et placez-la dans un bain de glace à 4 °C. Gardez la diapositive dans le support de diapositive. Assurez-vous que la diapositive ne soit pas mouillée.
9. Commencer la cryosection (recommandé 10-14 μm ; Graphique 3) et collecter des sections sur des lames chargées positivement jusqu’à ce que la région d’intérêt des échantillons soit atteinte. Vérifiez les sections par fond clair pour confirmer que la région d’intérêt sera la section suivante du moule.
10. Ramenez la diapositive d’imagerie spatiale à cellule unique dans la chambre du cryostat. Retirez la diapositive du support de diapositive et collectez des sections de la zone d’intérêt exacte sur la diapositive d’imagerie spatiale, rangée par rangée, à l’aide d’un pinceau à pointe fine pour empêcher les sections de s’enrouler.
    1. Appuyez sur un coin du médium vide et congelé dans l’étape du couteau avec le dos du pinceau afin que la section reste plate lorsque vous saisissez la lame pour la collecte.
    2. Utilisez le haut de la glissière comme point de pivot, abaissez lentement la glissière sur la section et laissez les sections adhérer à la glissière pendant 3 secondes avant de soulever la glissière de la platine du couteau.
    3. Travaillez de gauche à droite lors de la collecte de sections dans la zone d’imagerie de la lame et superposez des couches de support vide et figé lorsque cela est possible.
    4. Utilisez des bordures en papier coloré comme référence pour placer des sections dans la zone d’imagerie de la lame si le tissu est difficile à voir.
11. Après avoir collecté des sections de la région d’intérêt, replacez la diapositive dans le support de diapositive. S’il n’y a plus d’échantillons à collecter sur la lame d’imagerie spatiale, conservez la lame à -80 °C jusqu’à 2 semaines jusqu’à ce qu’elle soit prête pour l’analyse de l’instrument avec la plateforme d’imagerie spatiale in situ . Si des sections doivent être prélevées à partir de plusieurs moules, remettez la diapositive d’imagerie spatiale dans le bain de glace à 4 °C et répétez les étapes 6.3 à 6.11 avec le moule suivant.
12. Collectez des coupes avant et après les sections de la région d’intérêt de chaque moule sur une lame de microscope standard chargée positivement pour la coloration à l’hématoxyline et à l’éosine (HE) afin de vérifier que l’alignement de l’échantillon et la qualité de la section sont suffisants avant de procéder à l’analyse.

7. Fixation de l’échantillon

1. Retirez les lames de référence du cryostat et faites-les sécher à l’air libre à RT pendant 30 minutes pour faire adhérer les sections à la lame.
2. Fixez les sections en les plaçant dans un récipient à lames avec 4 % de paraformaldéhyde (tableau 1) pendant 20 min.
3. Lavez les sections en les plaçant dans un récipient à lames avec de l’eau distillée pendant 3 min.
4. Poursuivez la coloration HE ou séchez-les et stockez les lames à -80 °C pour une coloration future.

8. Coloration HE des sections

1. Déshydratez et nettoyez les sections en incubant les lames dans de l’éthanol à 100 % pendant 2 min, de l’éthanol à 95 % (tableau 2) pendant 2 min, puis de l’eau du robinet pendant 1 min. Utilisez un support de coloration de lames de microscope pour transférer les lames d’un bain à l’autre.
2. Colorer les noyaux et différencier en incubant les lames dans de l’hématoxyline pendant 2 min 45 s, de l’eau du robinet pendant 1 min, de l’alcool acidifié à 0,3 % (tableau 3) pendant 1 min, puis de l’eau du robinet pendant 1 min. Utilisez un support de coloration de lames de microscope pour transférer les lames d’un bain à l’autre.
3. Colorer les composants cytoplasmiques et déshydrater en incubant les lames dans de l’éosine Y 1 % pendant 45 s, de l’éthanol à 50 % (tableau 4) pendant 1 min, de l’éthanol à 95 % pendant 1 min et de l’éthanol à 100 % pendant 1 min. Utilisez un support de coloration de lames de microscope pour transférer les lames d’un bain à l’autre.
4. Nettoyez les sections en incubant les lames dans du xylène pendant 1 min. Montez et couvrez les lames en appliquant une goutte de support de montage sur le tiers supérieur de la lame à l’aide d’une pipette de transfert et en abaissant lentement une lamelle sur le dessus du support de montage à l’aide d’une pince.

9. Imagerie transcriptomique spatiale et analyse des coupes

1. Retirez les lames d’imagerie du stockage à -80 °C et imagez avec une plate-forme d’imagerie spatiale in situ pour l’analyse transcriptomique spatiale.
   REMARQUE : Les étapes exactes de l’imagerie seront déterminées par la plate-forme d’imagerie spatiale.
2. Examinez les mesures de contrôle de la qualité de la plateforme transcriptomique spatiale. Les paramètres importants à vérifier sont le nombre de cellules détectées, les transcrits médians par cellule, les transcrits nucléaires par 100 μm² et le total des transcrits décodés de haute qualité de chaque gène dans l’ensemble de sondes.
   REMARQUE : Ces paramètres de contrôle de la qualité n’ont pas de seuils universels, et les attentes à l’égard de ces seuils varient en fonction de l’échantillon et du panel de gènes utilisés.
3. Lisez les données de sortie des transcrits d’ARN détectables, déterminez quels transcrits sont de mauvaise qualité en fonction des mesures de contrôle de la qualité de l’expérience et filtrez les transcrits de mauvaise qualité. Analysez les transcriptions de haute qualité restantes par rapport à leur disposition spatiale dans la section.
4. Visualisez la segmentation cellulaire des sections et des cellules de cluster en fonction des intérêts expérimentaux. Comparez les transcrits d’ARN au sein des groupes de cellules de la région d’intérêt à travers des groupes de poissons zèbres d’âges différents sur la même lame.

Résultats

Dans cette méthode (Figure 1), le poisson-zèbre est utilisé comme modèle animal pour sonder les modèles d’expression génique spatialement résolus. La cryosection efficace des larves de poisson-zèbre pour l’imagerie spatiale est un défi. Les coupes doivent être de haute qualité pour conserver la structure tissulaire et les gènes détectables (Figure 4). Les sections contenant plusieurs échantillons pour une image...

Discussion

Ce rapport fournit des solutions détaillées à de nombreux défis techniques associés au poisson-zèbre en tant qu’organisme modèle dans l’analyse transcriptomique spatiale au cours du développement. Pour relever ces défis, notre arrangement compact des échantillons optimise les coûts sur les plateformes transcriptomiques spatiales émergentes¹. La cryosection des larves de poisson-zèbre à des fins d’imagerie spatiale est un défi. Les coupes doive...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
1 L Beaker	Pyrex	1003
200 proof pure ethanol	Koptec	V1001
Acetic acid, glacial	VWR	0714	acidified alcohol
Aluminum foil
Cover slips	Epredia	24X50-1.5-001G
Disposable base mold	Fisher HealthCare	22-363-556
Distilled water
DPX mountant	Sigma-Aldrich	06522	mountant for histology
Dry ice pellets
Dumont #5SF Forceps	Fine Science Tools	11252-00
Eosin-Y Alcoholic	Epredia	71204	Eosin Y 1%
Gill 1 Hematoxylin	Epredia	72411	Hematoxylin
Kimwipe	Kimberly-Clark Professional	34120	absorbent, lint-free wipe
Lab labelling tape	VWR	89097-934
Microtome blade MX35 Ultra	Epredia	3053835
Microtome Cryostat	Thermo Scientific	Microme HM 525
O.C.T. Compound	Fisher HealthCare	23-730-571	freezing medium
Paraformaldehyde	Sigma-Aldrich	158127	PFA
Permanent Marker	VWR	52877-886
Protractor
SafeClear Xylene Substitute	Fisherbrand	68551-16-6	Xylene substitute
Single Edge Blades	American Line	66-0407
Steriomicroscope	Zeiss	4350639000	Stemi 305 w/ double spot LED (4355259020) and Stand K lab (4354259010)
Superfrost Plus Micro Slides	VWR	48311-703
Transfer pipet
Xenium V1 slide	10X/Xenium	3000941	spatial transcriptomic imaging slide